博 士（ 農学）Yulia Pujiastuti
学位論文題名
Studies on Insecticidal Crystal Protein Isolated from Bacillus thurZ 移 ぎ Z ￠ 刀 SZSStrainS andTheirACtiVityTOWardSLepidopteranInSeCtS
(Bacillus thuring ￠刀妬から分離された殺虫性夕ンパク質と 鱗 翅 目 昆 虫 に 対 す る そ れ らの 殺 虫 活 性 に 関 する 研究）
学 位論文内容の要旨
Bacillus曲unng7ensisは、グラム陽性の土壌細菌で、胞子形成期に殺虫性結晶タンパ ク質を産生する。このことから微生物農薬として、重要な農業害虫の防除ならびに、衛 生害虫の防除に広く利用されている。B曲urZq夢活ロsお菌は、主として土壌から分離さ れるが、死亡昆虫や植物の葉からも分離される。また、本細菌が保有する殺虫性タンパ ク質遺伝子（cザgene）は、遺伝子組換え耐虫性作物の作出にも利用され、近年注目を あびている。
本研 究 で は 、東 南 ア ジアの 農作物に おいて 重要な害 虫であ る、ハス モンヨ 卜ウ
（母如dめ絶朋ムぬ朋）に対し強い殺虫活性を有する丑舶ぱ函占ゴ朗蝣菌株の検索ならび に、その菌株の有する殺虫性タンパク質遺伝子（cザ遺伝子）のクローニングならびに 塩基配列の決定を行った。また、その結晶タンパク質が鱗翅目昆虫に殺虫活性を示す際、
対象昆虫の細胞膜上の受容体タンパク質（receptorprotein）に結合し、細胞膜に穴をあ け昆虫を死亡させることが知られていることから、受容体についても検討を行った。
1‑ ハ ス モ ン ヨ ト ウ に 対 し 殺 虫 活 性 を 有 す る 且 必urf丑 ぎ ぬ ロ 譱 菌 株 の 検 索 本研究室保存の、Bめぱfロ夢冶口sお標準株ならびに、分離株の中から、ハスモンヨト ウに殺虫活性を有するB出urZロ夢嵒nむ菌株のスクリーニングを行った。その結果、標 準株の中で、SeroVar釦め皿弛耐uS株と8ubSp．肌止aぬ凹Sお株が、ハスモンヨ卜ウに対 して強い殺虫活性を有していることが明らかとなった。また、各地の土壌から分離され た分離株 につい ては、seroVara艢むKMK9．20，serovar印 め閲Dc甜usKM19414‐3， serovar出 ′ ．m．sぬ 出 腦 おKRU・A． 1が 強 い 殺 虫 活 性 を 有 し て い た 。 2． sub8p． ザU五a皿 凹 む 株 のcル ロ 遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ と 塩 基 配 列 決 定 ハスモンヨ卜ウに対して殺虫活性を有していた、B曲ば面夢ぬ1s．お標準株の中、subsp． げu五an印sお株がよ り強い 殺虫活性を有していたことから、この菌株を用いて、PCR 法によルザル遺伝子の同定を行ったところ、cヴヱ46、cザヱ4cならびにqyJD遺伝子を
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有 し て い る 事 が 明 ら か に な っ た 。crylAb遺 伝 子 に つ い て は 、 既に 中 谷 ら （1994)に よ ル ク ロー ニ ン グ なら び に 塩 基配 列 決 定 がな さ れ て いる の で 、 本実 験 で はcrylAbw遺伝 子 の 有 する 殺 虫 活 性に つ い て 調査 し た 。そ の結果 、コナ ガ(Plutella xylostella)に対し て 強 い 殺 虫 活 性 を 有 し て い た が 、 カ イ コ(Bombyx morj0に 対 して は 殺 虫 活性 を 有 し てい な い 事が 明 ら かとなっ た。