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Polymerase
chain
eactionに
よ る エ ン テ ロ ト キ シ ン 産 生 性
Clostridium
perfringensの
同 定
岐 阜 大 学 医学 部 附 属 嫌気 性 菌 実験 施 設1)
Department of Clinical Pathology, Wonkwang Public Health Junior Collge, Korea 2) Department of Clinical Pathology, Yonsei University College of Medicine, Korea 3)
加 藤 直 樹1)Kim Shin-Moo2)
加 藤 は る1)田 中 香 お 里1)渡 辺 邦 友1)
上 野 一 恵1)Chong Yongsop3)
(平成5年3月19日 受 付)
(平成5年5月7日 受 理)
Key words:
Clostridium perfringens, enterotoxin, PCR
要 旨
エ ン テ ロ トキ シ ン産 生 性Clostridium perfringensの 同 定 を エ ン テ ロ トキ シ ン を コ ー ド して い る 遺 伝 子 の 一 部 をpolymerase chain reaction(PCR)を 用 い て 増 幅 す る こ と に よ り行 っ た.当 施 設 保 有 の Clostri4iumpe吻ingens参 考 菌 株5株 を 用 い たPCRで は,エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性 の4株 は す べ て PCR陽 性 で,エ ン テ ロ トキ シ ソ陰 性 の1株 はPCR陰 性 で あ っ た.Cperfringens以 外 のClostri4ium属 参 考 菌 株16菌 株,17株 で はPCRは す べ て 陰 性 で あ っ た.日 本,韓 国 お よ び タ イ で 分 離 さ れ たCPerfrin-gens85株 に お い て は エ ン テ ロ トキ シ ン陽 性 の3株 は す べ てPCR陽 性 で,エ ン テ ロ トキ シ ン 陰 性 の82株 は す べ てPCR陰 性 で あ った .Cperfringensエ ン テ ロ トキ シ ンgeneのinitiationcodonを は さ む 領 域 のPCRに よ り,同 様 の 実 験 を 行 った と こ ろ,PCRの 結 果 とエ ン テ ロ トキ シ ン産 生 性 の結 果 は ま った く 一 致 し た .以 上 の成 績 よ り,PCRは 芽 胞 を 形 成 させ エ ン テ ロ トキ シ ン を 産 生 させ る た め の 特 殊 な培 養 を 行 うこ と な く,迅 速 ・簡 便 に エ ン テ ロ トキ シ ン産 生 性C.Perfringensを 同 定 で き る方 法 で あ る と 思 わ れ た. 序 文 Clostridium perfringensは α 毒 素 を は じ め と し て 種 々 の 毒 素 を 産 生 す る が,そ の 内,エ ン テ ロ トキ シ ン は 食 中 毒 の 原 因 因 子 と し て 知 ら れ て い る1). CPerfringensの エ ン テ ロ トキ シ ン は 細 胞 培 養 試 験,ウ サ ギ や マ ウ ス を 用 い た 腸 管 結 紮 試 験,マ ウ ス 致 死 性 試 験 な ど の 生 物 学 的 検 査 法 の 他 に,逆 受 け 身 ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 やenzyme-linkedim-munosorbent assay法 な ど の 免 疫 学 的 検 査 法 に よ り行 わ れ る2).C.Perfringensの エ ン テ ロ トキ シ ン は 芽 胞 形 成 時 に 産 生 さ れ る と 考 え ら れ て お り3),そ の た め,エ ソ テ ロ トキ シ ン 産 生 性 の 検 討 に は 加 熱 処 理 に よ り耐 熱 芽 胞 の 選 択 を し た 後,芽 胞 形 成 に 優 れ た 培 地 で 菌 を 培 養 す る こ と が 一 般 的 に 行 わ れ て い る2).し か し,一 般 に 本 菌 の 芽 胞 形 成 性 は 悪 い た め,特 殊 な 培 地 を 用 い て も エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 能 を 持 っ て い る 菌 株 が う ま く エ ン テ ロ ト キ シ ン を 産 生 し な い こ とが あ り,エ ン テ ロ トキ シ ン の 検 出 は 必 ず し も 容 易 で は な い. 一 方,C.perfringensの エ ソ テ ロ ト キ シ ソ を 別 刷 請 求 先:(〒500)岐 阜 市 司 町40 岐 阜 大 学 医学 部 附 属嫌 気 性 菌 実験 施 設 加 藤 直樹 感 染 症学 雑 誌 第67巻 第8号
コ ー ド し て い る 遺 伝 子 の 塩 基 配 列 はvan Damme-Jongstenら4)お よ びlwanejkoら5)に よ
