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Characterization of Prion Protein (PrP) and Inhibition of Protease - resistant PrP Formation by Anti-PrP Monoclonal Antibodies

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Academic year: 2021

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Title

Characterization of Prion Protein (PrP) and Inhibition of Protease

- resistant PrP Formation by Anti-PrP Monoclonal Antibodies( 内

容の要旨 )

Author(s)

金, さん蘭

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第185号

Issue Date

2005-03-14

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/2239

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

(2)

氏 名(国籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学

学位論文感

目 審 査 委 員 (24) 金 操 蘭(大韓民国) 博士(獣医) 獣医博甲第185号 平成17年3月14日 学位規則第4条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 帯広畜産大学 Characteri2;ationofPrionProtein(PrP)and InhibitionofProtease-reSistantPrPFormation byAnti・PrPMonoclonalAntibodies (抗プリオン蛋白質モノクローナル抗体によるプリオン 蛋白質の解析と蛋白質分解酵素抵抗性プリオン蛋白質 の生成阻害) 主査 帯広畜産大学 副査 帯広畜産大学 副査 岩手大学 副査 東京農工大学 副査 岐阜大学 佳蔵汎一隆 基幸非英直 藤崎川多黒 佐藤品本石 授授授授授 教教教教教 論 文 の 内 容 の 要 旨 ヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病、牛海綿状脳症、ヒツジおよびヤギのスクレイピ ーに代表されるプリオン病は、致死的な神経変性疾患であり、中枢神経組織の空胞変性、 アストロサイトーシス、宿主にコードされたプリオン蛋白質PrPCの構造異性体であるPrPSe

の蓄積などの特徴的な病変を有する。なかでも動物プリオン病は生体内に取り込まれた感

染性のPrPSぐが生体内のPrPモをPrPSeに構造変換してPrPS¢を蓄積することにより発症する。 しかし、PrPCからPrPSq●への構造変換機構に関しては未だ不明であり、プリオン病の発症 機構は十分に理解されていない。本研究はPrP分子に特異的なキノクローナル抗体を作製 し、PrP¢と PrPS¢に対する反応性、PrPOの細胞内での局在、PrPSc生成阻害に関して解析し た。 第1章では、PrP分子上の多様なエピトープを網羅するモノクローナル抗体(mAb)を作 製する目的で、組み換えマウスプリオン蛋白質およびスクレイピー感染マウス脳より精製 したマウスPrPS¢を免疫原に用いてmAbを作製した。得られた29個のmAbはエピトープ 解析の結果10グループに分類された抗PrPmAbパネルを作製した。作製したmAbは連続し たアミノ酸配列を認識する7グループと非連続エピトープを認識する3グループに大きく

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分類された。どの鵬bも蛋白分解酵素処理後のPrPS¢には反応せずPrPS¢特異的な抗体は 得られなかった。PrPS¢をグアニジン塩酸塩などの蛋白変性剤で処理した変性PrPSくにはよ く反応したが、各抗体の反応性はPrPS¢の変性状態により異なっていた。これらの結果か ら、今回新たに作製した抗PrPmAbパネルはPi‡}分子の生化学的解析に極めて有用である .ことが示唆された。 第2章では、第1章にて作製した抗PrPmAbパネルを用いて細胞に発現するPrP¢の細胞 内での発現と局在を解析した。間接免疫蛍光抗体法とフローサイトメーターの結果から、 N末端の繰り返し配列を終識するmAbllOと第1αヘリックス領域を認識する-8Ab31C6が 神経芽塵細胞Neuro2aの細胞膜上に発現しているPげと反応することを示した。この結

