学位論文 Doctoral Thesis 論文題名 : 脊椎発生における脊索と神経管底板の役割に関する解析 (Examination of the role of the notochord and floor plate during the spinal development) 著者名 : 安

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学

位

論

文

Doctoral Thesis

論文題名：脊椎発生における脊索と神経管底板の役割に関する解析

(Examination of the role of the notochord and floor plate during the spinal development) 著者名：安藤卓 Takashi Ando 指導教員名：熊本大学大学院医学教育部博士課程臨床医科学専攻運動骨格病態学分野水田博志教授審査委員名：脳発生学担当教授嶋村健児神経分化学担当教授田中英明脳神経外科学担当教授倉津純一形態構築学分野学担当教授福田孝一２０１０年３月

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2

1）要旨・・・p. 4

2）発表論文リスト・・・p. 7

3）謝辞・・・p. 8

4）略語一覧・・・p. 9

5）序論・・・p. 11

6）材料と実験方法・・・p. 22

6－1）変異マウスの作製

6－2）骨格標本の作製

6－3）組織内における



-ガラクトシダーゼ(lacZ)活性の検出

6－4）DIG labeled RNA probe の作製

6－5）Whole mount in situ hybridization

6－6）組織標本の作製

6－7）統計学的処理

7）結果・・・p. 29

7－1）Sd, Skt

Gt

変異マウス後期胚における脊椎発生の解析

7－2）Sd-Skt

Gt

ダブル変異マウス胚の脊索における



-geo 遺伝子

発現検出による脊索発生の解析

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3

7－3）Sd, Skt

Gt

変異マウス胚における

Uncx, Paraxis 遺伝子を用いた

体節発生解析

7－4）Sd, Skt

Gt

変異マウス胚における神経管底板発生の解析

7－5）Sd, Skt

Gt

変異マウス胚における椎板発生の解析

7－6）Sd, Skt

Gt

変異マウス胚における各組織のマーカー遺伝子発現

と形成された椎体数の比較

8）考察・・・p. 36

9）結語・・・p. 41

10）参考文献・・・p. 43

11）図表・・・p. 64

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1) 要旨

【目的】脊索は脊椎発生の中心的役割を担当する。特に脊索は神経管より底板

を発生させるだけでなく、底板とともに脊椎形成の母床となる体節を分化させ

椎板(中軸骨格の直接的な原基)に誘導させることが知られている。しかし、「脊

椎発生にいつまで脊索が関与しているのか？」、「椎板発生に脊索と底板のど

ちらが主に作用しているのか？」という疑問に対して、これまで明確に説明し

ている文献は認めない。我々研究グループの先行実験で得られた、一度発生し

た脊索が早期に消失するものの、上位底板は発生し、下位脊椎の欠損を示す

Danforth’s short-tail (Sd) 変異マウス胚の表現型に注目した。本研究の目的は、Sd

変異ホモ接合体が示す「脊索は一度発生した後消失するが上位底板は誘導され

る」という表現型を利用する事で、脊椎発生における脊索と神経管底板の役割

を明らかにすることである。

【方法】Sd 変異のヘテロ接合体胚、ホモ接合体胚を見分けるため、Sd ゲノム変

異領域に隣接(0.95cM 下流)している Skt

Gt

(我々の研究室でジーントラップ法によ

り得られた変異)をサテライトマーカーとして PCR 法による Sd 変異胚の

genotyping に使用した。また、Skt

Gt

は脊索のレポーター遺伝子としても利用可能

であるため、X-gal 染色によって Sd 変異胚の脊索細胞の検出に使用した。解析

に使用する

wild type, +-+/+-Skt

Gt

, Sd-+/+-+, Sd-Skt

Gt

/+-+, Sd-Skt

Gt

/+-Skt

Gt

, Sd-+/Sd-+,

Sd-Skt

Gt

/Sd-Skt

Gt

胚を交配で作出した。骨格標本は胚生

18.5 日胚を用いて作製し

た。胚生 9.0, 10.0, 10.5 日胚の脊索、体節、神経管底板、椎板発生を、各種分子

マーカーを使用した in situ hybridization (ISH)法により検討した。

【結果】

Sd ホモ接合体は第 6 胸椎以下、Sd ヘテロ接合体は第 6 尾椎以下の中軸

骨格が欠失していた。

Sd ホモ接合体胚は E9.5 までに脊索が消失することがわか

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5

カー

Pax1 を使用した ISH 法によって、ホモ接合体胚の底板における Shh 発現は、

第

17 体節レベル以下で消失し、椎板における Pax1 の発現は第 17 体節レベル以

下で消失していた。体節における

Uncx 発現には明らかな異常を認めなかった。

このことは、

