豌豆中の核酸の分離

昭 和37年6月(1962) 一65一

碗 豆 中 の 核 酸 の 分 離

大

庭

和

子

馨 緒 論 核 酸類の 発見の ては じめ となった墓礎 的研究はFr 1) iedrich (1844∼1895)に よ って な さ れ た 。 即 ち1868 年 に 外 科 手術 の ほ う帯 か ら 得 た 化 膿 細 胞 か ら核 を 分 離 し,そ れ か ら取 り出 され た 核 物 質に,特 殊 な リン 酸 化 合 物 が 含 まれ て い る こ とを み つ け,彼 は そ れ をffヌ ク レ イ ン"と 名 づ け た 。そ の 後 も彼 は,サ ケの 精rの 頭 部 か ら今 では 核 酸 とい っ て い る物 質 を 取 り出 して い る。 核 酸 は,糖 と リン 酸 と塩 基(プ リン 塩 基 又 は ピ リ ミ ジ ン塩 基)が,1分 子 つ つ 結 合 した ヌ ク レオ チ ドを 構 成 単 位 とし て 重 合 した ポ リ ヌ クレ オ チ ド※ で あ っ て, 糖 部 分 は5炭 糖 で,17-一 一リボ ー ス の 入 っ て い る もの を リボ核 酸 ※ 核 酸 を 模 式 化 し て 表 わ す と次 の よ うに な る。

nucleoside{1+1+汁

nucleotide S:糖 P:リ ン酸 B:プ リン ピ リ ミジ ン塩 基 以 下RNAの 略 弓を 用 い る 。)と 称 し, z:一 オ キ シー・17一リボ ー ス の 入 って い る もの を デ オ キ 郭 リボ核 酸(以 下DNAの 略 号を 川 い る)と 称 す る)Mieschen の 発 見 した 核 酸 はDNAで このDNAIよ 核 に の み 存 在 し もつ とあ とに な つ て 発 見 され たRNAに 主 とし て 細 胞 質 に 多 く含 まれ て い る RNAは 生 体 内 に お け る タ ン パ ク質 合 成 と媛 も密 接 な 関 係を 有 す る物 質 と し て 註 目され て お りDNA遺 伝 現 象に 本 質 的 な 役 割 を 演 じて い る。 即 ち 核 酸 は生 物 現 象 に.j」い て 最 も根 本 的 な 牛¥異性 の 決 定 維持 伝 達 の機 構 に 鍵 を握 つ て い る 物 質 で あ る とみ す な こ とが で き る。 タ ンパ ク質 合成 と核 酸 の 関 係に つ い て の 研 究 の 第 … く2) 歩 はBrachetびCasperssonに よ り タン パ ク質合 成 の 盛 ん と考 え られ る 臓 器 の 細 胞 はRNA含 量 が 多 く 生 理 的 に 活 発 で あ つ て も タ ン パ ク質 合 成 が 盛 ん で な い と考 え られ る臓 器 の 細 胞 中 に はRNA含 量 が 少 い と モ 提 唱 され た こ とに 始 る。 そ の 後 種 々 の 細 胞 化 学 実 験 や 定 量 に お い て,こ の 考 え 蔚 昭 和36年 度 本 学 卒 業 生 は 確 認 され た 。 