果は鵬甲C6が認識する領域がⅢ蚊解析で決定されている琴1αヘリックス琴傍に鱒草し

細胞表面上に表出していることを裏付けるものである。また、mAb32とmAb147は神経芽 腫細胞内のループ状あるいは繊維状のP工ヤ¢分子を認識し、ゴルジ装置や粗面小胞体の局 在とは一致しない部位に存在することから、本来のPrPCの分泌経路とは異なった部位に prpc分子が存在することを初めて明らかにした○また、mAb32が認識するループ状のPrPC は神経芽腫細胞に特異的であることから、プリオン病の神経指向性を解析する上で重要な ツールとなることが示唆された。 第3章では作製した抗PrPmAbパネルの抗体のなかにプリオン持続感染細胞のPrPS¢生 成を抑制する抗体が存在するかどうかを解析した。その結果、C末端側のアミノ酸を認識 する抗体血b72とmAb44Blに加えて、PrPS¢の生成に必須でないN末端側の8アミノ酸繰 り返し配列を認識するmAbllOもPrPS¢の生成を抑制した。これら抗体のPrPS¢生成の50% 阻害効果の濃度はおおよそ1nMであった。また、フローサイトメーターを用いた解析か ら、、PrPScの生成を阻害する抗体は細胞膜上のPrP¢に結合し細胞膜上に停留することが明 らかとなった。このことは、添加した抗体が細胞膜上のPrP一に結合してmAb-Pげ複合体 を形成し・、PrPeの通常の分解経路を干渉して、PrPScの生成に必要な細胞内のPげを枯渇 することにより、PrPSc生成が阻止させたものと考えられた。 本研究で得られた成練は作製した抗PrPmAbパネルがプリオン病の免疫学的診断にのみ ならず、PrP分子の細胞学的な解析のツールとして有用であり、PrP異性体の構造解析や PrP。からPrPSモへの構造変換機構の解析に役立つものと期待される。また、変異型タロイ ッフェルト・ヤコブ病の出現や医原性CJDなどのプリオシ病の治療法が、現在希求されて いる土とから、抗PrP抗体のPrPSo生成の抑制とその機構解明は治療法の開発に役立つも のと期待される。 審 査 結 果 の 要 旨 牛海綿状脳症、ヒツジとヤギのスクレイピー、シカの慢性消耗病、ヒ トのクロイツフェルト・ヤコブ病などの伝達性海線状脳症(TSE)は、 致死性の神経疾患であり、中枢神経親株における空胞変性、アストロサ イトーシス、異常プリオン蛋白質(PrPS¢)わ蓄積などにより特徴づけられ る。TSEは病気の発症機序に√より、遺伝性、孤発性および感染性に大別 されるが、動物プリオン病は全て感染性疾患である。Pri$○は宿主蛋白

であるP.pGの構造異性体である。生体に取り込まれたPrpS¢は細胞内で

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産生されるprP¢をprpS¢に構造変換することにより増幅・蓄積するが、 PrP¢から Prp$¢への構造変換機構に関しては未だ不明である。本研究は prp¢からPrP$cへの構造変換機構の解明をノめざし、prp分子の構造を詳 細に理解することを目的に抗PrP抗体を新たに作製して解析した。 第1章では組み換えマウスプリオン蛋白質(rprp)およびスクレイピ

ー感染マウス脳から精製したPrPS¢を免疫原に用いてモノクローナル抗

体(mAb)を作製し抗PrPmAbパネルを作製した。作製し七mAbはエピト ープ解析により10グループに分類され、その内7グループは連続のア ミノ酸配列を認識し、残り 3グループは非連続エピトープを認識してい た。得られた皿AbはいずれもPrPScには反応しなかったが、■グアニジン 塩酸塩などの変性剤にて変性したPrP5¢には良く反応し、PrpS¢分子上め エピトープの局在を明らかにした。また、.抗PrPmAbパネルはPrP分子 の解析に有用であることを示した。 第2章では第1章で作製した抗 PrIImAbパネルを用いて細胞内での PrPOの分泌と局在に関して解析した。フローサイトメーター等の解析に より mAbllOやmAb31C6が神経芽腫細胞Neuro2aの細胞表面上のPrPC と特異的に反応することを示した。また、mAb32と mAb147はこれまで に報告されていない細胞内のループ状あるいは繊維状のPrP¢を認識し、 神経芽腫細胞に特異的なprp¢の存在することを初めて明らかにした。 ●第 3.章では抗 prpmAbパネルの中でプリオン持続感染細胞における

PrPS¢生成を抑制する抗体の有無に関して解析し、C末端側のアミノ酸

配列とN末端側の 8アミノ酸繰り返し配列を認識するmAbがprp$¢の 生成を抑制することを突き止めた。これらの抗体は細胞表面上の PrP¢ 分子を認識しmAb-PrpC複合体を形成することにより通常のPrPOの分解 経路を干渉することにより prPC産生を阻害することを明らかにした。 以上のごとく本研究で新たに作製した抗PrPmAbパネルはプリオン病 の免疫学的診断のみならずPrP分子の生化学的および細胞生物学的な解 析に有用であり、本研究内容は新たな知見を多く含んでいる。 以上について、審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の 学位論文として十分価値があると認めた。 基礎となる学術論文

1)題 目:Antigenic characterizationof an abnormalisoforn

Of prion protein using a new diverse panelof

monoclonal antibodies

著 者 名、:Ⅹim.C-も‥ ロmetani.A‥ 出atsⅦi,℡‥Isbi9urO,封‥ Shina9aVa′比.and Eoriuebi′絨.

学術雑誌名:Virolo9y

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2)題 目:C寧11-SurfaceretentionofPrPCbyanti-PrPantibody

PreVentS prOtea$e-reSi$tant PrP formation

名:Rim,C一も‥ Rarino′Å‥Isbi9urO.封..Shina9aWa′机‥ Sato川.and Horiuchi,比.

学術雑誌名:Journalof GeneralVirol叩y

参照

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