胚中心の分子生物学
免疫系における新規細胞増殖関連分子
・
桑原 一彦 ・吉 田 尊 ・阪 口 薫 雄
胚中心は成熟B細 胞の選択の場として近年注目されている.抗原に対して高親和性をも
つ抗体を産生する (
つまり高親和性の免疫グロブリンを発現するB細 胞を選別する)機構
を理解するうえで,胚中心での分子機構を研究することはきわめて重要である.筆者らは
胚中心B細 胞で発現が上昇する分子の同定を行ない,セントロサイトで発現が上昇する新
規核内因子GANPを
見いだした.GANPはDNA複
製に必須の分子MCM3と
会合してい
ることより,胚中心における細胞増殖制御に関与する分子であることが示唆された.
【胚 中 心 】 【B細 胞 選 択 】 【セ ン トロ サ イ ト】 【細 胞 複 製 】 は じめ に 生 体 が 外 界 か らの 異 物 に対 し て 免 疫 応 答 を 起 こす 際 に , 最 初 の ト リガ ー と し て重 要 な イ ベ ン トは 成 熟B細 胞 表 面 上 の 免 疫 グ ロ ブ リ ン (immunoglo− bulin;Ig) 分 子 に よ る抗 原 認 識 で あ る.Burnetの クロ ー ン選 択 説 で 提 唱 され た よ う に,Ig分 子 は109種 類 に も及 ぶ 外 来 抗 原 に反 応 で き る よ う な多 様 性 を あ らか じ め 備 え てお り, こ の 多 様 性 は,VDJ再 構 成 , 体 細 胞 突 然 変 異 な ど に よ っ て 獲 得 され る1). 血 液 幹 細 胞 か ら未 熟 B細 胞 まで のB細 胞 の 分 化 は 骨 髄 中 で 抗 原 非 依 存 的 に 行 な わ れ る .そ の 後 ,末 梢 リンパ 組 織 に移 動 したB細 胞 は 抗 原 依 存 的 に分 化 し て い く と考 え ら れ て い る. 後 者 に 関 して は末 梢 リ ン パ 組 織 に お け る胚 中 心 (germinal center) がT細 胞 依 存 性 のB細 胞 選 択 機 構 として 重 要 な働 き を し て い る こ とが 最 近 と くに 注 目 さ れ て い る2). 胚 中 心 と は , も と も と形 態 学 的 な 名 称 で , ヒ ツ ジ赤 血 球 な どのT細 胞 依 存 性 抗 原 (TD抗 原 ) を 免 疫 した 際 に 見 られ る 末 梢 リ ンパ 組 織 の 二 次 濾 胞 内 に 形 成 され る領 域 を 指 す . 胚 中 心 は 免 疫 系 の高 次 機 能 の 中 枢 と し て重 要 で ,“胚 中 心 は免 疫 応 答 にお い て, 高 親 和 性 の 抗 原 特 異 的B細 胞 の 産 生 と抗 体 産 生 を正 常 に起 こさ せ る た め に 必 要 で あ る ” こ とが 明 らか に され つ つ あ る. 最 初 の ス テ ッ プ と して , 抗 原 特 異 的Ig分 子 を細 胞 表 面 に もつ 成 熟B細 胞 が 抗 原 に 出 会 う と,Ig分 子 を介 して細 胞 内 に シ グ ナ ル が 入 り, 活 発 に細 胞 分 裂 を く り返 し て 増 殖 す る よ う に な る . これ は 胚 中 心 の 暗 帯 と よ ば れ る 領 域 で 行 な わ れ る. さ ら に増 殖 したB細 胞 は胚 中 心 の 明 帯 に移 動 し, 細 胞 分 裂 を止 め て 抗 原 に 対 して 高 い親 和 性 のIg分 子 を もつB細 胞 だ けが 生 き残 るよ う に選 択 を受 け, そ の ほ か の細 胞 (つ ま り抗 原 に 対 して 低 親 和 性 のIg分 子 を も つB細 胞 や 自 己 抗 原 を認 識 す るIg分 子 を も つB細 胞 )は ア ポ トー シ ス に よ っ て 除 去 さ れ る と考 え ら れ て い る3). こ れ を 親 和 性 の 成 熟 (affinity maturation) と よぶ . 選 択 さ れ たB細 胞 は, こ の あ と 濾 胞 樹 状 細 胞 (follicular dendritic cel1;FDC) お よ び ヘ ル パ ーT細 胞 か ら の 刺 激 を 受 け, ク ラ ス ス イ ッ チ を受 け た の ち , あ る もの は 抗 原 特 異 的 抗 体 産 生 細 胞 にKazuhiko Kuwahara,Mikoto Yoshida,Nobuo Sakaguchi, 熊 本 大 学 医 学 部 免 疫 学 (〒860-0811熊 本 市 本 荘2-2-1) [Depart-ment of Immunology,Kumamoto University School of Medicine,Honjo,Kumamoto860-0811,Japan]E-mail:kazukuwa@