例 え ば,植 物 に お い て エ ン ドウの 受 精 及 び そ の 初 期 の 発 生 過 程 に お い て,RNA及 びDNA が タン パ ク質 合 成 に 利 用 され て い て い る こ と や,タ マ ネ ギ の 鱗 茎 を 結 晶 リボ ヌ ク レ ア ー ゼ で処 理 を す る と,生 長 が 著 し く阻 害 され,こ の リボ ヌ ク レア ー ゼ処 理 を し た も の に 酵 母RNAを 与 え る と,阻 害 が 一 時 的 に 回 復 す る蔀)ことは,植 物 の 生 長 に 対 す る核 酸 の 重 要 性 を 示 す もの で あ る。 我 々が,食 品 中 に 含 まれ て い る 核 酸 と体 内 に 摂 取 す る と,III液 及 び 腸 液 中 の 酵 素 に よつ て 消化 され る。 即 ちNuctaseの 作 用 でNucleotideと な り,こ れ はNu-cleotidaseに よ って リン酸 を 放 っ てNucleosideと な り,次 い で, NudgosidaSeの 作 用 で 糖 と塩 基 に 分 解 され る。 塩 基 は 更 に 酵 素 の 作 用 に よ り,最 終 的 に は 尿 酸 を 形 成 す る。 核 酸 の 食 品 化 学 的 研 究 に 関 し て は,最 近 我 が 国 に お い て 長 足 の 進歩 を な し`天 然 資 源 中 に 存 在 す る イ ノシ ン 酸 を い ろ い ろ な 方 法 例 え ば ポ リヌ クレ オ チ ドを適 当 な 酵 素 処 理 に よ っ て 分 解 し,イ オ ン交 換 樹 脂 を 用い て 容 易 に 抽 出 す る 方 法9等 が 研 究 され,工 業 的 に 量 産 化 され る よ うに な り,基 礎 応 用 方 面 に 利 用 され てい る。 この よ うに 核 酸 は,医 学 や 生 化 学 の 分 野 ば か りで な く,各 方 面 で 広 範 囲 に 研 究,利 用 され て い る 。 そ こ で 本 研 究 に お い て は,高 等 植 物 の_.と して, 又 日常,煮 豆,グ リン ピ ース そ の 他 の 調 理 に よ り,我 々の 食 卓 を 賑 わ し て い る エ ン ドウ豆 を と りあ げ,そ の 種 実 中 の 核 酸 の 定 量 及 び 分 離,分 離 核 酸 の構 成 成 分 の 検 索 を 行 った 。 実 験 〔i〕 実験 試 料 の 調 製 市 販 こ30日きぬ さ や い ん げ ん 。 の 風 乾 物 を 精 粉 機 に て 粉 末 とし,こ れ を 実 験 材 料 と した 。 〔皿〕 核 酸 の 定 量 核 酸 の 定 量 に 際 して は,組 織 中 よ り出来 る だけ純 粋 な 形 で 核 酸 を 取 り出 し て か ら,そ の 構 成 成 分 で あ る 糖,リ ン 酸 あ る い は 塩 基 を 測 定 し て 核 酸 量 を 定 量 す る。 現 在 採 りあ げ られ て い る 核 酸 分 画 法 とし て は,実 験 試 料 を あ らか じめ 破 壊 し て 均 一 化 し,各 物 質 を 抽 出 さ

