植物における一過的タンパク質大量発現系「つくばシステム」について
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(2) 78. 植物の生長調節 Vol. 54, No. 1, 2019. 表 1 植物細胞におけるタンパク質発現システムの比較 タンパク質発現システム. 収量及びピーク. 由来. 感染方法. つくばシステム. ∼4 mg/gFW （感染後 3 日）. ジェミニウイルス由来複製システム とダブルターミネーターの組合せ. アグロインフィル トレーション法. magnICON システム. ∼4 mg/gFW （感染後 4∼5 日）. トバモウイルス由来複製システム. アグロインフィル トレーション法. Profica システム. 1.6 mg/gFW （感染後 5 日）. ササゲモザイクウイルス由来 複製システム. アグロインフィル トレーション法. Geneware システム. 0.8 mg/gFW （感染後 6 日） Aprotinin 発現量. トバモウイルス. 植物ウイルス. 形質転換植物. 0.1∼0.5 mg/gFW. 形質転換体. 遺伝子組換え. 用いた場合，適切に処置しておかないと蔓延して大規模な. はアグロバクテリウムによる IV 型分泌装置により LB-RB. 除去作業が必要になるのに対して，アグロバクテリウムを. 間 の T-strand を 植 物 細 胞 核 内 に 送 達 す る．RB（right. 取り扱うのに必要な適切な処置を行えばよいという特徴を. border） と LB（left border） は 25 塩 基 の 配 列 か ら な り，. もつ．一方で，毎回アグロインフィルトレーションの作業. RB を 始 点，LB を 終 点 と し て 送 達 さ れ る．deconstructed. が必要となるという欠点をもつ．例えば，形質転換植物の. vector では，この LB-RB 間に，植物ウイルス由来の DNA. 場合，一度作製してしまえば，播種して植物体を回収すれ. 複製システムが植物細胞核内で働くように設計してある．. ば良い．植物ウイルスを用いた場合でも，一度感染させて. ジェミニウイルス由来の複製システムでは，5′ 側の LIR. しまえば， ウイルス自身が自律的に葉に感染してゆくため，. （long intergenic region）と 3′ 側の LIR を認識することで，. 毎回，感染する必要はない．. 一本鎖環状化 DNA が形成される．この環状化 DNA を鋳. こうした欠点にも関わらず，アグロインフィルトレー. 型として，複製酵素により増幅されるローリングサークル. ション法を用いた一過的なタンパク質発現システムが用い. 型複製が行われる．このローリングサークル型複製により. られているのは，その発現量によるものである．表 1 に示. プロモーター-目的遺伝子-ターミネーターを大量に複製さ. すように，アグロインフィルトレーション法を用いた一過. せることで，タンパク質を大量に発現できる（Lozano-Duran. 的発現システムは植物ウイルスを用いた方法や形質転換植. 2016）．但し，この方法により宿主としてベンサミアナタ. 物を用いた方法に比べると，新鮮重（gFW）あたりの発現. バ コ を 用 い た 場 合 で も 1∼2 mg/gFW の 収 量 で あ り，. 量が高い．deconstructed vector の中でも，magnICON シス. magnICON システムに比較しても大量発現ができないベク. テム（Marillonnet et al. 2005）は，その発現量から広く用. ターであった．そこで，このシステムの有効化を目指して，. いられており，2014 年にニュース等で広く報道されたエ. 熱ショックタンパク質ターミネーターおよびエクステンシ. ボラ出血熱患者へ投与された未承認抗体医薬品 ZMapp も. ンターミネーターを連結させたダブルターミネーターとす. この magnICON システムを用いて作製されたものである. ることで，約 4 mg/gFW というタンパク質大量発現を可能. （Olinger et al. 2012 ; Qiu et al. 2014） ．この度，筆者らは，. とした（図 1, Yamamoto et al. 2018）．ターミネーターにつ. この magnICON システムを凌ぐ新たなタンパク質発現シ. いては熱ショックタンパク質ターミネーター 2 つを連結さ. ステムを確立し， 「つくばシステム」と名付けた．. せた場合や，エクステンシンターミネーター 2 つを連結さ. つくばシステムにより植物において大量のタンパク質. せた場合でも同様のタンパク質発現量を示したことから，. を発現させることが可能に. ダブルターミネーターであることが大事だと考えられる．. 植物におけるタンパク質の発現において，トバモウイル. このことは，ダブルターミネーターによってリードスルー. ス，ササゲモザイクウイルス，ポテトウイルス X，ジェミ. が大幅に減少し，リードスルーによって引き起こされる. ニウイルスをベースにした deconstructed vector が開発され. RNA 干渉を極力抑制したためだと考えられる．また，こ. てきた（Salazar-Gonzalez et al. 2015）が，magnICON シス. のつくばシステムの特徴は，約 4 mg/gFW の発現量のピー. テムを凌ぐ発現システムは報告がされていなかった（Gleba. クが 24°C で培養した場合，アグロインフィルトレーショ. et al. 2014） ．筆者らは，汎用性を考慮して，広い範囲の宿. ン後，3 日目で達成される点である．magnICON システム. 主植物に感染することが可能であるジェミニウイルスをも. の場合， 3 日目ではまだ発現量のピークに達しておらず（図. とにした複製システムを有する deconstructed vector を用い. 2, Yamamoto et al. 2018） ，5 日目にピークを迎え，約 4 mg/. て研究を行ってきた．アグロインフィルトレーション法で. gFW の発現量に達する．このことから，つくばシステム.
