製品コード
3720
説 明 書
IFN Response Watcher
(for RNAi experiment)
哺乳動物細胞などでは、長い二本鎖 RNA（dsRNA）がインターフェロン応答を誘導し、図 1 に示す二つ の経路が活性化されることで非特異的な転写の抑制が起こることが知られていました。RNAi 実験に用 いられる siRNA（short interfering RNA）は短い dsRNA を使用することにより、インターフェロン応答を 回避し、特異的な遺伝子発現抑制（ノックダウン）を可能にしています。
しかしながら、2003 年に Sledz ら1）、Bridge ら2）が相次いで siRNA や shRNA（short hairpin RNA）が
インターフェロン応答を誘導する可能性を報告しました。今後、実験によっては、siRNA や shRNA 導入 で起こった遺伝子抑制インターフェロン応答によるものではないことの確認が必要となるかもしれません。 PKR dsRNA 2-5AS 2-5A RNase L elF2 α 翻訳阻害 mRNA 分解 アポト−シス リン酸化 活性化 合成 活性化 活性化 図 1． 長い dsRNA の導入により、インターフェロン応答として知られる二つの経路が活性化される。 PKR の活性化は翻訳因子をリン酸化することによって翻訳を阻害し、また 2-5AS により RNase L が mRNA を非特異的に分解する。
I．製品説明
本製品は、リアルタイム RT-PCR によって、インターフェロン応答を検出するためのプ ライマーセットです。インターフェロン応答で up-regulate すると言われている human STAT1 遺伝子と human OAS1 遺伝子、および補正用の β-actin 遺伝子を検出するための プライマーが含まれています。また、コントロール実験用に、インターフェロン応答を誘 導するために誘導剤として polyIC も含まれています。（注意）
本製品の使用には、別途、siRNA 導入試薬（TransIT-TKO® 等）、RNA 抽出用試薬、逆転写 反応用試薬（PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）等）、リアルタイム PCR 装置 （Thermal Cycler Dice Real Time System II 等）などが必要です。
なお、本製品の各プライマーは、SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420A）に最適化されていますので、リアルタイム PCR にはこのキットを使用してくだ
II．内容（100 反応分）
1． human stat1 Primer Mix（各 10 μM） 50 μl 2． human oas1 Primer Mix（各 10 μM） 50 μl 3． human β-actin Primer Mix（各 10 μM） 50 μl 4． polyIC（42 ng/μl） 100 μl
III．保存
− 20℃ ※適切に保存し、受取り後 2 年を目途にご使用ください。IV．プロトコール
24 well-plate を使用する場合のプロトコールを示します。異なるプレートを用いる場合は、 サイズに応じてスケールアップまたはスケールダウンしてください。ここでは siRNA 導入 試薬としてTransIT-TKO®（製品コード MIR2154）を、逆転写反応用試薬として PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)（製品コード RR037A）を、リアルタイム PCR 装置とし て Thermal Cycler Dice Real Time System II を使用しましたが、これら以外の試薬、機器 を使用しても実験を行うことは可能です。詳しくはそれぞれの製品の取扱説明書をご参照 ください。なお、リアルタイム PCR 用試薬には SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製 品コード RR420A）を使用してください。 A．細胞の準備 本実験には 293 細胞や HeLa 細胞など、さまざまなヒト由来細胞が利用できます。 1） siRNA 導入の 24 時間前に、細胞をプレートに播く。多くの細胞では siRNA 導入時の 細胞密度が 60 ～ 80％のとき導入効率が最大となるが、細胞ごとに条件を検討するこ とで最高の結果が得られる。 2） 一晩培養する。 3） 培地を取り除き、250 μl の抗生物質を含まない培地に交換する。 B．siRNA の導入 1） 滅菌チューブに 50 μl の無血清培地と 2 μl のTransIT-TKO® を加え、ボルテックスで よく混和する。無血清培地は Opti-MEM I、RPMI 1640（Gibco BRL）が適している。多 くの細胞ではTrans IT-TKO® は 2 μl が適当であるが、細胞ごとに 1 ～ 4 μl の間で条 件を検討することで最高の結果が得られる。 2） 室温で 5 ～ 20 分静置する。 3） 1 μl の 3 μM siRNA ストックあるいは 1 μl の polyIC を加え、ピペッティングで穏や かに混合する。 4） 室温で 5 ～ 20 分静置する。 5） TransIT-TKO®/siRNA 混合溶液を細胞に滴下する。 6） 48 時間培養を行う。 C．total RNA の調製 RT-PCR 法に用いる RNA サンプルは、通常少量の RNA があればよい場合が多いので簡便 な精製法が用いられることもありますが、できれば GTC 法（グアニジンチオシアネート法） 等で高純度に精製した RNA を用いることをお勧めします。培養細胞や組織サンプルからの高純度 total RNA の調製には、スピンカラムタイプの Nu-cleoSpin® RNA II（製品コード 740955.10/.50/.250）や AGPC 法の簡便化試薬である RNAiso Plus（製品コード 9108/9109）が便利です。RNA サンプルは、最終的に滅菌蒸留水または TE Buffer 溶液となるように調製してください。
D．検出（リアルタイム RT-PCR）
PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) および SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) を用いてリアルタイム RT-PCR によりサンプル間のSTAT1 および OAS1 の mRNA 量を比較します。このときβ-actin の mRNA 量で補正します。詳しい方法については PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) および SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) のプロトコールを参照してください。 D-1．RNA サンプルの希釈 吸光度から濃度を概算し、10 ng/μl になるように希釈します。また、検量線を作成 するためにひとつのサンプル（polyIC 導入サンプルが適当）については、100 ng/μl、 10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl の系列希釈を作製してください。 D-2．逆転写反応 1．下記に示す PCR 反応液を氷上で調製する。 RNA サンプル以外のコンポーネントを必要本数＋α 調製し、マイクロチューブに 分注後、RNA サンプルを添加すると良い。 ＜ 1 反応あたり＞ 試薬 使用量 最終濃度（または添加量） 5 × PrimeScript Buffer＊ 1 2 μl 1 ×
