Ribozyme targeting of receptor for advanced glycation end products in mouse mesangial cells

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(1)Title. Author(s). Citation. Issue Date. URL. Ribozyme targeting of receptor for advanced glycation end products in mouse mesangial cells( Abstract_要旨 ). Tsuji, Hiroko. 京都大学. 1998-09-24. http://hdl.handle.net/2433/182259. Right. Type. Textversion. Thesis or Dissertation. none. Kyoto University.

(2) 氏. 名. 蓮. 詣. 享. (医. 学). 学 位 (専 攻 分 野 ). 博. 学 位 記 番 号. 医. 学 位 授 与 の 目付. 平 成 10 年. 学位授 与 の要件. 学 位 規 則 第. 研 究 科 ・専 攻. 医 学 研 究 科 内 科 系 専 攻. 学 位 論 文 題 目. Ri boz ymet a r ge t i ngofr ec e pt orf ora dva nced glycation end products in mous e. 士 博. 第. 2048 号 9 月 24 日 4 条 第. 1 項 該. 当. mes a ngi alc el l s ( マ ウス メサ ンギ ウム細 胞 にお け る リボ. ザ イ ム を用 い た糖 化 終. 末産物 受. 容 体 の タ- ゲ ッテ ィ ン グ) ( 主査) 論 文 調 査 委 員. 教 授. 月 田承 一 郎. 論. 文. 教 授. 内. 容. 中 尾. の. -. 要. 和. 教. 授. 北. 徹. 旨. 糖尿病性 腎症 は,欧米 をは じめ我 が国において も,末期 腎不全 に至 る主要 な原 因疾患である。 その主たる病変は,糸球体 硬化症であ り,Ⅳ型 コラーゲンを中心 とす る細胞外基質の増生 を特徴 としてい る。糖尿病状態では,糖化終末産物 が産生, 蓄積 され血管合併症の主要 な原因である とされてい る。 また,糖化終末産物 はその受容体 を介 して生物学的作用 を及 ぼす と. r e c e pt o rf o radvanc e dgl yc at i o ne nd 考 え られ てい る. 本研 究 においては,糖化 終末産物 の受容 体 の一つ で あ るRAGE ( pr o duc t s ) と,メサ ンギ ウム細胞 にお ける糖化終末産物 に よる細胞外基質産生の克進 との関係 について検討 した。その方法 として,受容体 と生物学的効果 の関連 を明瞭 にす るため,RAGE特異的ハ ンマー- ツ ド型 リボザイ ムを用いてRAGE発現の 抑制 を行 った。 本研 究 において用いた リボザイムは, 自己切断能 を持つ リボザイム とRAGE特異的 リボザイ ムをタンデムに結合 させ た構 造 を有 してい る。i nvi t r oにお ける検討 では, リボザイ ムが 自己切断能,及 び リボザイムの基質 であるRAGEのRNAの切 断 能 を有 してい ることを確認 した。 この リボザイ ムをSRαプ ロモー ター, Hyg r o myc i nB耐性遺伝子 を有す る発現ベ クター に組 みか えて, リボフェク トア ミンを用いてマ ウスメサ ンギ ウム細胞 に導入 し,s t a bl ec e l ll i neを作製 した。細胞 内で転写 され てできた リボザイムは,特異的切 断 をお こし,RAGEのメ ッセ ンジャーRNAレベル を低 下 させ た。 この ことは,RNa s. eプ ロテ クシ ョンア ッセイ及び,RTPCR ( r e ve r s et r ans c r i pt i o npo l yme r as ec hai nr e ac t i o n) を用いて確認 した。 この培 2 継代 まで保持 され,抑制効果 が 養 メサ ンギ ウム細胞 にお ける リボザイ ムによるRAGE発現抑制効果 は, リボザイム導入後 1 アンチセ ンスの よ うに一過性 ではない ことが示 された。 次 に,RAGEに対す る単 クロー ン抗体 を用いて,免疫組織染色 を行い,蛋 白レベル で もRAGEが抑制 されてい ることを確 認 した。 Ⅴ型 コラーゲンの産生の挙動 を 上述のRAGEに対す る特異的 リボザイ ムを導入 した細胞 に対 し,糖化終末産物 を負荷 してⅠ 検討 した。対照のメサ ンギ ウム細胞 において糖化終末産物 の負荷 によって,Ⅳ型 コラーゲ ンの上昇 が見 られ るのに対 し,R. AGE特異的 リボザイム導入細胞 ではⅣ型 コラーゲ ンの上昇の抑制がみ られた。 以上 よ り,培養 メサ ンギ ウム細胞 での糖化終末産物 による,Ⅳ型 コラーゲ ン産生の上昇 には,RAGEが関与 してい ること が示 された。 この ことか ら,RAGEは糖尿病性糸球体病変 の形成 にも関与 してい ることが示唆 され,また,RAGEを抑制す るこ とは,病変進行 の抑制 につなが る可能性 を有す ると考 え られ る。- ンマ-- ツ ド型 リボザイムについては,実験的手段 として,す なはち本研 究 にお けるよ うな発現抑制系モデル作製 の手段 として有効 であること, さらに治療法 としての応用の可能性 が示唆 された。. -. 45 3-.