(3) 植物の生長調節 Vol. 54, No. 1, 2019. 79. 図 3 つくばシステムは様々な植物へ適用可能 ナス科（ベンサミアナタバコ，ナス，トマト，トウガラシ）， ウリ科（メロン） ，キク科（レタス） ，コチョウランへの適 用が確認された．写真の左がつくばシステムを適用，右は 改良前（Yamamoto et al. 2018 より改変転載） ．. 図 1 つくばシステム（ダブルターミネーター導入）と改 良前（ジェミニウイルス由来の複製システムのみ）の比較 （上）レタスあるいはベンサミアナタバコから抽出した 1 mgFW 相当の粗タンパク質を電気泳動し，CBB 染色した ゲル画像．矢尻で示す部分が GFP である．（下）ゲル画像 をもとに発現量を定量した．NT は非導入体．. 図 4 （ 上 ） ト マ ト で つ く ば シ ス テ ム は 有 効 で あ る が， magnICON システムによる発現が認められなかった． （下） ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 内 に GABA ト ラ ン ス ア ミ ナ ー ゼ （gabT）を発現させると， 発現効率が上昇した． （Hoshikawa et al. 2018 より改変転載） ．. 図 2 つくばシステムと magnICON システムの比較 アグロインフィルトレーション後，24℃，3 日間培養した 際の GFP 発現量（Yamamoto et al. 2018 より改変転載） ．. は短期間に大量にタンパク質を発現できるという点で. 図 5 つくばシステムを用いた局在性確認．膜タンパク質 に GFP を融合させたタンパク質をベンサミアナタバコに て発現させた．. magnICON システムよりも優位性を示す． 約 4 mg/gFW という発現量は大腸菌などの異種タンパク. システムの場合，GFPuv の最大収量は 6.9 mg/g 幼虫と報. 質発現システムと匹敵するといっても過言ではない．植物. 告されている（Cha et al. 1997） ．ブレビバチルスにおいて. 体なので，gFW を用いているが，バキュロウイルス発現. は，ヒト上皮成長因子の最大収量が 1.5 mg/mL である（Ya-.
(4) 80. 植物の生長調節 Vol. 54, No. 1, 2019. magata et al. 1989）ことを考慮すると，異種タンパク質発 現システムとして遜色ないシステムである．. おわりに 以上のように，つくばシステムは，植物細胞におけ. つくばシステムにより様々な植物において一過的なタ. るタンパク質発現のスタンダードとして用いられている. ンパク質発現が可能に. magnICON システムよりも，ベンサミアナタバコを用いた. 前項において，つくばシステムがベンサミアナタバコに. 場合のタンパク質発現量の点および様々な植物へ適応可能. おいて magnICON システムよりも短期間で大量のタンパ. である点から，優位であることが示された．今後はどのよ. ク質を発現できる優位性について紹介したが，このシステ. うなタンパク質がつくばシステムによって生産可能である. ムには更なる特徴をもつ．つくばシステムがジェミニウイ. かの事例を構築する必要がある．例えば，大腸菌などでの. ルス由来の複製システムを用いていることから，宿主とす. 発現が困難なタンパク質は発現システムを変えることで発. る植物種は多種多様にわたると考えられる．実際，図 1 で. 現が可能になる場合もあるため，新たなタンパク質発現シ. 示すようにキク科のレタスにおいてもタンパク質の発現が. ステムとして，用いることが可能である．. 検出された．そのほか，ナス科（トマト，ナス，トウガラ. また，植物細胞を用いる利点として，植物由来のタンパ. シ） ，ウリ科（メロン） ，マメ科（ミヤコグサ，ダイズ，イ. ク質の局在性を調べることが可能である．特に，発現量が. ンゲンマメ） ， コ チ ョ ウ ラ ン へ 適 応 可 能 で あ る（ 図 3,. 少なくて検出し難いタンパク質には効果的である．筆者ら. Yamamoto et al. 2018 ; Suzaki et al. 2019） ．但し，いずれの. も，検出が難しい膜タンパク質を本システムにより発現さ. 植物においてもベンサミアナタバコと比べると，その発現. せることで検出が可能となった（図 5）．この方法では，. 量は 1/6 以下である．これは，ベンサミアナタバコがウイ. 形質転換植物を作製する必要がないため，遺伝子を単離し. ルス感染に対して感受性が高いため，アグロバクテリウム. た植物において局在性を短期間で調べることができる，つ. による感染が容易であることが原因と考えられる．ベンサ. まり，トマトの遺伝子なのでトマトでの局在性を調べる，. ミアナタバコはオーストラリアの砂漠が原産地であり，非. といったことが可能である．. 常に乾燥して病原菌がほとんど存在しない場所であること から，免疫システムを喪失させ，エネルギーの大半を成長，. 謝辞 本システムの開発は，JSPS 科研費および筑波大学. 生殖に集中させたためだと考えられている（Bally et al.. 