れ や す い 状 態 に して お き,ま ず 低 温 で 酸 処 理 を し て低 分 子 化 合 物 を,有 機 溶 媒 を 用 い て,脂 質 成 分 を 除 去 す る と,残 渣 とし てDNA, RNA・ タ ン パ ク質 な ど の 混 合 物 が 残 る 。 二れ か らDNA・RNAを 選 択 的 に 抽 出 す る 、 この よ うな分 画 方 法 に はSchmidt-Jhannhausen 5タ 法1)Schneider法 な どが あ る 。 Schneider法 は, 従 来 か ら動 物 組 織D核 酸 の定 量 に 用 い られ て きた が, こ の方 法 は 植 物 紅 織 に そ の ま ま適 用 す る こ とは 出 来 な い 。 それ は 植 物 組 織 に は ペ ン トー ザ ンや ポ リウ ロニ ド ,そ の他 の 多糖 類幽が 多 量 に 存 在 し,そ れ がScneider 法 に お け る核 酸 の 糖 の 呈 色 反 応 を 著 し く阻 害 した り, あ る い は 高 い 定 量 値 をFyえ る た め あ る。 6) Ogur,Rosen等 はSchneiderの 欠 点 を 改 良 し て HCIO4に よ る抽Fi及 び 紫 外 線 吸 収 法 を 用 い て 微 量 のR NAやDNAを 含 む 植 物 組 織 中 の 両核 酸 の 分 画 定 量 に 成 功 した 。 本 実 験 に お い て は,Ogur-Rosen法 に Schneider法 を 琶 み 合 せ た 分 画 方 法 を 用 い て,次 の 実 験 を 試 み た 3) A)核 酸 分 画 の 分 離(Ogur-Rosen,Schn・eider法 まり ))(1)酸 可 溶 性 物rlの 除 去 乾 燥 粉 末試 料19を 正 確 に 秤 取 し'氷 冷10%0`TC A(ト リ ク ロー ル酢 酸)10mLを 加 え て,素 早 く,撹 拝 し て遠 心 分 離 す る。 上 澄 液 を 除 き残 渣 に 前 記 操作 を 再 び行 う。 二 回 分 の 上 澄 液 を 酸 可 溶 性 物 質 分 画 として 除 去 した 。 ② ア ル コー ル ・エ ー テル 可 溶 性 物 質 の 除 表 (1)の残 液 を 水4m4に 懸 濁 し,95joエ タ ノー ル16m 4を 加 え 遠 心 分 離 す る 。 こ の残 渣 を6伽4の エ タ ノー ル ・の混 液(3:1)に 註1 酸 可 溶 性 物 質 とは リン酸mononucleotide, 糖 質,そ の他 低 分 子 リン酸 エ ス テ ル 等 で あ る。 この抽 出操 作 はDNAの プ リ ン盈 基 が離 れ やす い た め,で き るだ け 速 や か に行 う こ と が 必 要 で あ るJ 懸 濁 し,室 温 で し ぼ ら く境 伴 し た の ち,沸 騰 石 を 入 れ,冷 却管 を 付 して 湯 浴 中 で 内 容 物 を3分 間 沸 騰 させ る。 冷 却 後遠 心 分 離 し,上 澄 液 を 除 く。 この 操 作 を3 回 繰 返 し て行 い, 1 を 合 して ア ル コー ル ・エ ー テ ル 可 溶 性 物 質 の 分 画 と して 除 去 した 。 (3)RNAの 抽 出 ② の 残 渣 に0.2N氷 冷PCA(過 塩 素 酸)20甥4を 加 え素 早 く遠 心 分 離 す る。 こ の操 作 を2回 行 い,い ず 2) れ も上 澄 液 は 案 去 し た 。 残 渣 に1NPCA20伽6を 加 え,4。Cで18時 間 分 解 し,遠 心 分 離 す る。 上 澄 液 を 除 去 した も の に1N氷 冷 PCA20〃36を 加 え て 遠 心 分 離 す る 。 こ の 操作 は2回 繰 返 し た 。 (抽 出液 総 量57mの (4)DNAの 抽 出 (3)の残 渣 に0・5NPCA20初4を 加 え,700Cで20分 間 分 解 し,遠 心 分 離 す る。 こ の 操 作 を2回 行 い,上 澄 液 を 合 併 してDNA分 画 と し た 。(抽 出 液 総 量38m6) 註2 PCAにRNAが 抽 出 す る お そ れ が あ るた め 早 く行 う。 B)定 量 アラ (1)RNAの 定 量(Orcinol-HCI反 応 … …Kerr等 の 方 法) ㈲ 試 料:前 記RNA分 画 抽 出 液 を 用 い た 。 3) {b}試 薬 ・・Fecl3を0.02%含 む 濃HCI(分 析 用) d) 10go Orcinol-Alcohol溶 液 勧 操 作:試 料5初6を 目 盛 付 共 栓 試 験 管 に と り,5 伽4のHCI-Fecl3試 薬 及 び0.3〃34のOrcino1試 薬 を 加 え て,20分 間 沸 騰 湯 浴 中 で 加 熱 し,冷 却 後 シtズ,コ タ キ 光 電 比 色 計(F12)を 用 い て 同 様 に 比 色 定 量 し て 作 っ た 。 標 準 検 量 曲 線(酵 母RNAを 用 い た 。)に 照 ら し,RNA量 を 求 め た 。 第1図 が 検 量 曲 線 で あ る 。 RNA抽 出 液 が 濃 す ぎ る の で10倍 に 稀 釈 し て 用 い た 。 Idl結 果:第1図 よ り RNA抽 出 液1〃34(42×10-)420γ