Sd 変異胚の体節発生は正常であることを示している。また、いっ

たん誘導された底板は脊索消失後も

Shh を分泌し続けることがわかった。加え

て、底板発生領域(ホモ接合体: 第 6 胸椎レベルまで、Sd ヘテロ接合体: 第 6 尾

椎レベルまで)で椎板の誘導が起こっていることも明らかになった。その底板、

椎板発生領域は、脊索が消失する時期に発生した体節の領域と一致していた。

【考察】

Sd ホモ接合体胚でみられた下位脊椎欠損の原因は、体節から椎板への

分化異常に先行した脊索消失を起因とした底板の誘導不全にあることがわかっ

た。また、

Sd 変異胚で誘導された底板の領域・椎板の領域は、形成された中軸

骨格の椎体領域と一致していた。このことは、一度誘導された底板は単独で脊

椎発生が可能であることを強く示唆している。

【結論】本研究結果は、脊椎発生において脊索は、底板誘導時期まで関与して

おり、底板を誘導した後は主に脊椎発生の中心組織は底板になる事を示してい

る。

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6

Abstract

Danforth’s short-tail (Sd) mouse is a semi-dominant mutation affecting the development of the

vertebral column. Although the notochord degenerates completely by embryonic day 9.5, the vertebral column exists up to the lumbar region, suggesting that the floor plate can substitute for notochord function. We previously established the mutant mouse line, SktGt_{, through gene trap}

mutagenesis and identified the novel gene, Skt, which was mapped 0.95cM distal to the Sd locus. Taking advantage of the fact that monitoring notochordal development and genotyping of the Sd locus can be performed using the SktGt_{allele, we assessed the development of the vertebra,}

notochord, somite, floor plate and sclerotome in +-+/+-SktGt_{, Sd-+/+-+, Sd-Skt}Gt_/+-+, Sd-SktGt_/+-SktGt_{, Sd-+/Sd-+ and Sd-Skt}Gt_/Sd-SktGt_{embryos. In Sd homozygous mutants with a}

C57BL/6 genetic background, the vertebral column was truncated in the 6th_{thoracic vertebra,}

which was more severe than previously reported. The floor plate and sclerotome developed to the level of somite before notochord degeneration and the number of remaining vertebrae corresponded well with the level of development of the floor plate and sclerotome. Defects to the sclerotome and subsequent vertebral development were not due to failure of somitogenesis. Taken together, these results suggest that the notochord induced floor plate development before degeneration, and that the remaining floor plate is sufficient for maintenance of differentiation of the somite into the sclerotome and vertebra in the absence of the notochord.

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2) 発表論文リスト

参考論文

①関連論文

1．Takashi Ando,

Kei Semba, Hiroko Suda, Akira Sei,

Hiroshi Mizuta,

Masatake Araki,

Kuniya Abe, Kenji Imai, Naomi Nakagata, Kimi Araki, and Ken-ichi Yamamura

The floor plate is sufficient for development of the sclerotome and spine without the

notochord.

