Garenoxacin の invitro 代謝およびヒトチトクロム P450 に対する作用 【原著・基礎】

【原著・基礎】

Garenoxacin の in vitro 代謝およびヒトチトクロム P450 に対する作用

中村 哲朗・飛世 千栄・加藤 寛・片井 真樹・早川 大善・藤堂 洋三 富山化学工業株式会社綜合研究所^＊

（平成

19

4

27

19

8

9

Garenoxacin mesilate hydrate

P450（CYP） 1A2

CYP3A4

CYP

NADPH

CYP

GRNX

6 µ mol! L，400 mg

C

17

（100

µ mol ! L）まで CYP1A2

CYP3A4

CYP1A2，

CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1

CYP3A4

50％ 阻害濃度は 1,000 µ mol! L

Key words: garenoxacin，cytochrome P450，drug-drug interaction

Garenoxacin mesilate hydrate

des-F

-quinolone

6

M1，酸化的代謝物 M4

および

M5，ならびにグルクロン酸抱合体 M6

る^３）。今回，臨床における

GRNX

in vitro

P450

（CYP）誘導試験およびヒト肝ミクロソームを用いた

CYP

CYP

GRNX

I． 材料および方法 1．被験物質および試薬

GRNX

540.53，遊離塩基として 426.41）は富山

C-GRNX

! mmol）。 HPLC

98％ 以上であっ

GRNX

M1，M4

M5

M6

は合成が困難であったため，使用しなかった。

7―エトキシレゾルフィン，レゾルフィン，フェナセチ

α

1

!

PBS）はSigma-Aldrichより購入した。また，ring-U-

C―

トルブタミド（比放射能

2.26 GBq! mmol）， S-4-

C―メフェ

! mmol）， guanidine-

C―デブリソキン

mmol）および 2-

C―クロ

mmol）は GE Healthcare

4-

C―テストステロン（2.07

1.85 GBq! mmol）は GE Healthcare

PerkinElmer

4ʼ―ヒドロキシメフェニトイン，

4―ヒドロキシデブリソキン硫酸塩，6―ヒドロキシクロル

6 β

SAFC

β ^-NADPH， β ^-NADP

6

6

（G6PDH）は和光純薬工業（株）より購入した。培地はブ レットキット

HCM：培地添加因子セットを三光純薬株

＊富山県富山市下奥井

2―4―1

Fi g . 1 . Che mi c a l s t r uc t ur e s of ^{1 4} C- g a r e nox a c i n, a nd me t a bol i t e s M1 , M4 , a nd M5 .

(1)

C-Garenoxacin (2) Metabolite M1

(3) Metabolite M4 (4) Metabolite M5

N

O O HN

H

C H

COOH F

F

・H

C-SO

H・H

O

＊

＊

labeled position

N

O O N

H

C H

COOH F

F HO

S

N

O O HN

H

C H

COOH F

F O

N

O O HN

COOH F

F O HO

H

C

Invitrogen

BD

HPLC

2．ヒト試料

提供者の同意を得た外国人

10

5

15

8

7

045243060025），ならびに白人女性由来のヒト凍結肝

3．ヒト肝ミクロソームによる代謝

NADPH

L β -NADP

mmol! L G6P，0.4 unit! mL G6PDH

3.3 mmol! L

100 mmol! L

protein! mL）を加え，37℃ で 5

C-GRNX

200 µ mol! L）添加にて反応開始し，37℃ で 2

400 µ L

!

800 µ ^L

11,000×g

5

洗浄液を先の上清と混合して減圧濃縮後，残渣を移動相

A

200 µ L

Radio-HPLC

NADPH

NADPH

なお，ヒト肝ミクロソームの酵素活性を確認するため，

テストステロン

6 β

C―テストステ ロ ン（50 µ mol! L），

NADPH

tein! mL）を 37℃ で 10

TLC

以上の実験例数は

2

4．ヒト CYP1A2

CYP3A4

hEGF，ゲンタマイシン !