昭 和37年6月(1962) エ ン ド ウ粉 末 1g当 23.94mg と な り エ ン ド ウ粉 末1009中 約2.4%のRNAを 含 ん で い る こ と に な る 。 a> ②DNAの 定 量(Diphenylamine反 応 〔a}試料:前 期DNA分 画 抽 出 液 を 用 い た 。 註3 こ の 混 液 は 共 栓 付 フ ラ ス コ に 保 存 す る,コ ル ク 栓 は コ ル ク 中 に ペ ン トー ス を 含 む か ら 決 し て 用 い て は な ら な い 。 註4 密 栓 し て 暗 所 に 保 存 す る,新 し い と き は 殆 ん ど無 色 で あ る が,古 く な る と オ レ ン ジ 色 を 帯 び て く る か ら 使 用 時 に 調 製 した 方 が よ い 。 In}試薬:19のDiplenylamineを98m 4の 再 蒸 留 水 5) 酢 酸 に 溶 か し,濃 硫 酸2〃 昭 を 加 え て 調 製 す る。 {c}操作:共 機 付 試11"`に 前 記 調 製 試 薬 を2.5m6と り,そ の 中 に 試料1鋭4を 加 え て よ く混 ぜ,沸 騰 湯 浴 中 で5分 間 加 熱 す る 。 冷 却 後 シ マ ズ ー コ タ キ光 電 比 色 計(F10)を 用 い て 定 量 した 。定 量 は 同様 操 作 に よ り 比 色 定 量 して作 っ た 。 標 準検 量 曲 線(スD ムDNA) に 照 ら し,DNA量 を 求 め た 。 第2図 が 検 量 曲 線 であ る。 佃 結 果 ・・第2図 よ り DNA抽 出 液 1桝4中 110γ エ ン ドウ粉 末 1g当 4・18mg と な り エ ン ド ウ 粉 末100g中 約0・4%のDNAが 含 ま れ て い る こ と に な る 。 以 上 の 定 量 結 果 を ま と め る と コ ン ド ウ 粉 末100g中 に は 一一67一 RNA2.394gDNA O.418g含 まれ て い る こ と に な り,RIVA, DNA両 核 酸 が 共 に 揺 当 量 存 在 す る こ と が 認 め られ た 。 註5 こ の試 薬 は冷 所 に 置 き,使 用 時 に 調 製 す る方 が よいo 〔㎜〕 エ ン ドウ 核 酸 の 分 離 核 酸 の 分 離 方 法 と して は,1930年`tま で は 主 とし て 化 学 的 組 織 が研 究 の 対 象 で あ った た め に,ア ル カ リ抽 出,酸 沈 澱 とい った か な り激 し い処 翌 方 法 が 採 られ て は き た が,核 酸 や 核 タ ンパ ク質 が 高 分 子 で あ る こ とが 判 明 した 現 在 で は,食 塩 水 抽 出,ア ル コ ール 沈 澱 の よ うな 出 来 る だ け 温 和 な 方 法 が 採 用 さ れ る よ う に な っ た 。 そ こ で本 実 験 で は,食 塩 水 抽 出 法 に よ りエ ン ド ゥ 核 酸 の 分 離 を 行 った 。 A)試 料 〔H〕 核 酸 の 定 量 に 用 いた と同 し く30日 き ぬ さや い ん げ ん の 粉 末 を 用 い た 。 B)操 作 (1)脂質 成 分 の 除 去 丸 底 フ ラ ス コに 乾 燥 粉 末 試 料3009と95%エ タ ノー一ル 90)mLを 入れ,冷 却 管 を 付 し て 湯 汁 中に て2時 問 内 容 物 を 煮 沸 す る 。 吸 引 濾 過 し,濾 沼 を 、余い た 。 (2)抽 出 (1)の沈 殿 物 を 室 温 で 減 圧 乾 燥 した の ち,工0%NaCl 14を 加 え,電 気 恒 温 器 中 で75。Cに 呆 ち5日 間 抽 出 し た 。 (3)洗 浄 抽 出 物 を 吸 引濾 過 し,濾 液 を100C以 下 に 氷 冷 し な が ら,水 で うす め たHC((35%HCI H20-1:1) をPH2程 度 まで 加 え`核 酸 を 沈 海 させ,遠 心 分 離 した 。 この 沈 澱 物 を ガ ラス フ イ ル タ ー に と り,ゆ る や か に 吸 引 しな がbb{1%エ タ ノ ー ル で01の な くな る まで 洗 浄 した 。Clが な くな っ て か ら95jn sタ ノ ー ル を 加 え,20時 間 放 置 し た 。 吸 引 濾 過 後,x'39.5°oエ タ ノー ル 及 び エ ーテ ル で 洗 浄 し,減 圧 乾 燥 し た 。 こ の生 成物 を エ ン ドウ粗 核 酸 と した 。 C)結 果 エ ン ドウ粗 核 酸 は 半 透 明 の號 珀 色 を し て お り,光 線 の 角 度 に よ り光 沢 を 呈 し た 。 収 量 は エ ン ドウ粉 末3009 よ6.42g(2,14°0)を 得 た 。 〔IV〕エ ン ドウ粗 核 酸 の 精 製 註6 エ タ ノ ー ル の 沸 点 が 低 い の で,安 全 を 期 し て,直 火 に せ ず 別 に 沸 し た 湯 をwater Bathに 注 ぎ煮 沸 し た 。 叉 突 沸 を 防 くた め に 沸 騰 石 を 入 れ た 。