Mechanisms of Development 2010, Article in Press

②その他の論文

1．Hiroko Suda, Lee, Kwang Jong, Kei Semba, Fumie Kyushima, Takashi Ando,

Masatake Araki, Kimi Araki, Yukihiro Inomata, Ken-ichi Yamamura

The Skt gene, required for anorectal development, is a candidate for a molecular

marker of the cloacal plate

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3) 謝辞

熊本大学生命資源研究・支援センター・表現型クリニック分野において熊

本大学生命資源研究・支援センター・表現型クリニック分野・山村研一教

授と熊本大学大学院医学研究科運動骨格病態学分野・水田博志教授の御指

導の下、本研究を行いました。多くの御指導を頂き、深く感謝いたします。

また、熊本大学生命資源研究・支援センター・表現型クリニック分野・荒

木喜美准教授、熊本大学生命資源研究・支援センター・バイオ情報分野・

荒木正健准教授、熊本大学大学院医学研究科運動骨格病態学分野・仙波圭

先生には、日々の実験研究から論文作成まで幅広い御助言を頂きました。

また、表現型クリニック分野、運動骨格病態学分野の皆様には有形無形の

多くの御協力、ご支援を受けました。

心より感謝いたします。

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4) 略語一覧

bHLH：basic helix-loop-helix



-gal：



-galactosidase



-geo：



-galactosidase と neomycin 耐性遺伝子の融合タンパクをコードした遺伝子

BMP：bone morphogenetic protein

cM：centimorgan, センチモルガン

DNA：Deoxyribo nucleic acid, デオキシリボ核酸

E：Embryonic day, 胚生

EMT：Epithelial-to-Mesenchymal Transition, 上皮間葉移行

ES 細胞：Embryonic stem cell, 胚性幹細胞

HE ：Hematoxylin-Eosin

IRES：internal ribosomal entry site

MCS：マルチクローニングサイト

MET：Mesenchymal-to-Epithelial Transition, 間葉上皮移行

MGI：mouse genome informatics

ns：not significant

Pax1：Paired-box gene 1

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PCR：polymerase chain reaction, ポリメラーゼ連鎖反応

RT：room temperature, 室温

SD：Standard Deviation, 標準偏差

Sd：Danforth’s short tail マウス

Skt：Sickle tail 遺伝子

SktGt：B6;CB-SktGtAyu8021IMEG

Shh：Sonic hedgehog

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5）序論

脊椎動物の体幹の中軸をなす骨格である脊柱は堅牢性、安定性、弾性そして可

動性を併せ持つ組織である。これらの特性は高等脊椎動物においては椎骨と椎

間板の繰り返し構造によりもたらされる。一方、下等脊椎動物は椎間板を持た

ず、椎骨は直接連結し脊柱を形成する(Romer and Parsons, 1986)。動物種による

これらの差異があるにも関わらず、椎体の発生過程は種間で良く保存されてい

る。脊柱を構成する要素のおおもとは傍軸中胚葉から派生する体節である。傍

軸中胚葉は原腸形成の間、脊索と神経外胚葉に挟まれる形で存在し、その後、

間葉上皮移行(mesenchymal- epithelial transition; MET)による上皮化、分割を経て

上皮性体節となる。体節はその背腹軸上の位置によって周囲組織から受けるシ

グナルが異なる。最背側は神経管より neurotrophin-3(NT-3)のシグナルを受け皮

節(dermatome)へ、中間は主に Wnt シグナルにより筋節(myotome)へ、そして最腹

側部は上皮間葉移行(Epithelial-Mesenchymal Transition; EMT)を経て脊椎、軟骨、

靭帯、さらには頭蓋底の一部などの前駆組織である椎板(sclerotome)へと分化す

る(Fig.1) (Gilbert, 2000)。椎板は疎性間葉組織であるが、まず外側部が凝集し椎

弓が形成され、後に内側部が凝集することで椎体、椎間板が形成される。上述

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可欠な過程である(Gossler and Tam, 2002; Humzah.MD and Soames.R.W., 1988;

Langman.J, 1969; Theiler, 1988)。

体節を椎板へと分化誘導する際、中心的な役割を担う組織は脊索と神経管底板

である。脊索は原始結節(node)を形成する間葉細胞が、頭方に移動して、脊索突

起 notochordal process を形成するところよりその発生が始まる。脊索突起の中

を原始窩からの窪みが進入することにより、充実性から中腔性になり脊索管

(notochordal canal)となる。脊索管は内胚葉と融合し脊索板を形成し、組織の巻き

込みによって再び内胚葉より分離し脊索となる。次に脊索の誘導により外胚葉

が肥厚し、神経板を生ずる。神経板がしだいに原始線条のほうに伸長するに伴

い、側方縁が持ち上がって神経ヒダと呼ばれる構造になり、また押し下げられ

た中央域は神経溝となる。神経ヒダは徐々に正中線で接近し、やがて癒合して

管状の構造、すなわち神経管を形成する。神経管が形成されると引き続き脊索

からのシグナルを受ける最腹側部に神経管底板が誘導される。

これまで、脊索や神経管底板で発現する遺伝子について種々の報告がなされて

きた。Table.1, 2 に MGI (mouse genome informatics, http://www.informatics.jax.org/)

に登録されている過去の報告により脊索・神経管底板で発現が検出された遺伝

子の一覧を示す。表のようにさまざまな遺伝子発現が確認されているが、脊索

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ものである。これまで明らかになっている神経管底板の役割は主にモルフォゲ