り 明 ら か に な っ て い る.こ れ ら の こ と か ら,著 者 ら は 特 殊 な 培 養 を 行 う こ と な く エ ン テ ロ ト キ シ ソ 産 生 株 を 検 出.同 定 す る 方 法 と し て,エ ン テ ロ ト キ シ ン 遺 伝 子 の 一 部 をpolymerase chain reac-tion(PCR)に よ り増 幅 し,検 出 す る こ と を 試 み た. 材 料 と 方 法 1.菌 株 参 考 菌 株 と し て エ ソ テ ロ ト キ シ ン 産 生 性C perfringensNCTC8798株 と エ ソ テ ロ ト キ シ ン 非 産 生 性 のATCC13124株 の 他 に 当 施 設 保 有 の エ ソ テ ロ ト キ シ ン 産 生 性CPerfringensGAI 10424,GAI10425,GAI10426の3株 を 用 い た. ま た,他 のClostridium属 と し てClostridium bei-jerinchii GAI 91172, Clostridium bifermentans
NCTC 6800,Clostridium botulinum type A NCTC 7272,Clostridium butyricum GAI 91173, Clostridium clostridiifbrme ACTT25537,毒 素 産 生 性Clostridium difficile GAI 10029,Clos-tridium innocuum ATCC 14501, Clostridium novyi type ATCC 19402,Clostridium paraputrificum ATCC 25780, Clostridium putrificum ATCC 25784,Clostridium ramosum ATCC 25582,Clostridium septicum ATCC 12464,Clostridium Sporogenes ATCC19404, Clostridium sordellii NCTC 6929,Clostridium sordellii NCTC6780,Clostridium tetani GAI
T-307,Clostridium tertium ATCC19405の16菌 種, 17菌 株 も 検 討 に 用 い た. 臨 床 分 離 株 に 関 し て は 日 本,韓 国,タ イ で 血 液, 膿,胆 汁 な ど の 各 種 臨 床 材 料 か ら分 離 さ れ た85株 を 用 い た. 2.PCR法 Primerと そ の 組 み 合 わ せ に よ り 産 生 さ れ る PCR産 物 の サ イ ズ はTable1に 示 し た.GAP11 とGAP12は エ ン テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 の3'endに 近 い 領 域 を,GAP1とGAP2は エ ン テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 の5'末 端,initiation codon,Shine-Dalgarno consensusを 含 む 領 域 を 増 幅 さ せ る も の で あ る.PCRの 方 法 は 先 の 報 告6)の ご と く, 55℃,20秒,95℃,2分 を1サ イ ク ル と し て35サ イ ク ル 行 っ た.PCR産 物 の 検 出 は5%ポ リア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 の 後,ethidium bromide染 色 に よ り行 っ た7). 3.Southern hybridization プ ロ ッ テ ィ ン グ の 方 法 は 先 の 報 告 に 従 っ た7). す な わ ち,PCR産 物 は5%ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル で 電 気 泳 動 し,ア ル カ リ変 性 さ せ,Trisbuffer で 中 和 後Hybond.Nmembrane(Amersham)に プ ロ ッ ト し,probe(Table1)と42℃ で1時 間 hybridizationさ せ た.Probeはterminaltrans-feraseを 用 い てdigoxigenin(ベ ー リ ソ ガ ー)で3' endを 標 識 し た も の を 用 い た8).ハ イ ブ リ ダ イ ズ し たprobeの 検 出 はantidigoxigenin抗 体 と ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ を 用 い
たDigoxigenindetec-Table 1 Oligonucleotide
primers and probes for detection of the C. perfringens
enterotoxin gene
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加藤 直樹 他
Fig. 1 PCR amplification of the C. perfringens enterotoxin gene segments. Panel
A, PCR using primer set of GAP 11-GAP-12. Panel B, PCR using primer set of
GAP 1-GAP 2. Lane 1, DNA standard ; lane 2, ATCC 13124 ; lane 3, NCTC 8798;
lane 4, GAI 10424; lane 5, GAI 10425; lane 6, GAI 10426. All strains except
ATCC 13124 are enterotoxin
positive.
A
B
tion kit(ベ ー リ ン ガ ー)とchemiluminescenceを
組 み 合 わ せ た 方 法 で 行 い9),シ グ ナ ル はX線 フ ィ ル ムX-Omat K film(コ ダ ッ ク)を 用 い て 検 出 し た.た だ し,chemiluminescence試 薬 と し て は ス マ イ ラ イ ト(住 友 金 属)を 用 い た .
