九州大学学術情報リポジトリ
Kyushu University Institutional Repository
口腔癌原発巣と頸部リンパ節転移巣から樹立した細 胞株における生物学的特性と網羅的遺伝子解析
藤永, 貴大
http://hdl.handle.net/2324/1441158
出版情報：Kyushu University, 2013, 博士（歯学）, 課程博士 バージョン：
権利関係：Public access to the fulltext file is restricted for unavoidable reason (2)
論 文 題 目 口腔癌原発巣と頸部リンパ節転移巣より樹立した 細胞株における生物学的特性と網羅的遺伝子解析
氏 名 藤 永 貴 大
論 文 内 容 の 要 旨
口 腔 癌 に 限 ら ず 、 あ ら ゆ る 癌 の 予 後 向 上 に は 、 原 発 巣 の 制 御 に 加 え て 転 移 巣 の 制 御 が 重 要 で あ る 。 こ れ ま で 転 移 に 関 す る 研 究 報 告 は 、 切 除 物 の 原 発 巣 と 転 移 巣 を 組 織 学 的 に 検 討 し た も の が 多 か っ た が 、 同 一 患 者 の 原 発 巣 と 転 移 巣 か ら 細 胞 株 を 樹 立 す る こ と が 困 難 で あ っ た た め に 細 胞 株 を 使 っ て 検 討 し た も の は 少 な か っ た 。 口 腔 領 域 に お い て 、 同 一 患 者 よ り 樹 立 さ れ た 細 胞 株 に は 、 舌 癌 と 頸 部 リ ン パ 節 転 移 巣 か ら Easty ら の 樹 立 し た HN-6、HN-6n1、
HN-6n2や 、 信 森 ら の 樹 立 し た KK-p、KK-m な ど が あ る 。 そ れ ら の 報 告 で は 、 原 発 巣 と 転 移 巣 で は 生 物 学 的 特 性 が 異 な っ て い る と 考 え ら れ て い る が 、 網 羅 的 な 遺 伝 子 解 析 を 行 っ た 報 告 は 少 な い た め さ ら な る 検 討 が 必 要 で あ る 。 本 研 究 で は 、 下 顎 歯 肉 扁 平 上 皮 癌 患 者 の 原 発 巣 由 来 細 胞 株（ WK2 ）と 後 発 頸 部 リ ン パ 節 転 移 巣 由 来 細 胞 株（ WK3F ）の 樹 立 に 成 功 し た 。 そ の 2 つ の 癌 細 胞 株 に つ い て 、 網 羅 的 な 遺 伝 子 解 析 を 行 い 、 転 移 関 連 遺 伝 子 に つ い て 生 物 学 的 特 性 を 踏 ま え て 検 討 し た 。 こ の 手 法 は 、 生 体 内 を よ り 反 映 し た 解 析 法 で 、 転 移 機 構 の 解 明 や 治 療 の 標 的 遺 伝 子 の 発 見 に 役 立 つ も の と 考 え ら れ た 。
in vitro に お い て 生 物 学 的 特 性 を 比 較 す る と 、WK3F は WK2 と 比 べ MTT assay で 細 胞 増 殖 能 が 高 く 、 細 胞 倍 加 時 間 も 短 縮 さ れ た 。Wound healing assay で 細 胞 遊 走 能 は 向 上 し 、 原 発 巣 離 脱 モ デ ル に お い て も 浸 潤 能 も 高 か っ た 。血 管 内 皮 細 胞（ HUVECs ）へ の 細 胞 接 着 能 は 、 WK3F は WK2 よ り も 高 か っ た 。Sphere forming assay に よ る 自 己 複 製 能 に お い て も 、 ス フ ェ ア 形 成 数 が 多 く 、 直 径 も 大 き か っ た 。 ヌ ー ド マ ウ ス 異 種 移 植 に よ る 造 腫 瘍 能 ・ 転 移 能 の 検 討 を し た と こ ろ 、緑 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 を 導 入 し た WK2-GFP と 比 較 し て 、赤 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 を 導 入 し た WK3F-RFP で は 腫 瘍 形 成 率 と 頸 部 リ ン パ 節 転 移 率 が 上 昇 し た 。こ れ に よ り in vivo に お い て も WK3F の 方 が WK2 よ り 造 腫 瘍 能 お よ び 転 移 能 に 優 れ た 細 胞 株 で あ る こ と が 証 明 さ れ た 。
WK2 と WK3F の 発 現 遺 伝 子 の 変 化 を マ イ ク ロ ア レ イ 法 で 50599 種 の 遺 伝 子 プ ロ ー ブ を 用 い て 網 羅 的 に 解 析 し た 。 発 現 が 増 幅 し た も の を Z-score ≥ 2.0 and ratio ≥ 5.0、 発 現 が 減 少 し た も の を Z-score ≤ -2.0 and ratio ≤ 0.2と し て 抽 出 し 、 そ こ か ら 癌 や 転 移 に 関 連 す る 遺 伝 子 候 補 を 上 位 、下 位 よ り 15 位 ず つ 選 別 し た 。WK2 に 比 べ て WK3F に 発 現 が 亢 進 し た 転 移 関 連 遺 伝 子 候 補 は 、転 移 性 悪 性 黒 色 腫 で 高 発 現 し て い る MAGEC1（ melanoma antigen family C,
区 分 ○甲 乙
1 ）、大 腸 癌 の 浸 潤 転 移 に 関 連 す る MMP-7（ matrix metalloproteinase-7 ）、E-cadherinの 転 写 抑 制 に 関 連 す る SNAI1（ snail homolog 1 ）、 大 腸 癌 の 転 移 関 連 遺 伝 子 で あ る MACC1
（ metastasis associated in colon cancer 1 ） で あ っ た 。 発 現 が 低 下 し た 遺 伝 子 は 、 子 宮 内 膜 癌 の 転 移 能 と 予 後 に 関 わ っ て い る と 推 測 さ れ て い る HTRA1（ HtrA serine peptidase 1 ） で あ っ た 。
癌 細 胞 は 、 上 皮 間 葉 移 行 （ EMT : epithelial-mesenchymal transition ） を 起 こ し 、 よ り 遊 走 性 の 高 い 間 葉 系 細 胞 の 表 現 型 を 獲 得 し て 転 移 を 起 こ す と い わ れ て い る 。 培 養 像 で は 、WK3F の 一 部 に 線 維 芽 細 胞 様 の 形 態 を も っ た 癌 細 胞 を 認 め 、 前 述 の ご と く 遊 走 性 が 高 か っ た 。 マ イ ク ロ ア レ イ の 結 果 で は 、SNAIl 以 外 の EMT 関 連 マ ー カ ー に 大 き な 差 異 は 認 め な か っ た が 、 転 移 関 連 遺 伝 子 、 細 胞 増 殖 調 節 因 子 、 接 着 分 子 、 細 胞 外 基 質 分 解 酵 素 に 差 異 を 認 め た 。 こ れ ら の 分 子 は 転 移 巣 の 癌 細 胞 の 特 性 （ 転 移 機 構 ） を 解 明 す る 上 で 重 要 で あ り 、 治 療 の 標 的 因 子 と な り う る こ と が 示 唆 さ れ た 。