ンである Sonic hedgehog (Shh)分子を発現し神経管の背腹側軸における濃度勾配

を作ることで各レベルの細胞を腹側から順に運動神経、介在神経、感覚神経へ

と分化させるというものである(Jessell, 2000)。具体的なメカニズムとしては作ら

れた濃度勾配により Shh により発現が抑制される転写因子(class I)はその閾値が

低いほど背側の領域で発現し、発現が促進される転写因子(class II)はその閾値が

低いほど背側まで発現領域が拡大する。発現した class I、class II タンパクもお互

いを抑制しあい細かな発現のプロファイルが完成し、その領域の細胞をそれぞ

れの分化へ誘導する(Fig. 2)。

一方、体節から脊椎の直接の前駆組織である椎板の分化における脊索の役割に

ついては主にニワトリ胚における移植実験などにより明らかにされてきた。移

植された異所性の脊索のグラフトが接触する神経管に異所性の神経管底板を誘

導し、さらに周囲の中胚葉を軟骨へと分化させ、同時に皮膚や筋肉への分化を

抑制することが報告されている(Pourquie et al., 1993; Yamada et al., 1991)。しかし、

神経管底板の単独組織による体節から椎板への分化誘導に関する解析はいまだ

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Table.1 脊索で発現が確認されている遺伝子

最初の報告者・文献 Acvr activin A receptor, type 1 Yoshikawa SI, Mech Dev 2000 Mar 1;91(1-2):439-44

Aebp1 AE binding protein 1 Ith B, Gene Expr Patterns 2005 Apr;5(4):533-7

Angptl1 angiopoietin-like 1 Lai DM, Dev Dyn 2007 Sep;236(9):2643-52

Anxa4 annexin A4 Hemre KM, J Comp Neurol 1996 May 13;368(4):527-37

Arhgef16 Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 16 Sousa-Nunes R, Genome Res 2003 Dec;13(12):2609-20

Arsi arylsulfatase i Ratzka A, Dev Dyn 2010 Jun;239(6):1779-88

Bcor BCL6 interacting corepressor Wamstad JA, Gene Expr Patterns 2007 Apr;7(5):550-7

Bmp5 bone morphogenetic protein 5 Furuta Y, Development 1997 Jun;124(11):2203-12

Bmp7 bone morphogenetic protein 7 Furuta Y, Development 1997 Jun;124(11):2203-12

Cd44 CD44 antigen Wheatley SC, Development 1993 Oct;119(2):295-306

Cdh2 cadherin 2 Luo Y, Development 2001 Feb;128(4):459-69

Cdx2 caudal type homeobox 2 Beck F, Dev Dyn 1995 Nov;204(3):219-27

Cer1 cerberus 1 homolog (Xenopus laevis) Belo JA, Mech Dev 1997 Nov;68(1-2):45-57

Cfc1 cripto, FRL-1, cryptic family 1 Shen MM, Development 1997 Jan;124(2):429-42

Chrd chordin Goldman DC, Development 2000 May;127(10):2113-23

Cobl cordon-bleu Gasca S, Dev Genet 1995;17(2):141-54 (Gasca et al., 1995)

Col2a collagen, type II, alpha 1 Wood A, Development 1991 Apr;111(4):955-68

Crim1 cysteine rich transmembrane BMP regulator 1 Kolle G, Mech Dev 2000 Feb;90(2):181-93

Cthrc1 collagen triple helix repeat containing 1 Durmus T , Gene Expr Patterns 2006 Dec;6(8):935-40

D230030E09Rik Riken cDNA D230030E09 gene Hassan AS, Gene Expr Patterns 2010 Feb 12;10(2-3):127-34

Daam2 dishevelled associated activator of morphogenesis 2 Nakaya MA, Gene Expr Patterns 2004 Nov;5(1):97-105

Ddx3x DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His) box polypeptide 3, X-linked Sowden JC, Mamm Genome 1997 Jan;8(1):42-4

Dlg1 discs, large homolog 1 (Drosophila) Caruana G, Mol Cell Biol 2001 Mar;21(5):1475-83

Fam198b family with sequence similarity 198, member B Meszaros R, Int J Dev Biol 2008;52(8):1119-22

Fn1 fibronectin 1 George EL, Development 1993 Dec;119(4):1079-91

Foxa1 forkhead box A1 Sasaki H, Development 1993 May;118(1):47-59

Foxc1 forkhead box C1 Sasaki H, Development 1993 May;118(1):47-59

Furin furin (paired basic amino acid cleaving enzyme) Roebroek AJ, Development 1998 Dec;125(24):4863-76