subsp．wu由丑 ロ凹sお 株は、 ハスモ ンヨト ウに対 する強い 殺虫 活 性 の他 に 、 カ イコ に 対 す る強 い 殺 虫 活性 を 有 す るこ と か ら 、カイ コに殺虫 活性を 有す る と 報告 さ れ て いる 餌yヱD遺 伝 子 に 着目 し て 、 その 遺 伝 子 のク ローニ ングな らびに 塩基 配列 決定を 行った 。その結 果、約135kDa（3400bp）のタンパク質・―をコードするりy｜D6げ 遺 伝 子が ク ロ ー ニン グ さ れ た。 こ の ばynめ げ 遺 伝子 の 塩 基 配列 の決定 を行っ たとこ ろ、
Lambert（1993） が 報 告 し た ザyn）6遺 伝 子 と 全く 同 じ で ある こ と が 明ら か と な った 。 さら に、びy江めげ 遺伝子 を大腸菌 で発現 させた 後、そ のタン パク質 の殺虫 活性について、
ハ ス モン ヨ 卜 ウ 、カ イ 、 コ 、コ ナ ガ につ いて調 査した 。供試 した3種 の昆虫の 幼虫す べて に お いて 殺 虫 活 性が 認 め ら れ、 ハ ス モ ンヨ 卜 ウ な らび に カ イ コにつ いては強 い殺虫 活性 を 示 した 。 こ のことよ り、s矼bsp．肌 ヱゐ伽 釦嫡株の 有する カイコ に対す る強い 殺虫活 性 は、ザルヱめげ遺伝子によるものであることが明らかとなった。
3． subsp． ワuム 口口 飽 む 株 殺虫 性 タ ン パク 質 に 対 する 数 種 鱗 翅目 昆 虫 の 受容 体 タ ン パク質の検出
且め ′．fロ加ロs嵒の殺 虫性結 晶夕ン パク質 に対する受容体は、感受性昆虫の幼虫の中 腸 上 皮 組 織 細 胞 のBrushBorderMembranevesicles＄BMめ に 存 在 す る と い わ れ 、 受 容 体 と して 、 ア ミ ノペ プ チ デ ースNや カ ド ヘ リン 様 タ ン パク 質 が 報 告さ れ て い る。 そ こ で subsp．げUムaロ 釦sお株 の結晶タ ンパク 質が、 農業に おいて重要な害虫（ハスモンヨ卜ウ、
コ ナ ガ） に 対 し て強 い 殺 虫 活性 を 有 す るこ と か ら 、こ れ ら の 数種類 の鱗翅目 昆虫幼 虫を 用 い て、 こ の タ ンパ ク 質 に 対す る 受 容 体の 解 析 を 行っ た 。 受 容体の 解析に供 試した 鱗翅 目昆虫は、カイコ、コナガ、マイマイガ（ら珊aロなね出叩ar）、オオモンシロチョウ（．＆餌活 6′ass轟 惣e） とし 、 そ れ ぞれ の 幼 虫 からBBMVを 精製し た。sub8p． げU五aロ釦sお 株から ク ロ ーニ ン グ された、 グ灯A6げ遺伝子 とc′． ルヱ泊w遺伝子 それぞ れのコ ードす るタン パ ク 質 （crylA．bwな ら びCrylDbwタ ン パ ク 質 ） と 供 試 昆 虫 か ら 精 製 し たBBMVと の 結 合 検 定（bind泣gassay） を行 い 、 受 容体タ ンバク 質の検 出を行 った。 その結 果、CrylAbw に 対 す る カ イ コ の 受 容 体 と し て、 ア ミ ノ ペプ チ デ ー スNが 、CrylDbwに 対 す るカ イ コ の 受 容 体と し て 、 アミ ノ ペ プ チデ ー スNと カ ドヘ リ ン 様 タン パ ク 質 が、 検 出 さ れた 。 こ の こ と か ら 、 貝 必urfロ 廓nsお が 保 有 す る 異 な っ た ヴ 遺 伝 子 由来 の 殺 虫 性タ ン パ ク 質は BBMVに 存 在 す る 異 な っ た 受容 体 と 結 合し て 殺 虫 性を 示 す こ とが 明 ら か とな っ た 。 カイ コ 以 外の 昆 虫 と して は 、 コ ナガ に お ける 受容体 は、ア ミノペ プチデー スNが検 出され た。