B

FCS

HCM

1×10

viable cells! mL

75％

であった。細胞懸濁液は，プレートに播種した後に

CO

インキュベータ（37℃，95％

air-5％ CO

24

4

ハイドロコルチゾン，アスコルビン酸，トランスフェリ ン，インスリン，

BSA

24

被験物質暴露は，前培養の後

GRNX

100 µ mol! L），溶媒対照（0.4％ ジメチルスルホキシド）また

72

（CYP1A2）またはリファンピシン（CYP3A4）を使用し た。培地は

24

CYP1A2

び

CYP3A4

D-PBS

µ mol! L）またはテ

µ mol! L）を含む D-PBS

37℃ にて 6

4

100 µ L

100 µ L

11,000×g

10

2

5．ヒト CYP

GRNX

1,000 µ mol ! L），陽性

（終濃度：1％）］を，標準基質（終濃度：2

µ mol! L）およ

mL）を含

100 mmol ! L

37℃ で 1

よび陽性対照物質として，以下のものを使用した：7―エ ト キ シ レ ゾ ル フ ィ ン お よ び

α

（CYP1A2），7―エトキシクマリンおよびジエチルジチオ カルバミン酸（CYP2A6），¹⁴

C―トルブタミドおよびスル

S-

C―メフェニトインおよ

C―デブリソキンお

C―クロルゾキサゾンおよび

C―

テストステロンおよびクロトリマゾール（CYP3A4）。

NADPH

L）添加にて反応開始し，37℃

で所定時間インキュベーションした。反応時間は直線性 の得られた範囲，すなわち

10

CYP3A4），15

CYP2E1）または 30

600 µ L，その他の分子種では 200 µ L

1.2 mL

（CYP1A2），7.5％ トリクロロ酢酸

100 µ L

または

TLC

400 µ L（そ

TLC

4―ヒドロキシデブリソキ

（CYP2E1）お よ び

6 β

（CYP3A4）を使用した。以上の実験例数は

3

6．分析条件

1） ヒト肝ミクロソームによる代謝

14

C-GRNX

6200，（株）日立製作所），検出器（L-4000，（株）日立製

525TR，PerkinEl- mer）およびオートサンプラー（AS8020，東ソー（株））

を使用し，データ処理はワークステーションシステム

（FLO-ONE^TM

for Windows，PerkinElmer）で行った。分

Develosil ODS-HG-5

4.6 mm×長さ 150

mm，野村化学（株）），カラム温度は 30℃ とした。移動

相は

A

!

!

B

!

0％ で開始後，15

B

60％ 次いで 35

B

100％ となる線形グラジエントとし，その

45

B

100％）とした。流速は移動相 1.0 mL!

min，液 体 シ ン チ レ ー タ ー（Ultimaflo

M，PerkinEl- mer） 3.0 mL! min

280 nm

（フローセル容量：500

µ L）にて行った。

6 β

TLC

（株））を用いて測定した。

6 β

TLC

2） アセトアミノフェンおよび 6 β

酵素誘導試験における肝細胞培養上清中のアセトアミ ノフェンおよび

6 β

HPLC

アセトアミノフェン定量にはポンプおよびオートサン プラー（W2795，Waters）ならびに検出器（W2487，Wa-

ters）を使用し，データ処理はデータ処理ソフト（Empow- er

2，Waters）で 行 っ た。分 析 カ ラ ム は YMC pack ODS AM312

5 µ m， 内径 6 mm×長さ 150 mm，

（株）ワイエムシィ），カラム温度は

30℃ とした。移動相

A

v! v! w）］および B

200: 1: 5，v ! v ! v ! w）］のグラジエント（B

0％ で開始後 15

B

50％ となる線形グラジエントとし，そ

20

B

50％）とした。流速は 1.0 mL! min，

検出波長は

254 nm

6 β

7100，（株）日立製作所），検出器（L-7400，（株）日立製

分 析 カ ラ ム は

Nucleosil 5C

4.6 mm×長 さ 200 mm，

30℃，移動相はアセト

100 mmol! L

（40: 1: 59）とし，流速

1.0 mL! min，検出波長 240 nm

3） CYP

CYP1A2

11,000×g

10

F2000，励起波長 550 nm，蛍光波長 585 nm）

で測定した。

CYP2A6

200 µ L

500 mmol! L

pH 9） 800 µ L

Fi g . 2 . Re pr e s e nt a t i v e r a di oc hr oma t og r a m of ^{1 4} C- g a r e nox a c i n i nc uba t e d wi t h huma n l i v e r mi c r os ome s .