Fut4 fucosyltransferase 4 Fox N, Dev Biol 1981 Apr 30;83(2):391-8

Fyn Fyn proto-oncogene Yagi T , Oncogene 1994 Sep;9(9):2433-40

Gad1 glutamic acid decarboxylase 1 Maddox DM, BMC Dev Biol 2001;1(1):1

Gal galanin T amplin OJ, BMC Genomics 2008;9(1):511

Gdf1 growth differentiation factor 1 Wall NA, Dev Biol 2000 Nov 15;227(2):495-509

Gli2 GLI-Kruppel family member GLI2 Ding Q, Development 1998 Jul;125(14):2533-43

Golph3 golgi phosphoprotein 3 Sowden JC, Mamm Genome 1997 Jan;8(1):42-4

Gpr98 G protein-coupled receptor 98 McMillan DR, J Biol Chem 2002 Jan 4;277(1):785-92

Gtf2ird1 general transcription factor II I repeat domain-containing 1 Bayarsaihan D, Gene Expr Patterns 2003 Oct;3(5):579-89

Hoxb4 homeobox B4 Brend T , Development 2003 Jun;130(12):2717-28

Igdcc4 immunoglobulin superfamily, DCC subclass, member 4 Salbaum JM, Genomics 2000 Feb 15;64(1):15-23

Ippk inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate 2-kinase Verbsky J, P roc Natl Acad Sci U S A 2005 Jun 14;102(24):8448-53

Itga3 integrin alpha 3 T amplin OJ, BMC Genomics 2008;9(1):511

Lgals3 lectin, galactose binding, soluble 3 Fowlis D, Dev Dyn 1995 Jun;203(2):241-51

Lhx1 LIM homeobox protein 1 Barnes JD, Dev Biol 1994 Jan;161(1):168-78

Lyve1 lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 Gittenberger-De Groot AC, Dev Dyn 2004 Jun;230(2):378-84

Map3k5 mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Ferrer-Vaquer A, Gene Expr Patterns 2007 Aug;7(7):808-16

Mtrr 5-methyltetrahydrofolate-homocysteine methyltransferase reductase Elmore CL, Mol Genet Metab 2007 May;91(1):85-97

Ncam1 neural cell adhesion molecule 1 Moase CE, Development 1991 Nov;113(3):1049-58

Nck1 non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1 Bladt F, Mol Cell Biol 2003 Jul;23(13):4586-97

Nck2 non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 2 Bladt F, Mol Cell Biol 2003 Jul;23(13):4586-97

Nes nestin Yaworsky PJ, Dev Biol 1999 JAN 15;205(2):309-321

Nodal Nodal Welsh IC, Dev Biol 2000 Sep 1;225(1):151-68

Nog noggin Goldman DC, Development 2000 May;127(10):2113-23

Notch2 Notch gene homolog 2 (Drosophila) Przemeck GK, Development 2003 Jan;130(1):3-13

Noto notochord homolog (Xenopus laevis) Plouhinec JL, Gene Expr Patterns 2004 Nov;5(1):11-22

Npr3 natriuretic peptide receptor 3 DiCicco-Bloom E, Dev Biol 2004 Jul 1;271(1):161-75

Nrg1 neuregulin 1 Meyer D, Development 1997 Sep;124(18):3575-86

Otx2 orthodenticle homolog 2 (Drosophila) Acampora D, Development 1995 Oct;121(10):3279-90

Pdgfc platelet-derived growth factor, C polypeptide Aase K, Mech Dev 2002 Jan;110(1-2):187-91

Ppp1r1a protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 1A T amplin OJ, BMC Genomics 2008;9(1):511

Prmt1 protein arginine N-methyltransferase 1 Pawlak MR, Mol Cell Biol 2000 Jul;20(13):4859-69

Prox1 prospero-related homeobox 1 Burke Z, Mech Dev 2002 Oct;118(1-2):147

Ptch1 patched homolog 1 Jeong Y, Development 2003 Aug;130(16):3891-902

Ptprd protein tyrosine phosphatase, receptor type, D T amplin OJ, BMC Genomics 2008;9(1):511

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Table.1 脊索で発現が確認されている遺伝子の続き

最初の報告者・文献 Nodal Nodal Welsh IC, Dev Biol 2000 Sep 1;225(1):151-68