マ イ マイ ガ ・ オ オモ ン シ ロ チョ ウ に つ いて は 、 結 合検 定 の 結 果から 受容体は 検出さ れな かった。
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学位論文審査の要旨
学位論文題名
Studies on Insecticidal Crystal Protein Isolated from Bacillus thur 卿 ￠ 刀 S 絡 StrainS andTheirACtiVityTOWardSLepidopteranInSeCtS
(Bacillus thuring ピ刀s おから分離された殺虫性夕ンパク質と 鱗 翅 目 昆 虫 に 対 す る それ ら の殺 虫 活性 に 関す る 研究 ）
Bacillusめunngiensisは、 グラ ム陽 性 の土 壌細 菌で、胞子形成期に殺虫性 結晶タンノミ ク 質 を 産 生す る。 この こ とか ら微 生物 農 薬と して 、重 要な 農 業害 虫の 防除 なら び に、 衛 生 害 虫 の 防 除 に 広 く 利 用 さ れ て い る 。BめlLrmgiensis菌 は 、主 とし て土 壌か ら 分離 さ れ る が 、 死亡 昆虫 や植 物 の葉 から も分 離 され る。 また 、本 細 菌が 保有 する 殺虫 性 タン パ ク 質 遺 伝 子(ciy gene)は 、 遺 伝 子 組 換 え 耐 虫 性 作 物 の 作 出 にも 利用 され 、近 年 注目 を あび てい る。
本 研 究 で は 、 東 南 ア ジ ア の 農 作 物 に お い て 重 要 な 害 虫 で あ る 、 ハ ス モ ン ヨ ト ウ (Spodopt,eraガt【u弧 ）に対し強い殺虫活性を有 するB曲こUh醤油コs．お菌株 の検索ならび に 、 そ の 菌 株 の 有 す る 殺 虫 性 タ ン パ ク質 遺伝 子（aツ 遺伝 子 ）の クロ ーニ ング と 塩基 配 列 の 決 定 を行 った 。ま た 、そ の結 晶タ ン パク 質が 鱗翅 目昆 虫 に殺 虫活 性を 示す 際 、対 象 昆虫 の細 胞膜 上の 受 容体 タン パク 質（recepめrprotein） に結 合し 、 細胞膜 に穴をあけ昆 虫 を 死 亡 さ せ る こ と が 知 ら れ て い る こ と か ら 、 受 容 体 に つ い て も 検 討 を 行 っ た 。
］ ， ハ ス モ ン ヨ ト ウ に 対 し 殺 虫 活 性 を 有 す るB.必ur面 ぎf凹 蝣 菌 株 の 検 索 本研究室保 存の、Bめぇ曲】ぎ：向J蝣標 準株ならびに、分離株のt「 ｜から、ハスモンヨト ウ に殺 虫活 性を 有 するBめ｛H心 轡たwsお菌株の検 索を行った結果、標準株の中 で、serovar 凹Jめ册0C耐us株とSubSp．II′uカan田】s．嵒株が、また、土壌から分離された分離株について は 、SeroVaraぬSガKMK9．20，SerOVar凹 加D捌uSKM194‐4‐3，SeroVar出j伽Sぬ ぬ】 蝣 KHU．A．1が殺 虫活性を有していた。
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彦 徳
郎 郎
一
敏 久
一 眞
塚 戸
田 野
飯 伴
上 浅
授 授
授 授
教
教 教
教 助
査 査
査 査
主 副
副 副
