ビスフェノールA によるプロテインジスルフィドイ ソメラーゼの活性阻害の機構解明
著者 芝野 智久
URL http://hdl.handle.net/10236/6475
2009年 度 修 士 論 文 要 旨
ビ ス フ ェ ノ ー ル ビ ス フ ェ ノ ー ル ビ ス フ ェ ノ ー ル
ビ ス フ ェ ノ ー ル A A A A に よ る に よ る に よ る に よ る プ ロ テ イ ン ジ ス ル フ ィ ド イ ソ メ ラ ー ゼ プ ロ テ イ ン ジ ス ル フ ィ ド イ ソ メ ラ ー ゼ プ ロ テ イ ン ジ ス ル フ ィ ド イ ソ メ ラ ー ゼ プ ロ テ イ ン ジ ス ル フ ィ ド イ ソ メ ラ ー ゼ の
の の
の 活 性 阻 害 活 性 阻 害 活 性 阻 害 の 活 性 阻 害 の の の 機 構 解 明 機 構 解 明 機 構 解 明 機 構 解 明
関 西 学 院 大 学 大 学 院 理 工 学 研 究 科 化 学 専 攻 山 口 研 究 室 芝 野 智 久
ビ ス フ ェ ノ ー ル A(BPA)は 生 物 の 生 殖 機 能 を 乱 す ホ ル モ ン 様 作 用 を 示 す こ と が 知 ら れ そ の 作 用 に つ い て 多 く の 研 究 が 行 わ れ て い る 。さ ら に ，近 年 BPAが 脳 や 中 枢 神 経 系 の 機 能 へ 影 響 す る と い う こ と が 報 告 さ れ た 。 こ の 原 因 の 解 明 を 目 的 と し て ，共 同 研 究 者 の 今 岡 ら に よ っ て ，BPA ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム を 用 い て ， ラ ッ ト 脳 内 に お け る BPAの 標 的 タ ン パ ク 質 が 探 索 さ れ た 。そ の 結 果 ，ラ ッ ト 脳 よ り 抽 出 さ れ た BPA結 合 タ ン パ ク 質 の ア ミ ノ 酸 分 析 に よ り ，そ れ が プ ロ テ イ ン ジ ス ル フ ィ ド イ ソ メ ラ ー ゼ(PDI)で あ る と 同 定 さ れ た 。PDIは 小 胞 体 内 に 存 在 す る 56 kDa の タ ン パ ク 質 で あ り ，ミ ス フ ォ ー ル ド タ ン パ ク 質 や 新 生 タ ン パ ク 質 の ジ ス ル フ ィ ド 結 合 の 形 成 ， 還 元 ， 異 性 化 を 担 う こ と が 知 ら れ て お り ，N 末 端 側 か ら a，b，b’，a’，c ド メ イ ン 領 域 に よ り 構 成 さ れ て い る 。PDIは こ の よ う な ジ ス ル フ ィ ド イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 以 外 に も 様 々 な 機 能 を 持 つ 多 機 能 タ ン パ ク 質 で あ り ， ジ ス ル フ ィ ド 結 合 を 持 た な い タ ン パ ク 質 に 対 し て も フ ォ ー ル デ ィ ン グ を 促 進 さ せ る シ ャ ペ ロ ン 機 能 を 持 つ こ と や ， プ ロ リ ン 水 酸 化 酵 素 の β サ ブ ユ ニ ッ ト と し て の 機 能 を 有 し α サ ブ ユ ニ ッ ト の 構 造 を 安 定 化 さ せ る 機 能 な ど が 明 ら か に な っ て い る 。さ ら に ，BPAが PDIの イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 を 阻 害 す る と い う こ と が 報 告 さ れ て い る 。 ド メ イ ン 単 位 で の 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 法 を 用 い た 解 析 結 果 か ら ，PDI の BPA 結 合 ド メ イ ン は a’と b’ド メ イ ン で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た ， ド メ イ ン 単 位 の イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 測 定 に よ っ て ，BPA が b’ド メ イ ン に 結 合 す る こ と で ，イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 が 引 き 起 こ さ れ る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 つ ま り ，BPAが PDIの 活 性 中 心 に 直 接 的 に 相 互 作 用 す る こ と で ，イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 す る の で は 無 く ， 他 の ア ミ ノ 酸 残 基 に 特 異 的 に 結 合 す る こ と に よ り ， 基 質 の 結 合 阻 害 や PDIの 構 造 変 化 な ど を 引 き 起 こ し て イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 を 阻 害 し て い る と 考 え ら れ た 。し か し な が ら ，BPAが PDIの 立 体 構 造 に 与 え る 影 響 に つ い て の 知 見 は 得 ら れ て い な い 。そ こ で ，構 造 学 的 な 見 地 か ら BPAが ど の よ う に し て PDI の イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 を 引 き 起 こ す の か を 明 ら か に す る た め に ， 円 偏 光 二 色 性 分 光 法 ， 質 量 分 析 法 ， 示 差 走 査 熱 量 計 法 ， 動 的 光 散 乱 法 や X 線 回 折 法 を 用 い て の 多 角 的 な 解 析 に 着 手 し た 。