kaiju.medic.kumamoto-u.ac.jp
Molecular Biology of Germinal Center:A Novel Cell Proliferation-related Protein in Immune System
2
蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol.45No,10(2000) 化 に お け る 機 能 を 中 心 に紹 介 す る.Ⅰ
図1 胚 中 心 で のB細 胞 選 択 抗 原 特 異 的B細 胞 はT細 胞 領 域 で あ るPALSに て 活性 化 され , セ ン トロ ブラ ス トに な り胚 中 心 の 暗 帯 で活 発 な細 胞 分 裂 を く り返 す . こ の領 域 で体 細胞 突 然 変 異 を受 け る . そ の 後 , セ ン トロ ブ ラス トは セ ン トロ サ イ トに分 化 し, 明 帯 に てFDCやCD4+T細 胞 か ら の刺 激 を受 けて , 高 親 和 性 のIg分 子 を も つ ク ロ ー ン の み が選 択 され, その 後 , 抗 体 産 生 細 胞 や 記 憶B細 胞 に分 化 して い く.CB: セ ン トロ ブ ラ ス ト,CC: セ ン トロサ イ ト,T:CD4+T細 胞 .?: ア ポ トー シ ス に 陥 っ た細 胞 . 分 化 し, あ る もの は記 憶B細 胞 に分 化 し, 次 回 の抗 原 刺 激 に 素 早 く反 応 で き る よ う に し て い る4). こ の よ うに胚 中 心 に 関 す る研 究 は, 抗 原 特 異 的B細 胞 に ① 親 和 性 の 成 熟 , ② ク ラ ス ス イ ッ チ , ③ 記 憶B 細 胞 へ の 分 化 を誘 導 す る機 構 を 理 解 す る う えで 非 常 に 重 要 で あ り, 成 熟B細 胞 分 化 の場 と して 最 も注 目 さ れ て い る 分 野 で あ る. 筆 者 ら は 胚 中 心 で のB細 胞 分 化 , 成 熟 の 分 子 機 構 を 明 ら か に す る 目 的 で , 胚 中 心 のB細 胞 で 発 現 が 上 昇 して い る 分 子 の 同 定 を行 な って きた . そ の結 果 , 胚 中 心 , と くに セ ン トロ サ イ トが 存 在 す る明 帯 で 発 現 が 上 昇 し て い る新 規 核 内 因 子GANP(ger・ minal center-associated nuclear protein) を 見 い だし, そ の構 造 を 決 定 し た5).
本 稿 で は , 現 在 ま で に 明 らか に な っ て い る胚 中 心 の 分 子 機 構 につ い て概 説 し, さ らにGANPのB細 胞 活 性
略 号 FDC:follicular dendriti ccell
GANP:germinal center-associated nuclear protein MCM:minichromosome maintenance PNA:peanut agglutinin TD抗 原 に よ る刺 激 を受 け たB細 胞 は 末 梢 リンパ 組 織 に 集 積 し, まずT細 胞 領 域 で あ る動 脈 周 囲 リ ンパ 鞘 (periar-teriolar lymphoid sheath;