2． subsp. wuhanensis株 の cryl遺 伝 子 の ク ロ ー ニ ン グ と 塩 巌 配 列 決 定 ハスモンヨトウに対して殺虫活性を有していた、Bめurm餌印sお標準株の中、subs｜｝．
げu由a口飢sお 株がより 強い殺虫 活性を 有していたことから、この菌株を用いて、PCR 法によりルル遺伝子の同定を行ったところ、cり′｜46、cザヱ4cならびに餌y｜D遺伝子を 有している事が明らかになった。cり′ヱ46遺伝子にっいては、既に中谷ら（1994）によ り々ロー ニング ならびに塩基配列決定がなされており、カイコ（」めmめばmD襾に対し ては殺虫活性を有していない事が明らかとなっている。従って、カイコに殺虫活性を有 すると報告されているザy｜D遺伝子のクローニングならびに塩基配列決定を行った。そ の結果、約135kDa（3400bp）のタン／くク質をコート するcり′亅ヱ油Iレ遺伝子がク口ーニ ングされた。このルヅ矼めげ遺伝子の塩基配列の決定を行ったところ、しambertー（1993） が報告したcり′｜Z砧遺伝子と全く同じであることが明らかとなった。さらに、叩′｜口61レ 遺伝子を大腸繭で発現させた後、そのタンパク質の殺虫活性について、ハスモンヨ卜ウ、
カイコ、 コナガ について調査した。供試した3種の昆虫の幼虫すべてにおいて殺虫活性 が認められ、ハスモンヨトウならびにカイコについては強い殺虫活性を示した。このこ とより、subsp．Iyu由a口朗sお株の有するカイコに対する強い殺虫活性は、cり′｜D61ゲ遺伝 子によるものであることが明らかとなった。
3． subsp．wu五a口伽 曲株殺 虫性タン パク質に 対する 数種鱗翅 目昆虫 の受容体タン パク質の検出
且めcu曲轡加s．嵒の殺虫性結晶タンパク質に対する受容体は、感受性昆虫の幼虫の中 腸上皮組 織細胞 のBrusbBorderMembraneVesicles（BBMV）に 存在す るといわれ、受容 体として、アミノベプチデースNやカドヘリン様タン／くク質が報告されている。そこで subsp．げuカan凹s お株の結晶タンパク質の数種鱗翅目昆虫幼虫におけるこのクン／くク質 に対する受容体の解析を行った。受容体の解析に供試した鱗翅目昆虫は、カイコ、コナ ガ、マイマイガ（ら′manむぬd嵒pa′）、オオモンシロチョウ（Aぬお6朋ss丘．．ae）とし、
それぞれの幼虫からBBMVを精製した。subsp．Iyuカa朋田】sお株からクローニングされた、
ロyん4みげ遺伝子とりyn砧1ゲ遺伝子それぞれのコードするタンパク質（Cry1八bwならび CrylDbwタ ンパ ク 質 ）と 供 試 昆虫 か ら 精 製し たBBMVと の結 合 検 定（bindmgassay） を行い、 受容体 タンパク質の検出を行った。その結果、CrylAbwに対するカイコの受容 体として 、アミ ノベプチデースNが、CrylDbwに対するカイコの受容fホとして、アミノ ペプチデースNとカドヘリン様タンノミク質が、検出された。カイコ以外の昆u｀としては、
コナガにおける受容体は、アミノペプチデースNが検出された。マイマイプ´．オオモン シ ロ チ ョ ウ に つ い て は 、 結 合 検 定 の 結 果 か ら 受 容 体 は 検 出 さ れ な か っ た 。 以上のように本研究は、農業上重要な害虫であるハスモンヨトウ防除に有効な殺虫性 夕ンパク質遺伝子と、その殺虫活性発現に関わっている受容体クンパク質をf川らかにし たもので、学術的にも応用面でも高く評価される。
よって審査員一同は，ユリア・プジヤスツチが博士（農学）の学位を受けるのにf．//｝ な資格を有するものと認めた。
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