一一般 に 核 酸 は 生 体 内 では タ ン パ ク質 と結 合 し,核 タ ンパ ク質 と して 存 在 して い る こ とが 知 られ て い る。 そ こ で前 記 抽 出 エ ン ドウ粗 核 酸(以 下 粗 核 酸 と略 す)を 水 に 溶 か しHITACHI PHOTO-ELECTRIC SPEC TRO-PHOTOMETERに よ り,紫 外 部 吸 収 曲 線 を か くと第3-1図 の よ うに な った 。(対 照 曲 線 とし て 酵 母RNAを 同 様 に 測 定 した 。 第3-1図 よ り極 小,極 大 波 長 は 第1表 の通 りで あ る 。 す る の で,特 に 分 量 を 指 定 し て い な い 核 酸 溶 液 は,こ の 物 質 を い い,こ 核 酸sol"で あ ら わ す 。 ② 結 果 純 白 の粉 末 の核 酸 を 得,そ の 収 量 は 核 酸sol 30伽4 中,0.1679を 得 た 。 即 ち粗 核 酸15gよ り0・1678の 精 製 核 酸 を 得 た こ とに な る 。 B)純 度 判 定 核 酸 の 純 度 判定 に は 種 々 の 方 法 が あ る が,本 実 験 に お い て は 紫 外 部 吸 収 曲 線 及 びBiuret反 応 に よ り エ ン ドウ精 製 核 酸 の純 度 を 判 定 し た 。 (1)紫外 部 吸 収 曲 線 核 酸solの 紫 外 部 吸 収 曲 線 を 前 記 操 作 に よ り書 く と,第3-E図 の よ うに な っ た 。 こ の 結 果,極 大 波 長 は 共 に260mμ で 一 致 し た が,極 小 波 長 は 酵 母RNAが30mμ2,粗 核 酸 が240m胆 で ユOmμ の ず れ が 出 来,吸 収 値 が230分 間3000回 転 で 遠 心 分 離 す る 。 上 澄 液 を 取 出 し,水 を 加 え て60〃 昭 と し,更 に ク ロ ロ ホ ル ム ーオ ク チ ー ル ア ル コ ー ル の 混 液 を20m 6 ま io 加 え て,タ ン パ ク ゲ ル の 出 来 な く な っ た 核 酸so130na 4に 同 容 の95%エ タ ノ ー ル を 加 え,次 でpH 2位 に な る よ うに 稀HCI(HCI・ ・H20=1:1)を 加 え て 核 酸 を 沈 澱 さ せ る 。 以 下 粗 核 酸 の 洗 浄 と 同 様 にC1の な く な る ま で50%エ タ ノ ー ル で 洗 浄 し,95%エ タ ノ ー ル に 浸 し て 最 後 に99・5%ア ル コ ー ル で 洗 っ て 減 圧 乾 燥 し た 註8 オ ク チ ー ル ア ル コ ー ル は 消 泡 剤 と し て 添 加 し た 。 註9 擢 拝 す る と ク ロ ロ ホ ル ム は 乳 濁 さ れ,そ の ク ロ ロ ホ ル ム滴 の 表 面 に 撹i陣 に よ り変 性 した タ ン パ ク質 が 吸 着 す る 註10上 層 の 核 酸solは 以 後 の 各 実 験 に お い て 使 用 こ の 図 に よ る と,極 大,極 小 波 長 け 酵 母RNA,精 製 核 酸 い ず れ も 第2表 に 示 す ご と くそ れ ぞ れ,260mμ 230mμ と な り 一 致 し た 。又260mμ の 吸 収 値 が230mu あ る い は280muの 吸 収 値 の2倍 に な っ て い れ ば,そ ll) の 核 酸 は ほ ぼ純 粋 物 で あ る とみ て よ い と され て い る 。 そ こ で 吸 収 値 の 比 率 を ま と め て み る と第2表 の 通 りに な った 。 its (2)Biuret反 応 こ の 方 法 は タ ン パ ク 質 が 存 在 す る と, Biuret青 紫 色 を 呈 し,エ タ ノ ー ル 層 に 抽 出 さ れ る が,未 反 応 の 銅 イ オ ン や 他 の も の に よ る 色 は エ タ ノ0ル 層 に 移 ら な い 。 ま た こ の 方 法 に よ る とr約50μ9の タ ン パ ク質 ま