Random 6 mers（100 μM）＊ 1 0.5 μl 50 pmol
PrimeScript RT Enzyme Mix I＊ 1 0.5 μl
total RNA
RNase Free dH2O＊ 1
Total 10 μl＊ 2
＊ 1： PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) に含まれています。
＊ 2： 逆転写反応は、必要に応じてスケールアップすることも可能です。10 μl の 反応液で逆転写できるのは、およそ 500 ng までの total RNA です。 2．逆転写を行う。 37℃、15 分 （逆転写反応） 85℃、5 秒 （逆転写酵素を熱失活させる） 4℃ D-3．リアルタイム PCR 反応 1．下記に示す PCR 反応液を氷上で調製する。 ＜ 1 反応あたり＞ 試薬 使用量 最終濃度 （または添加量） SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（2 ×） 12.5 μl 1 × Primer Mix（stat1 or osa1 or β-actin） 0.5 μl 0.2 μM template（cDNA 溶液） 2 μl
dH2O 10 μl
2．反応を開始する。
Thermal Cycler Dice Real Time System にセットし、反応を開始する。 Stage 1：初期変性 Hold
95℃ 30 秒 Stage 2：PCR 反応 Repeat：40 times
95℃ 5 秒 60℃ 30 秒 Stage 3：Melt Curve
3．反応終了後、解析を行う。
それぞれの値はβ-actin の mRNA 量で補正されている。polyIC により IFN 応答が誘導され、 STAT1 とOAS1 の発現が上昇している。GAPDH を標的とする siRNA を導入した細胞では、
VI．実験例
1） 24 well plate に 293 細胞を準備しておき、TransIT-TKO® を使用して、TaKaRa siRNA design support system で設計し合成したGAPDH を標的とする siRNA、または 1 μI polyIC を細胞に導入した。このとき、ネガティブコントロールとして RNA を加えな いサンプルも用意した。
2） 48 時間培養を行った。
3） 各細胞サンプルから total RNA を調製し、プロトコールに従ってSTAT1、OAS1 および β-actin の mRNA 量を定量した。また、Perfect Real Time サポートシステムで検索し たプライマーを用いて、GAPDH の mRNA も定量した。それぞれの β-actin の値で補 正し、サンプル間で比較した。
GAPDH 遺伝子発現量
STAT1 遺伝子発現量（IFN 応答）
OAS1 遺伝子発現量（IFN 応答）
Positive Control
polyIC siRNA targetingGAPDH Negaive Control 系列1 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Positive Control
polyIC siRNA targetingGAPDH Negaive Control 系列1 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Positive Control
polyIC siRNA targetingGAPDH Negaive Control 系列1 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
VII．参考文献
1） Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. (2003) Nat Cell Biol. 5 (9): 834-839.
2） Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. (2003) Nat Genet. 34 (3): 263-264.
VIII．関連製品
TransIT-TKO®（製品コード MIR2154/MIR2150/MIR2155/MIR2156） PrimeScript® RT reagent Kit (Perfect Real Time)（製品コード RR037A/B） SYBR® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420A/B） Thermal Cycler Dice® Real Time System II（製品コード TP900/TP960） NucleoSpin® RNA II（製品コード 740955.10/.50/.250）
RNAiso Plus（製品コード 9108/9109） RNAi Training Kit（製品コード 3710）
RNAi 実験の基本操作に慣れていただくためのキットです。human GAPDH をターゲッ トとしています。
siRNA 合成受託
タカラバイオホームページ上で siRNA 配列自動デザインシステム［siRNA Design Sup-port System］をご利用ください。簡単に合成 siRNA をご注文いただけます。
Perfect Real Time サポートシステム＊
（http://www.takara-bio.co.jp/realtime/）
＊： ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ニワトリの RefSeq に対してリアルタイム RT-PCR 用プライマーが設計済みです（ご注文によりカスタム合成してお届けします）。 TransIT-TKO® は Mirus Bio 社の製品です。
IX．注意
・ 本製品は研究用として販売しております。ヒト、動物への医療、臨床診断用には使用し ないようご注意ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。 ・ タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の
製造に使用することは禁止されています。
・ SYBR® は Molecular Probe Inc.、Smart Cycler® は Cepheid 社の登録商標です。その他、 本説明書に記載されている商品名などは、特に記載がなくても各社の商標または登録商 標です。ライセンスなどに関する最新の情報は弊社ウェブカタログをご覧ください。