(3) 論. 文. 審. 査. の. 結. 果. の. 要. 旨. 糖尿病性 腎症 は,欧米 をは じめ我 が国において も,末期腎不全 に至 る主要な原 因疾患である。その主病変 は,糸球体硬化. AGE)が 症 であ り,Ⅳ型 コラーゲ ンを中心 とす る細胞外基質 の増生 を特徴 としてい る。糖尿病状態では,糖化終末産物 ( 産生,蓄積 され 腎症 を含む合併症 の重要 な原 因物質 の一つである とされ てい る。 また,AGEはその受容体 を介 して生物学 的作用 を及 ぼす と考 え られ てい る。本研 究 においては,糸球体硬化症 の発症進展 に関与す る機序の解 明の一端 として,AG. E受容体 の一つで あるRAGE ( r e c e pt o rf o radvanc edg l yc at i o ne ndpr oduc t s ) と, メサ ンギ ウム細胞 にお けるAGEによる 細胞外基質産生 の上昇 との関係 について検討 した。 その方法 として,受容体 と生物学的効果 の関連 を明瞭 にす るため,RA. GE特異的ハ ンマー- ツ ド型 リボザイムを用いてRAGE発現の抑制 を行 った。 本研究 において用いた リボザイムは, 自己切 断能 を持つ リボザイム とRAGE特異的 リボザイムをタンデ ムに結合 させた構 造 を有 してい る。 この リボザイ ムについては, まず 自己切断能,及び リボザイ ムの基質 であるRAGEのRNAの切断能 をi n. i vt r oで確認 した。 この リボザイムをマ ウスメサ ンギ クム細胞 に導入 し,s t a bl ec e l ll i neを作製 した。細胞 内で転写 されてで きた リボザイ ムは,特異的切 断 をお こ し,RAGEのメ ッセ ンジャーRNAレベル を低 下 させ た。 この こ とは,RNa s eプ ロテ. PCR ( r e ve r s et r ans c r i pt i o npo l yme r as ec hai nr e ac t i o n) を用いて確認 した。 この培養 メサ クシ ョンア ッセイ及 び,RTンギ ウム細胞 にお ける リボザイムに よるRAGE発現抑制効果 は,継代 を重ねて も保持 され,抑制効果がア ンチセ ンスのよ う に一過性ではない ことが示 された。RAGE特異的 リボザイム導入細胞 に,RAGEに対す る単 クロー ン抗体 を用いた免疫組織 染色 を行い,蛋 白レベルで もRAGEが抑制 されてい ることを確認 した。. RAGE特異的 リボザイ ム導入細胞 に対 し,AGEを負荷 してⅣ型 コラーゲ ンの産生の挙動 を検討 した。対 照のメサ ンギ ウ ム細胞 においAGEの負荷 によって,Ⅳ型 コラーゲ ンの上昇 が見 られ るのに対 し,RAGE特異的 リボザイ ム導入細胞ではⅣ 型 コラー ゲ ンの上昇 の抑制 が見 られ た。培養 メサ ンギ ウム細胞 でのAGEによる,Ⅳ型 コラーゲ ン産生 の上昇 には,RAGE が関与 してい ることが示 された。 この ことか ら,RAGEは糖尿病性糸球体病変の形成 に関与 してい ることが示唆 され,また,. RAGEを抑制す ることは,病変進行 の抑制 につ なが る可能性 を有す る と考 えられた。ハ ンマー- ツ ド型 リボザイムについて は,実験的手段 として,す なわち本研 究におけるよ うな発現抑制系モデル作製の手段 として有効であること, さらに治療法 としての応用-の可能性が示唆 され た。 以上の研究 は,糖尿病性腎症の発症,進展機序の解 明に貢献 し,糖尿病性合併症 の治療 に寄与す ることが期待 され る。 従 って,本論文 は博士 ( 医学)の学位論文 として価値 あるもの と認 め る。 0年 7月 1 0日実施 の論文内容 とそれ に関連 した試 問を受 けて合格 と認 め られた ものであ なお,本学位授与 申請者 は,平成 1. る。. -. 454-.

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