PALS) で 活 性 化 され る. こ こ で2通 りの 分 化 経 路 に 分 か れ る . 一 部 の細 胞 は直 接 抗 体 産 生 細 胞 (ほ と ん ど の 抗 体 の ク ラ ス はIgM) に 分 化 し, い わ ゆ るPALS-associated foci を形 成 す る. そ の 他 の 多 くの 細 胞 はB細 胞 領 域 で あ る濾 胞 内 に移 動 し, 急 速 な細 胞 分 裂 に よ っ て 胚 中 心 を 形 成 す る. 初 回 免 疫 の 一 次 応 答 の 場 合 , 抗 原 の 投 与 後 約7日 目 で 胚 中 心 の構 造 が 確 認 され るが , 追 加 免 疫 の 二 次 応 答 の 場 合 は 免 疫 後2,3日 とい う短 期 間 で よ り明 らか な胚 中 心 形 成 が 見 られ る. そ の 後 は約2週 間 ほ ど で 胚 中 心 は 消 退 し て い く.in situで 胚 中 心 を同 定 す る 際 ,peanut agglutinin(PNA) との 結 合 性 が 用 い られ て い るが , 最 近 は これ に 加 え て細 胞 周 期 関 連 分 子Ki-67の 発 現 も用 い られ て い る. 胚 中 心 内 で の 最 初 の ス テ ップ と して ,Ig分 子 の 表 面 発 現 が 減 少 し た セ ン トロ ブ ラ ス ト と よ ば れ る 細 胞 が 暗 帯 を形 成 し, この 段 階 でIg分 子 可 変 部 領 域 の 体 細 胞 突 然 変 異 が 高 頻 度 に起 こ る. い まか ら9年 前 にJacobら に よ っ て , 胚 中 心 で は高 率 にIg分 子 のH鎖 のV領 域 に体 細 胞 突 然 変 異 が 起 こっ て い る こ とが 示 さ れ た6). 続 い て セ ン ト ロ ブ ラ ス トは 明 帯 に 移 動 し, 突 然 変 異 を受 け たIg分 子 を 細 胞 表 面 に 出 した セ ン トロ サ イ トに分 化 し,FDC上 の 免 疫 複 合 体 を認 識 す る . こ こで 抗 原 に親 和 性 の 高 いIg分 子 を 表 面 に もつ 細 胞 だ けが選 択 され て, 抗 体 産 生 細 胞 や 記 憶B細 胞 に分 化 す る よ う に 選 別 され る . 親 和 性 の 高 くな いIg分 子 を 発 現 す るセ ン トロ サ イ トは再 び セ ン トロ ブ ラ ス トに戻 り, 新 た にV領 域 の 突
胚中心の分子生物学 3 表1 胚 中心 反応 が影 響 を 受 け る遺 伝子 欠損 マ ウス の表 現 型 こ れ ま で に 報 告 さ れ て い る 胚 中 心 形 成 が 障 害 さ れ る マ ウ ス の 表 現 型 を ま と め た .IgG抗 体 価 はTD抗 原 特 異 的 抗 体 価 を 測 定 し て い る . な お ,CD19-/-,CD21/CD35-/-,C3ま た はC4-/-はPNA陽 性 胚 中 心 が 完 全 に は な く な ら ず , 胚 中 心 の 数 と 大 き さ が 著 明 に 減 少 し て い る . [Kosco-Vilbois,et al.:Immunol.Rev.,156,127-136(1997) よ り 改 変 引 用 ] 然 変 異 , ク ロ ー ン選 択 を受 け る もの と考 え ら れ て い る. 一 方, ま った く抗 原 と親 和 性 の な いIg分 子 , あ る い は 自 己 抗 原 に 対 す るIg分 子 を発 現 す るB細 胞 (セ ン トロ サ イ ト) は ア ポ トー シ ス に よ っ て 除 去 され る もの と考 え られ て い る (図1). 最 近 , 遺 伝 子 欠 損 マ ウスの 作 製 お よび 解 析 が進 み, 胚 中 心 形 成 が 障 害 さ れ て い る マ ウ ス の 報 告 が な さ れ て い る. 現 在 まで に 胚 中 心 形 成 障 害 が 報 告 され て い る マ ウ ス に つ い て表1に 示 した7∼20). これ らの マ ウ スで の 胚 中 心 形 成 障 害 の 理 由 に つ い て は ,B細 胞 側 に 原 因 が あ る 場 合 とB細 胞 以 外 に障 害 が 起 こ っ た も の と に分 け られ る.Bcl-6欠 損 マ ウス19),OCA-B欠 損 マ ウス14)はB細 胞 側 の原 因 で胚 中 心 形 成 が 障 害 され る. これ に対 して , TNF-α 欠 損 マ ウ ス12),LT-α 欠 損 マ ウ ス13)は リ ン パ 器 官 の 形 成 そ の も の が 障 害 を 受 け て お り, 脾 臓 で は 一 次 濾 胞 す ら も見 られ な い . ま た ,MHCク ラ スⅡ 欠 損 マ ウ ス7)やCD409) あ る い はCD40L欠 損 マ ウス10)で は, B細 胞 とCD4+T細 胞 との相 互 作 用 が 障 害 さ れ て , 胚 中 心 形 成 が 起 こ ら な い もの と考 え られ て い る . 