1 4 C- Ga r e nox a c i n ( 2 0 0 μ mol / L) wa s i nc uba t e d wi t h 1 mg pr ot e i n/ mL of huma n l i v e r mi c r os ome s i n t he pr e s e nc e of NADPH a t 3 7 ° C f or 2 hr .

Radioactivity (cpm)

Time (min) 0

0 7,500 15,000 22,500 30,000

5 10 15 20 25 30 35 40 45

Garenoxacin

ンベリフェロン濃度を分光蛍光光度計（日立

F2000，励起

380 nm，蛍光波長 460 nm）で測定した

その他の

CYP

C

11,000×g

2

200 µ L

TLC

2

Silica gel 60F254

!

（CYP2C19）およびクロロホルム!酢酸エチル!酢酸（70:

30: 1）

CYP3A4

1 mL

30

min，Recipro shaker，タイ

13 mL

（TRI-CARB 2500TR，PerkinElmer）により放射能を測 定した。

II． 結

1．ヒト肝ミクロソームによる代謝

14

C-GRNX

2

Fig. 2

200 µ mol ! L

GRNX

物である

M4（標準物質の保持時間：38

M5

（同：30分）を含め， 代謝物ピークは認められなかった。

また，¹⁴

C-GRNX

NADPH

200 µ mol! L

100％（99.3〜102.3％）

であった。

な お，使 用 し た ヒ ト 肝 ミ ク ロ ソ ー ム（Lot No.

045243060025）のテストステロン 6 β

1.13 nmol! min! mg protein

GRNX

2．ヒト CYP1A2

CYP3A4

GRNX

CYP1A2

CYP3A4

6 β

O―脱エチル

6 β

（CYP3A4）活性を算出した（Fig. 3）。

CYP1A2

100 µ mol! L

GRNX

72

µ mol! L，0.69 pmol! min! well

µ mol! L）は CYP1A2

2.8 pmol! min! well

4

CYP3A4

CYP1A2

100 µ mol ! L

GRNX

72

min! well）と同程度の約 1.5〜3.0 pmol!

min! well

（50

µ mol! L）は CYP3A4

12 pmol! min! well（溶

5

以上，GRNXは

CYP1A2

CYP3A4

3．ヒト CYP

GRNXのCYP1A2，CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，

CYP2D6，CYP2E1

CYP3A4

CYP

GRNX

40

200 µ mol! L

CYP

µ mol! L

CYP2A6

CYP2D6

25％ 減

Fi g . 3 . Ef f e c t of g a r e nox a c i n on CYP1 A2 a nd CYP3 A4 a c t i v i t y i n pr i ma r y c ul t ur e d huma n he pa t oc y t e s . Huma n he pa t oc y t e s we r e t r e a t e d wi t h g a r e nox a c i n ( 4 , 2 0 or 1 0 0 μmol / L) , pos i t i v e c ont r ol c ompounds ( 5 0 μmol / L ome pr a z ol e or 5 0 μ mol / L r i f a mpi c i n) , or v e hi c l e c ont r ol ( 0 . 4 % di me t hy l s ul f ox i de ) f or 7 2 hr . The c ul t ur e me di um c ont a i ni ng t he t e s t c ompound wa s r e pl a c e d da i l y wi t h f r e s h me di um ov e r t he e x pe r i me nt pe r i od. Da t a i s e x pr e s s e d a s t he me a n ( c ol umn) a nd i ndi v i dua l v a l ue s ( c i r c l e ) of dupl i c a t e e x pe r i me nt s .

ND: Not de t e c t e d ( l owe r l i mi t of qua nt i f i c a t i on f or a c e t a mi nophe n: 0 . 5 μ mol / L ＝ 0 . 6 9 pmol / mi n/ we l l ) . (2) CYP3A4 activity

0 5 10 15 20

0.4% DMSO (vehicle control)

Garenoxacin 4 μ mol/L

Garenoxacin 20 μ mol/L

Garenoxacin 100 μ mol/L

Rifampicin (positive control) Testosterone 6 β -hydroxylation (pmol/min/well)

0 1 2 3 4 5

0.4% DMSO (vehicle control)

Garenoxacin 4 μ mol/L

Garenoxacin 20 μ mol/L

Garenoxacin 100 μ mol/L

Omeprazole (positive control) Phenacetin O -deethylation (pmol/min/well)