遺伝子実験センター全国共同利用・共同研究拠点「形質転. 2015）．. 換植物デザイン研究拠点」の支援のもと実施された．. 発現量の差こそあれ，つくばシステムは様々な植物へ適 応できる一方で，magnICON システムはトバモウイルス由 来の複製システムを用いていることから，タバコ属以外で はタンパク質の発現が困難である．実際に，magnICON シ ステムをレタスやトマトに適用させたが，全く，タンパク 質の発現が認められなかった（図 4, Lai et al. 2012 ; Hoshikawa et al. 2018） ．つくばシステムをトマト果実に適用 する場合，アグロバクテリウムに GABA トランスアミナー ゼ（gabT）を一緒に発現させた方が発現量の上昇が認め られた（図 4, Hoshikawa et al. 2018） ．GABA は γ-アミノ酪 酸のことであるが，アグロバクテリウムと植物の相互作用 に負に働くことが分かっており，gabT をアグロバクテリ ウムにて発現させた場合，形質転換効率が上昇することが 分かっている（Nonaka et al. 2017） ．トマト果実では緑色 の発達段階では非常に多くの GABA を蓄積しており，赤 色で熟していくにつれて，GABA 含量が減少することが 分 か っ て い る（Akihiro et al. 2008） ．つくばシステムと gabT を組み合わせた方がトマト果実において発現量の上 昇がみられるのは，トマト果実内の GABA によるアグロ バクテリウム感染抑制を緩和したためと考えられる．ちな みに，ベンサミアナタバコにおいては gabT を組み合わせ ても，その発現量にほとんど変化がなかった（Hoshikawa et al. 2018）．. 文 献 Akihiro, T, Koike, S, Tani, R, Tominaga, T, Watanabe, S, Iijima, Y, Aoki, K, Shibata, D, Ashihara, H, Matsukura, C, Akama, K, Fujimura, T and Ezura, H（2008） Biochemical mechanism on GABA accumulation during fruit development in tomato. Plant Cell Physiol 49 : 13781389. Bally, J, Nakasugi, K, Jia, F, Jung, H, Ho, SYW, Wong, M, Paul, CM, Naim, F, Wood, CC, Crowhurst, RN, Hellens, RP, Dale, JL and Waterhouse, PM（2015） The extremophile Nicotiana benthamiana has traded viral defence for early vigour. Nat Plants 1 : 15165. Cha, HJ, Pham, MQ, Rao, G and Bentley, WE（1997） Expression of green fluorescent protein in insect larvae and its application for heterologous protein production. Biotechnol Bioeng 56 : 239-247. Gleba, YY, Klimyuk, V and Marillonnet, S（2007） Viral vectors for the expression of proteins in plants. Curr Opin Biotechnol 18 : 134-141. Gleba, YY, Tuse, D and Giritch, A（2014） Plant viral vectors for delivery by Agrobacterium. Curr Top Micorbiol Immunol 375 : 155-192. Hoshikawa, K, Fujita, S, Renhu, N, Ezura, K, Yamamoto, T, Nonaka, S, Ezura, H and Miura, K（2018） Efficient transient protein expression in tomato cultivars and wild species using agroinfiltration-mediated high expression system. Plant Cell Rep 38 : 75-84. Lai, H, He, J, Engle, M, Diamond, MS and Chen, Q（2012） Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce. Plant Biotechnol J 10 : 95-104. Lozano-Duran, R（2016） Geminiviruses for biotechnology : the art of.
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