昭 和37年6月(1962) で 検 出 出 来 る の で,3∼5mgの 試 料 を と れ ば,1% の タ ン パ ク質 が 検 出 出 来 る い い か え る と エ タ ノ ー ル 層 に 呈 色 が な け れ ば タ ン パ ク 質 は1°o以 下 と い え る こ と に な る 。 a)試 料 精 製 核 酸4mg b)操 作 試 験 管 に 製 精 核 酸4mgを と り水1〃 昭 に 溶 か し て, CuSO4・5H20溶 液0. Q5m Qを 加 え る 。 約 α99のKO Hを 加 え て 飽 和 さ せ,0.3伽4の95°oエ タ ノ ー ル を 更 に 加 え た 。

一三ラ磁 副

酵 母RNA l 260mμ/230mμ1260mμ/280叫 i.9＆ 2.00

2.49 2.10

c)結 果 CuSO4:5H20を 加 え る と 青 紫 色 をC=1=t.し,エ タ ノ ー ル を 加 え る と 二 層 に 分 離 し た_{。 エ タ ノ ー ル 層 は 無 色} 透 明 で あ っ た 。 従 っ て タ ン パ ク質 は1%以 下 で あ る と 考 え られ る 。 以 上 の 紫 外 部 吸 収 曲 線,Biuret反 応 の 結 果 を ま と め る と, (i)梅 大,極 小 吸 収 波 長 は そ れ ぞ れ260r叩,230mμ で 酵 母RNAと 精 製 核 酸 は 一 致 し た 。 (ii)吸 収 値 の 比 率 が 精 製 核 酸 に お い て260mμ/230 mμ260mμ/280mμ が そ れ ぞ れ1・96,2・00で い ず れ も2 に 近 い 値 を 示 し た 。 (iii)Biuret反 応 に よ り精 製 核 酸 中 の タ ン パ ク質 は1 %以 下 で あ っ た 。 従 っ て 精 製 核 酸 の 純 度 は,か な り高 い も の で あ る と 考 ㌧ r」 工4y_ ンし り イ し/ ・_o 〔V〕 エ ン ドウ 核酸 の 構 成 成 分 の 検 索 A)ペ ン トース に 対 す る オ ル シ ン反 応 ① 試 料 核 酸so1を 用 い た 。 ② 操 作 前 記RNA定 一量 時 と同 様 に反 応 させ,そ の 塁 色 の 有 無 を 見 た 。 (3)結 果 反 応 液 は 緑 色 を 昊 した 。 即 ち エ ン ドウ核 酸 中 に 糖 と し て ペ ン トース が 存 在 し て い る こ とを 認 め た 。 B)デ オ キ シ ペ ン トース に 対 す る ジ フ ェ ニル ア ミン反 応 一69一 (1)試 料 核 酸so1を 用 い た ② 操 作 前 記DNA定 量時 と同 様 に反 応 さ せ,そ の呈 色 の 有 無 を 見 た 。 (3)結 果 反 応 液 は わ ず か に 青 藍 色 を 呈 した 。 即 ち エン ドウ核 酸 中 に 糖 とし て デ オ キ シ ペ ン トース が わ ず か で あ る が 存 在 して い る こ とを 認 め た 。 12) C)リ ン 酸 に 対 す るAllen,中 村 変 法 (1)試 料 精 製 核 酸10mgを 水10〃z 4に と か し た も の を 用 い た 。 ② 試 薬 Il) (イ) 15%H2SO4 12) (ロ)ア ミ ド ー ル 亜 硫 酸 塩 液 13) の3・3°aモ リ ブ デ ン 酸 ア ン モ ニ ウ ム 液 (3)操 作 分 解 び ん に1mg/1mL核 酸 溶 液0・5〃z6と60°oP CAO.9初4を と り,ミ ク ロ ケ ル ダ ー ル の バ ー ナ ー 上 で 加 熱 し た 。 内 容 物 は 加 熱 に よ り,褐 変 化 し,や が て 無 色 に な り 白 煙 が 分 解 び ん を 還 流 し だ し た が,し ば ら くそ の 状 態 で 加 熱 し 続 け た 。 分 解 に よ う し た 時 間 は45 分 で あ っ た 。 分 解 が お わ っ た ら放 冷 し,4翅4の 水 を 加 え て,激 し く 沸 騰 し て い る 湯 浴 中 に ユ5分 間 つ け,流 水 を 冷 却 後,目 盛 付 試 験 管 に 移 し た 。 こ れ に 前 記 試 薬 を(イ)(ロ)の順 に 各1,蛇 加 え,水 で 全 量 を10魏6に し た 。 こ の も の を20。Cに20分 間 保 ち そ の 塁 色 の 有 無 を 見 たo 註11 メ ス シ リ ン ダ ー 中 で85〃z6のH2 SO4を 加 え て100獅6に す る。 註12市 販 写 真 用 ア ミ ドー ル0・49,重 亜 硫 酸 ナ ト リ ウ ム8gを 水 に 溶 か し て100伽4と す る。 ア ミ ド ー ル に よ り,黒 色 の 不 溶 物 を 残 し た り,液 が 褐 色 を あ び た り す る か ら,冷 時 少 量 の 活 性 炭 を 加 え,振 盟 濾 過 し た 。 使 用 時 に 作 っ た 方 が よ い, 註13水 に 加 熱 溶 解 し て 作 る,放 置 す る と 白沈 を 生 ず る が,濾 過 し て 除 い た 。 (4)結 果 反 応 液 は 顕 著 に 青 色 を 呈 し た 。 即 ち エ ン ド ウ 核 酸 中 に リ ン 酸 が 存 在 し て い る こ と を 認 め た 。 14) の D)有 機 塩 基 の 検 索(Paper chromatography法) (1)試 料 エ ン ド ウ 核 酸 を 用 い た 。 ② 試 料 の 調 製(塩 基 組 成 の 分 解) エ ン ド ウ 核 酸45mgを 直 径1cmのglass bombeに と り,6NHC13翅4を 加 え,封 管 後1000 C 2時 間