ND ND ND ND

(1) CYP1A2 activity

CYP2E1

CYP3A4

1,000 µ mol! L

20％ 未満であった。一方，陽性

CYP

30〜93％

であった。

III． 考

新規医薬品に関する種々の情報を提供することは，臨 床における医薬品の適正使用に繋がる。特に薬物動態学 的な観点からは，薬物間相互作用に関する情報提供が重 要である。薬物動態学的相互作用は主に代謝過程が原因 であり，中でも

CYP

GRNX

ヒト肝ミクロソームを用いて

GRNX

CYP

GRNX

てのリスク（併用薬に与える影響）を評価するため，ヒ ト初代培養肝細胞を用いて

CYP1A2

CYP3A4

GRNX

CYP

GRNX

GRNX

NADPH

C-GRNX 600 mg

尿および糞）を用いた別検討で，主代謝物として

M1，次

M6

GRNX

2

CYP

 C in, u C max R B

Q H

f p /R B

＝ ＋ k a ・ ・ D F a ×

・

Ta bl e 1 . Ef f e c t of g a r e nox a c i n on t he CYP- c a t a l y z e d a c t i v i t y i n huma n l i v e r mi c r os ome s ( 1 ) CYP1 A2 , CYP2 A6 , CYP2 C9 , a nd CYP2 C1 9

Ac t i v i t y ( % of c ont r ol )

( μ mol / L)

Te s t c ompound

CYP2 C1 9 CYP2 C9

CYP2 A6 CYP1 A2

9 7 . 4 ±4 . 6 9 6 . 4 ±1 . 4

9 9 . 5 ±6 . 6 1 0 4 . 0 ±1 . 1

4 0 Ga r e nox a c i n

8 7 . 2 ±6 . 1 1 0 1 . 9 ±4 . 2

9 6 . 0 ±3 . 5 1 0 1 . 9 ±0 . 4

2 0 0

8 3 . 8 ±1 7 . 0 9 6 . 5 ±3 . 1

7 5 . 1 ±4 . 1 8 9 . 7 ±0 . 2

1 , 0 0 0

3 5 . 9 ±2 . 4 2 4 . 5 ±0 . 2

6 2 . 2 ±3 . 8 8 . 2 ±0 . 2

Pos i t i v e c ont r ol

( 2 ) CYP2 D6 , CYP2 E1 , a nd CYP3 A4

Ac t i v i t y ( % of c ont r ol )

( μ mol / L)

Te s t c ompound

CYP3 A4 CYP2 E1

CYP2 D6

1 0 7 . 8 ±1 . 4 9 6 . 4 ±5 . 0

9 3 . 5 ±1 0 . 4 4 0

Ga r e nox a c i n

1 0 6 . 4 ±1 . 6 9 0 . 8 ±6 . 7

9 9 . 6 ±2 1 . 8 2 0 0

9 5 . 4 ±0 . 8 8 2 . 4 ±4 . 3

7 7 . 1 ±4 . 9 1 , 0 0 0

6 . 7 ±0 . 6 7 0 . 6 ±4 . 5

2 9 . 3 ±5 . 1 Pos i t i v e c ont r ol

a)

7 - Et hox y r e s or uf i n O - de e t hy l a t i on ( CYP1 A2 ) , 7 - e t hox y c ouma r i n O - de e t hy l a t i on ( CYP2 A6 ) , t ol but a mi de hy dr ox y l a t i on ( CYP2 C9 ) , S - me phe ny t oi n 4 ' - hy dr ox y l a t i on ( CYP2 C1 9 ) , de br i s o- qui ne 4 - hy dr ox y l a t i on ( CYP2 D6 ) , c hl or z ox a z one 6 - hy dr ox y l a t i on ( CYP2 E1 ) a nd t e s t os t e r one 6 β - hy dr ox y l a t i on ( CYP3 A4 ) .

b)

2 0 μ mol / L α - Na pht hof l a v one ( CYP1 A2 ) , 1 , 0 0 0 μ mol / L di e t hy l di t hi oc a r ba mi c a c i d ( CYP2 A6 ) , 2 μ mol / L s ul f a phe na z ol e ( CYP2 C9 ) , 2 0 μ mol / L t r a ny l c y pr omi ne ( CYP2 C1 9 ) , 2 μ mol / L qui ni di ne ( CYP2 D6 ) , 2 0 0 μ mol / L di e t hy l di t hi oc a r ba mi c a c i d ( CYP2 E1 ) a nd 2 μ mol / L c l ot r i ma z ol e ( CYP3 A4 ) .