PDI を 大 腸 菌 発 現 系 を 用 い て 大 量 発 現 さ せ ， 各 種 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ る
精 製 を 行 い ，SDS-PAGEに よ り 単 一 の バ ン ド を 示 す 試 料 を 得 た 。まず，BPA や そ の類 縁体 を添 加し た時の PDIの 二次 ・ 三 次構 造 変 化 を調 べる た め に 円 偏 光 二 色 性 測 定 を 行 な っ た 。 そ の 結 果 ， 二次構 造 の 変 化 は観測 さ れ な か っ た が ， 近紫 外部の ス ペ ク ト ル 変 化 か ら PDIの芳 香 族側鎖 周 辺の微 細な 構 造 に 変 化 が 起 き て い る こ と が わ か っ た 。こ れ に よ り ，BPAの イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 は PDIの 立 体 構 造 の 変 化 に 起 因 す る と い う こ と が 考 え ら れ た 。次に ，BPAが PDIの 立 体 構 造 の 安 定 性 に 与 え る 影 響 を評 価す る た め に 示 差 走 査 熱 量 計 に よ る 熱 解 析 を 行 な っ た 。 そ の 結 果 ，BPA を添 加す る こ と に よ り ， 構 造 安 定 性 の指標 で あ る Tm値が 上 昇し ，PDIの 立 体 構 造 が 安 定 化 し た と 考 え ら れ た 。 こ の こ と よ り ，BPAに よ る イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 は PDIの 構 造 の不安 定 化 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る も の で は な く ，BPA が PDI に 結 合 す る こ と で PDI の フレ キシ ブ ル な 構 造 を リ ジ ッ ド に す る こ と に よ り 引 き 起 こ さ れ る こ と が 示唆さ れ た 。
次に ， こ の 構 造 の 安 定 化 に よ る イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 の 機 構 の 解 明 と ド メ イ
ン 単 位 で BPA が PDI の 構 造 に ど の よ う な 影 響 を 与 え て い る の か を 明 ら か に す る た め に ，bb’ド メ イ ン とa’cド メ イ ン の 円 偏 光 二 色 性 測 定 と 質 量 分 析 を 行 っ た 。 円 偏 光 二 色 性 測 定 の 結 果 ，a’c ド メ イ ン に お け る ス ペ ク ト ル 変 化 は観測 さ れず，
二次 ・ 三 次構 造 変 化 は 起 き な い こ と が わ か っ た 。 一方，bb’ド メ イ ン で は 近紫外 部で は濃度依存 的 に 大 き な ス ペ ク ト ル 変 化 が 生じた 。 こ れ よ り ，BPA は bb’ド メ イ ン 内 の芳 香 族 鎖 周 辺で微 細な 構 造 変 化 を 引 き 起 こ す こ と が わ か っ た 。次に ， MALDI-TOF/MS を 用 い て、bb’ド メ イ ン と a’c ド メ イ ン の 質 量 分 析 を 行 っ た 。
そ の 結 果 ， ド メ イ ン 領 域 に 対応す るピー ク は検出 で き た が ，BPA を添 加す る こ と に よ る 質 量増 加を検出 す る こ と は で き な か っ た 。こ れ は TOF/MSに お け るレ ーザー照 射に よ っ て ，PDI と BPA間の 相 互 作 用 が切り離さ れ た こ と を 示 し ，つ ま り BPA の PDI 各 ド メ イ ン に 対 す る 相 互 作 用 が 共 有 結 合 と い っ た強い 相 互 作 用 で な い こ と を 明 ら か に し た 。
さ ら に ，BPAに よ る PDIの イ ソ メ ラ ー ゼ 活 性 阻 害 の 作 用 機 構 を 原子 レ ベル で 理 解 す る た め に ，PDI，bb’ド メ イ ン と a’c ド メ イ ン の X 線 結晶解 析 に向け た 精 製・結晶化 を 試みた 。 そ の 結 果 ，bb’ド メ イ ン 単 体 と及 び bb’ド メ イ ン と BPA の 複合 体 に つ い て 単 結晶を 得 る こ と に 成功し た 。 そ し て ，X 線源に シ ン ク ロ ト ロ ン放 射光(SPring-8，BL44XU)を 用 い ， こ れ ら の 結晶に つ い て X 線 回 折実 験を 行 っ た 。 そ の 結 果 ， 得 ら れ た 回 折点か ら ， 結晶は タ ン パ ク 質 の も の で あ る と 考 え ら た が ， 分 解 能 が低く ， 解 析 に は適さ な い事が 明 ら か に な っ た 。 今後，高分 解 能 の 回 折 を 与 え る 結晶を 得 る た め に ， 今 回 ， 結晶が 析 出 し た条 件を 中 心 と し て ，pHや沈 殿 剤 濃度 な ど を 変 化 さ せ て 結晶化条 件の 精密化 を 行 う必要 が あ る 。