湯 浴 中 で 加 水 分 解 す る 。 開 管 後HCIを 湯 浴 上 で 溜 去 し,蒸 留 水3粥4で 溶 解 し て,こ れ をPaper chro-matograpliy用Sampleと し た 。 第3表 点 の 名 称 を 決 定 す る為 に 夫hの 純 粋 物 を 同 時 に 展 開 し た 。 Rf値 を 示 す と第3表 の よ うに な った 。 Base SampleRf値 Adenie Guanine Hypoxanthine Xanthine Uracil Cytocine Thymine 0.36 0.27 0.24 0.14 0.56 0.41 0.68 0.02 standard Rf値 0.35 0.29 0.23 0.15 0.56 0.43 1 註14植 物 界 に 存 在 し,Nを 含 むtuu 性 物 質 を 総 称 し て ア ル カ ロ イ ド と称 し,苦 味 質 と し て 知 ら れ て い る が,こ こ で は 新 陳 代 謝 に 伴 う遁 離 の プ リ ン, ピ リ ミ ジ ソ 塩 某 を い う。 以 上 の 結 果 か らPurine Baseと し て4個,即 ち Adenine Guanine, Xanthine, Hypoxanthineと, Pyrimidin.e Baseと し て3個,即 ちUracil Cytocine Thymineを 検 出 し,認 め た 。 尚Rf値0・02のSpotは.

こ れ に 相 当 す る 塩 基 が 見 当 ら な い の で 未 確 認 で あ る 。

(3)操 作

a)方 法;Paper Chromatography一 次 元 一ヒ揖 法 b)濾 紙;東 洋 濾 紙No.50(40cm×2cm) c)溶 媒;n一 ブ タ ノ ー ル:モ ル フ オ リン=水(5:1 註15使 用 略 に新 し く調 製 す る, 註16洗 浄 が完 全 か 否 か を み る 為,別 の濾 級 片 を shmple展 開 の濾 紙 と共 に酎 酸 第 二 水 銀 液 に 浸 す,洗 浄 中 に 時 々取 りrrし,硫 化 ア ンモ 昌 ウ ム溶 液 に 浸 して み て 黒 変 す る か否 か で判 定 した 。 又 第4図 はSpotの 位 置を 示 す 。 .4) d)展 開 温 度 及 び 時 間;32QC恒 温 器 中 で 約30時 間 e)発 色 方 法(吸 着 位 置 の決 定) 風乾 したPaperを エ ー テ ル で 洗 っ て 乾 か し て か エらラ ら,800C30分 加 熱 後, pH6・2の0・1M酢 酸 第 二 銀 液 に 約30秒 浸 す,こ れ に 水 を 入 れ て あ ふ れ さ せ,ゆ る い 流 15) 水 中 で完 全 に 洗 浄 す る 硫 化 ア ン モ ニ ウ ム溶 液 に 浸 す と,硫 化 水 銀 の黒 い 斑 点 が 塩 基 の位 置 を 示 した 。 (4)結 果 発 色処 理 に よ り,黒 色 斑 点 を8個 検 出 し た 。 こ の 斑

総 括 と 考 察

1)Ogur-Rosen Schneider法 に よ り,エ ン ド ウ 豆 中 の 核 酸 を 定 量 し た 結 果,RNA2・394%, DNA O・

418%で か な りの 含 有 量 を 示 した 。 これ に よ り植 物 組 織 中 にRNAは 勿論 の こ と, DN Aも 存 在 す る とい うこ とを 再 確 認 した 。 2)食 塩 水 抽 出 法 に よ りエ ン ドウ核 酸 の 分 離 を 行 い, エ ン ドウ粉 末300gよ り粗 核 酸 と し て6・24g(2・14;0)を 得 た 。 3)エ ン ドウ粗 核 酸 は,そ の 紫 外 部 吸 収 曲 線 及 び タ ン パ ク質 定 性 反 応 か ら,か な り不 純 物 を 含 ん で い る と考 え られ た の で,Chlorborm-gel法 で 精 製 した 結 果, 波 長260mμ に 吸 収 極 大,230mμ に 吸 収 極 小 を もつ 紫 外 部 吸 収 曲 線 を 示 す よ うに な った 。 これ は核 酸 の標 準 曲 線 と全 く一 致 した 。 精 製 核 酸 の 収 量 は,粗 核 酸1・5 gよ り,0.1678で あ った 。これ に よ り核 酸 の 分離 に あ た って は,核 蛋 白質 と して 単 離 した の ち,核 酸 を 分 離 し