Da t a i s e x pr e s s e d a s pe r c e nt a g e of t he me a n v a l ue of v e hi c l e c ont r ol ( di s t i l l e d wa t e r f or g a r e - nox a c i n, or 1 % a c e t oni t r i l e f or pos i t i v e c ont r ol c ompounds ) , a nd me a n ±S D of t r i pl i c a t e i nc uba t i ons . Ga r e nox a c i n wa s i nc uba t e d a t 3 7 ° C wi t h huma n l i v e r mi c r os ome s a nd t he pr obe s ubs t r a t e s , a s de s c r i be d i n Ma t e r i a l s a nd Me t hods .

（約

92％

40％，600 mg

60％ であり，GRNX

CYP

また，GRNXは臨床

C

7

11.06 µ g! mL＝26 µ mol! L，臨床第一相試験成績）およ

GRNX

6 µ mol! L，上記 C

に

ex vivo

0.25

れ ぞ れ 約

4

17

100 µ mol ! L

CYP1A2

CYP3A4

さ ら に，GRNXは

CYP1A2，CYP2A6，CYP2C9，

CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1

CYP3A4

50％ 阻害

1,000 µ mol! L

肝臓の酵素近傍の薬物濃度を求める以下のモデル式^１１）よ り算出したヒトにおける肝臓流入最大非結合型濃度（約

26 µ ^mol ! L）の約 38

GRNX

CYP

C

C

: 11.06 µ g! mL

（26

µ mol! L，臨床第一相試験成績）， R

血漿中濃度比（0.77，in vitro試験より算出），ka：吸 収速度定数（0.1 min⁻¹）^１２），D：投与量（400 mg＝938

µ mol）， F

Q

min）

f

これらの結果より，GRNXは臨床投与量での血漿中濃 度において

CYP

フルオロキノロン系抗菌薬との併用により薬物間相互 作用を引き起こす薬剤としてテオフィリンが挙げられ る^１４）。そ の 機 序 は フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 抗 菌 薬 に よ る

CYP1A2

GRNX

CYP1A2

がテオフィリンとの相互作用を発現する可能性は低いと 推定された。しかし，臨床薬理試験（経口薬

garenoxacin

theophylline

1.2

GRNX

GRNX

CYP

シンとの相互作用について薬物トランスポーターの関与 が示唆されており^１８），GRNXとテオフィリンの相互作用 に

CYP

今後さらなる検討が必要である。

以上，

GRNX

CYP

CYP

したがって，臨床で

CYP

謝 辞

本論文の作成に際して，実験にご協力いただきました 富山化学工業（株）現 臨床開発部の松本淳一氏に深く感 謝いたします。

文 献

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To assess the possibility of pharmacokinetic drug-drug interactions of garenoxacin mesilate hydrate

(GRNX), we investigated the metabolism of GRNX in human liver microsomes, the induction effect of GRNX

on cytochrome P450(CYP) 1A2 and CYP3A4 activity in primary cultured human hepatocytes, and the inhibi-

tion effect of GRNX on the metabolic activity of probe substrates for CYP isoforms in human liver micro-

somes. GRNX was hardly metabolized by human liver microsomes in the presence or absence of NADPH,

showing that CYPs are unlikely to be involved in the metabolism of GRNX. GRNX did not exhibit the induc-

tion effect on CYP1A2 and CYP3A4 activity at up to 100 µ mol! L, which was approximately 17-fold higher

than the unbound GRNX concentration in plasma (approximately 6 µ mol! L, calculated from the C

at 400

mg repeated oral dose in humans). GRNX had little inhibition effect on the CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9,

CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, and CYP3A4 activity, and the 50％ inhibition concentration for these CYP iso-

forms exceeded 1,000 µ mol! L. In conclusion, GRNX is unlikely to cause CYP-mediated drug-drug interac-

tions in humans when it is administered concomitantly with other drugs.