4. C.perfringensエ ン テ ロ トキ シ γ の 検 出 菌 はcooked meat medium (Difco)で37℃,
約7日 間 嫌 気 培 養 の 後,そ の0.5m1を5mlの
thioglycollate medium (BBL)に 接 種 し,ふ た た び 一 夜 培 養 した.そ の 後75℃ で20分 間 加 熱 し,そ の1mlを10mlのmodified Duncan-Strong Spor-ulation培 地10)に 移 し,37℃ で 嫌 気 的 に1日 培 養 し た.つ い で,遠 沈 操 作 に よ り培 養 上 清 を 採 取 し, そ れ を 濾 過 滅 菌 し た 後,毒 素 検 出 に 供 し た.毒 素 の 検 出 は 逆 受 身 ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応 キ ッ ト11) (PET-RPLA,デ ン カ 生 研)と マ イ ク ロ プ レ ー トを 用 い て 行 っ た. 成 績 当 施 設 保 有 の エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性C.per-fringens菌 株 と エ ン テ ロ トキ シ ン 非 産 生 株 の1 菌 株 に お け るPCR産 物 の 電 気 泳 動 像 をFig.1に 示 し た.GAP 11-GAP 12お よ びGAP 1-GAP 2の
2組 のprimerに よ り そ れ ぞ れ 期 待 さ れ た235 bp と154 bpの バ ン ドが エ ン テ ロ トキ シ ソ 産 生 株 に お い て の み 検 出 さ れ た .
こ れ ら の 株 のPCR産 物 とprobeを ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン し た 結 果,primer GAP 11-GAP 12 に お い て はethidium brolnide染 色 の 結 果 と 一 致 し,エ ソ テ ロ トキ シ ン 非 産 生 株 で は シ グ ナ ル が 認
Fig. 2 Southern blot analysis of PCR products by
GAP 11-GAP 12 primers (panel A) and GAP
1-GAP 2 primers (panel B). Lane 1, C. perfringens
ATCC 13124; lane 2, C. perfringens NCTC 8798;
lane 3, C. perfringens
GAI 10424; lane 4, C.
perfringens GAI 10425; lane 5, C. perfringens GAI
10426.
A B
Table 2 Comparison of latex test (PET-RPLA)
for C. perfringens enterotoxin with PCR assay for
the C. perfringens enterotoxin
gene in clinical
isolates
め ら れ な か っ た(Fig.2).ま た,primer GAP 1-GAP 2に お い て は 梯 状 の シ グ ナ ル が 見 ら れ た が,や は りethidium bromide染 色 と 同 じ 位 置 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ,エ ン テ ロ トキ シ ン非 産 生 株 で は シ グ ナ ル は ま っ た く検 出 さ れ な か っ た . 臨 床 分 離 株85株 に お け る エ ソ テ ロ トキ シ ン 産 生 感 染 症学 雑 誌 第67巻 第8号
性 とPCRの 結 果 はTable2に 示 し た.い ず れ の primerペ ア ー に お い て も エ ン テ ロ トキ シ ン 陽 性 の3株 の み がPCR陽 性 と な り,エ ン テ ロ トキ シ ン 陰 性 の82株 は す べ てPCR陰 性 で あ っ た. エ ソ テ ロ トキ シ ン 陽 性 で あ っ た3株 の うち2株 は 韓 国 で 分 離 さ れ た 株 で,と も に 胆 汁 か ら の 分 離 株 で あ っ た.残 りの1株 は タ イ で 分 離 さ れ た 株 で, 血 液 か ら の 分 離 株 で あ っ た.検 討 株 数 の 多 か っ た 韓 国 由 来 株 で は67症 例 か ら 分 離 さ れ た67株 中2株 が エ ン テ ロ トキ シ ン 陽 性 で,陽 性 率 は3%で あ っ た. 考 案 C.Perfringensと 食 中 毒 の 関 係 は19世 紀 末 に す で に 指 摘 さ れ て お り,そ のoutbreakは1943年 に12),耐 熱 性C.Perfringensと 食 中 毒 の 関 係 は 1953年 に 報 告 さ れ て い る13).し か し,C.perfrin-gensに よ る 食 中 毒 の 本 体 は 一 部 のC.perfrin-gens株 が 産 生 す る エ ン テ ロ トキ シ ン で あ る こ と が 証 明 さ れ た の は1971年 に な っ て か ら で あ る14)15). C.perfringensの エ ン テ ロ トキ シ ン は 一 般 に 芽 胞 形 成 時 産 生 さ れ,ま た 芽 胞 コ ー トの 構 成 成 分 の 一 部 と 考 え ら れ て い る が16),最 近,エ ソ テ ロ トキ シ ン 産 生 は 芽 胞 形 成 と は 無 関 係 で あ る と の 報 告 も見 ら れ て い る17).