昭 和37年6月(1962) た ほ うが 不 純 物 の 混 入 を 防 ぐ意 味 で 望 ま し い と 考 え ら れ る 。 4)分 離 ・精 製 し た 核 酸 の 純 度 は (a)吸 収 値 の 比 率 260mμ/230mμ;1.96 260mμ/280mμ;2.00 bBiuret反 応 に よ り タ ン パ ク 質 の 含 有 量 は1% 以 下 。 と な り,ほ ぼ 純 粋 物 で あ る と 判 定 し た 。 5)エ ン ド ウ 核 酸 の 構 成 成 分 の 検 索 (a)ペ ン ト ー ス,デ オ キ シ ペ ン トス の 定 性 反 応 は い ず れ も 陽 性 を 示 し た 。 し た が っ て 得 られ た エ ン ド ウ 核 酸 はRNAとDNAの _{混 合 物 で あ る と 考 え ら れ る 。} {b)リ ン 酸 の 定 性 反 応 を 行 った 結 果,陽 性 を 示 し た 。 し た が っ て 得 ら れ た エ ン ド ウ 核 酸 の 構 成 成 分 と し て リ ン 酸 の 存 在 を 認 め た 。

(C)塩 基 と し てPurine Base 4個(Adenine, Gtiani ne・Xanthine Hypoxanthine)Pyrimidine Baseと し て3個(UraciL Cytocine Thymine)未 確 認 のspot

1個 を 検 出 し た 。 以 上 の 諸 実 験 結 果 よ り,エ ン ド ウ 種 実 中 に ぱ,RN A,DNAの 両 核 酸 が 存 在 し,か な り の 含 有 景 を 示 し たnま た エ ン ド ウ 核 酸 は ほ ぼ 純 粋 物 と し て 分 離 す る こ と が で き た 。 し か し 核 酸 を 種 実 中 よ り 分 離 す る に あ た っ て け ・ 各 段 階 に お い て 試 料 の 損 失 が 見 られ_{,実 験 操} 作 の 未 熟 さ も 手 伝 っ て,あ ま り良 い 収 罷二を 得 る こ と が で き な か っ た の は 残 念 で あ る 。 と共 に 今 後 の 検 討 が ま た れ る 。 核 酸GP.,現 在 各 分 野 に お い て 大 変 興 味 深 い 研 究 の 対 象 とな って い る。 最 近 では 特 に 遺 伝 の 根 本 原 囚 を 握 る 一一71一 物 質 とし て 究 明 され た り,癌 細 胞 中 にDNAが 存 在 し て い る こ とが 発見 され て い る。 食 物 科 学 に お い て も,核 酸 は 脳 細 胞 の 増 強作 用 を 有 し,投 与 され て い る現 在 更 に 進 だ研 究 が,今 後 ま す ま す 活 発 に 行 わ れ る こ とを 祈 って や ま な い 。

参 考 文 献

1)J.N. Davidson(石 田 政 弘 ・植 田 勝 己 訳):核 酸 の 生 化 学 2)共 立 出 版KK編:蛋 白 質:核 酸:酵 素, 5, No.11.45 (1960) 3)共 立 出 版KK編:蛋 白 質:核 酸:酵 素,3, No. 113∼22 (1958) 4)日 本 栄 養 食 糧 学 会 編:栄 養 と 食 糧,14,No.2,84 (1961) 5)江 上 不 二 夫(代 表):標 準 生 化 学 実 験,136(1953) 6)M,Ogur, G・Rosen:Areh Biochem,25.262

(1950) 7)江 上 不 二 夫:核 酸 及 び 核 蛋 白 質,上 巻143(1953) 8)日 本 化 学 会 編 実 験 化 学 講 座23生 化 学1,289(1961) 9)道 喜 美 代:栄 養 学 実 験 法,18(1960) ユ0)江 一ヒ不 二 夫(代 表):標 準 生 化 学 実 験,141 (1953) 11)日 本 化 挙 会 編:実 験 化`,C'NF`i・座23生 化 学1,250,25 1(161) 12) % 536, 532 (1961) 13) % 316 (1961) ]4) 江 ヒ不 二 夫:核 酸 及 び 核 蛋 白 質,上 巻154 (1953)