一 方,培 地 や 芽 胞 処 理 方 法 に よ り芽 胞 形 成 率 ひ い て は エ ン テ ロ トキ シ ン産 生 量 が 異 な る た め,C.Perfringens芽 胞 形 成 培 地 と し て Duncan-Strong培 地18),変 法Duncan-Strong培 地10),変 法AEA培 地10),G.K.培 地19),Tortora培 地20),PBT培 地21),PBTS培 地21)な ど 種 々 な 培 地 が 考 案 さ れ て お り,ま た い ろ い ろ な 温 度 に よ る 芽 胞 選 択 が 試 み ら れ て い る22).こ の よ う に,C.per-fringensの エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性 の 確 認 は 検 査 上 大 き な 問 題 を 抱 え て お り,時 に は 分 離 菌 を ウ サ ギ の 腸 管 結 紮 ル ー プ に 直 接 接 種 し,腸 管 内 で 増 殖 さ せ る こ と に よ りエ ソ テ ロ トキ シ ン 産 生 性 を 最 終 的 に 確 認 す る 方 法 も と ら れ て い る23). こ れ に 対 し,PCR法 はC.perfringensの エ ン テ ロ トキ シ ソ を コ ー ドし て い る 遺 伝 子 の 一 部 を 増 幅 し,検 出 す る も の で,芽 胞 形 成 培 地 に よ る 培 養 や 芽 胞 処 理 は 必 要 と し な い.さ ら に,我 々 の 用 い た 方 法 で は 平 板 上 の コ ロ ニ ー か ら のDNA採 取 か ら,電 気 泳 動 に よ りPCRの 結 果 を 得 る ま で は 約 5時 間 で 済 み,従 来 の 毒 素 検 出 に 比 べ る と極 め て 短 時 間 で 毒 素 産 生 能 を 知 る こ と が で き,ま た,電 気 泳 動 後 の 判 定 は 極 め て 容 易 で あ る. 今 回 行 っ た 実 験 結 果 で は い ず れ のprimerを 用 い て も エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性 と エ ン テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 の 存 在 が 完 全 に 一 致 す る 結 果 で あ っ た. ま た,他 のClostridium spp.に お い て はPCR陽 性 の 結 果 は 得 ら れ な か っ た.今 回 検 討 し た 菌 株 の う ち,エ ン テ ロ トキ シ ン 陽 性 の 株 は 合 計7株 で あ る た め,outbreak株 や エ ン テ ロ トキ シ ン を 検 出 し に く い 株 を さ ら に 詳 細 に 検 討 す る 必 要 が あ る が, Van Damme-Jongstenら24)はC.perfringensエ ン テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 の 種 々 な 部 位 か ら 選 ん だ4 種 類 のDNA probeを 用 い た 検 討 で エ ン テ ロ トキ シ ン 陽 性145株 は す べ て のDNA probeと 反 応 し, エ ン テ ロ ト キ シ ン 陰 性104株 は す べ て い ず れ の DNA probeと も 反 応 し な か っ た と 報 告 し て い る.我 々 の 成 績 と合 わ せ て,こ の こ と はC.Perfrin-gensの エ ン テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 全 体 は き わ め て 保 存 性 が 高 く,ま た,エ ン テ ロ トキ シ ン 陰 性 株 は エ ソ テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 の 一 部 の 欠 損 や 変 異 で エ ン テ ロ トキ シ ン 陰 性 に な っ て い る の で は な くエ ン テ ロ トキ シ ン 遺 伝 子 全 体 を 持 た な い た め エ ン テ ロ ト キ シ ン を 産 生 し な い こ と を 示 唆 す る も の で あ る.し た が っ て,PCRを 用 い た エ ン テ ロ ト キ シ ン 遺 伝 子 の 検 出 に よ る エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性 の 検 討 は 理 に 適 っ た 検 査 法 で あ る と 思 わ れ る. ま た,PCRの 手 軽 さ か ら,散 発 下 痢 症 に お け る エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性C.perfringensの 関 与 の 検 討 や 種 々 の 材 料 を 対 象 と し た 本 菌 の 分 布 解 析 も 容 易 に な る も の と 思 わ れ る. 以 上,PCR法 はC.perfringensの エ ン テ ロ トキ シ ン 産 生 性 を 検 討 す る の に 従 来 の 特 殊 な 培 地 や 芽 胞 処 理 を 必 要 と し な い 迅 速 ・簡 便 な 検 査 方 法 で あ る こ と が 強 く示 唆 さ れ た.
文
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