胚 中 心 形 成 障 害 を もつ マ ウ ス の 体 細 胞 突 然 変 異 , 親 和 性 の成 熟 , ク ラ ス ス イ ッチ な どが 完 全 に 障 害 さ れ る か ど うか に つ い て は , 明 解 な 答 え は 得 られ て い な い. た とえ ば,TD抗 原 で 免 疫 後 の血 清IgGの 抗 体 価 は こ れ ら 多 くの 胚 中 心 形 成 障 害 を も つ マ ウ ス で 減 少 して い る が ,Bc1-6欠 損 マ ウ ス ,LT-α 欠 損 マ ウス な どで は ほ ぼ 野 生 型 と同 様 に見 られ る. 親 和 性 の 成 熟 に 関 して も同 様 で , ほ と ん ど の マ ウ ス は 障 害 を受 け る が ,LT-α 欠 損 マ ウ ス やLyn欠 損 マ ウ ス20)な ど は ほ ぼ 正 常 に見 られ る. し た が っ て , 胚 中 心 は体 細 胞 突 然 変 異 , 親 和 性 の 成 熟 , ク ラ ス ス イ ッチ な ど が 効 率 よ く行 な わ れ る場 と し て 重 要 で は あ る もの の , 胚 中心 形 成 障 害 が 抗 体 産 生 に 必 須 の こ と とい うわ け で は な い . 胚 中 心 形 成 障 害 が ど の ス テ ッ プ に あ る の か に よ っ て も異 な る と考 え られ る. 1. 胚 中 心 で のIg分 子 の 成 熟 と こ ろ で い まか ら4年 前 に , 胚 中 心 で 遺 伝 子 再 構 成 に か か わ るRAG分 子 の 発 現 誘 導 が 起 こ る とい う報 告 が Kelsoeら ,Ohmoriら に よ り な された21,22). それ までは, RAG1とRAG2は 骨 髄 , 胸 腺 とい っ た 未 熟 リンパ 細 胞 が 存 在 す る臓 器 に の み発 現 して い る と考 え られ て い た . Kelsoeら ,Nussenzweigら は胚 中 心 内 で起 こ る レセ プ タ ー エ デ ィテ ィ ン グ にRAGが か か わ る とい う報 告 を し た23,24). レ セ プ タ ー エ デ ィ テ ィ ン グ と は, 一 度 獲 得 して 発 現 し たIg分 子 の 特 異 性 が 変 換 す る とい う概 念 で あ る. 骨 髄 中 でL鎖 の ア イ ソタ イ プ をx鎖 か ら λ 鎖 に変 え る
表2 これ まで に報 告 され て いる胚 中心 で 発現 が 増 強 す る分 子 の例 こ とに よ って , 異 な る 特 異 性 を もつIgを 表 面 に 発 現 す るB細 胞 が で き る とい う概 念 が ,Nemazeeら に よ って 提 唱 さ れ た25). こ の こ とが 末 梢 の リンパ 組 織 で も起 こ る とい う こ とで あ り, 抗 原 レ セ プ タ ー の 変 換 が 自 由 自 在 に 起 こ る とい う"画 期 的 な ” 考 え 方 で あ っ た . 筆 者 ら は こ の こ との 真 偽 を 確 か め る た め ,RAG1遺 伝 子 座 に green fluorescent protein(GFP) を ノ ッ ク イ ン した マ ウス を作 製 し, 生 体 内 で のRAG1の 発 現 をGFPに よ って 検 出 し, 解 析 を行 なった26). 驚 いた ことに,RAG1/ GFPヘ テ ロ ノ ッ クイ ンマ ウス をTD抗 原 で 免 疫 して, 脾 臓 に胚 中 心 を形 成 させ て も, その 領 域 では 明 らかなGFP の シグ ナル を検 出 で きなか っ た (筆 者 ら :投稿 中). また , RAG1/GFPヘ テ ロ ノ ッ クイ ンマ ウ ス か ら調 製 した 脾 臓 B細 胞 をLPS+IL-4, 抗CD40抗 体 +IL-4でin vitro で 刺 激 し て も,GFPの シ グ ナル は 増 強 しなか った .TD 抗 原 に よ る免 疫 に よ っ てRAG1の 再 誘 導 が 起 と ら な い とい う結 果 は,Nussenzweigら が作 製 したRAG2遺 伝 子 座 にGFPを 遺 伝 子 導 入 した マ ウ スで も同様 に示 され て お り27),胚 中 心 内 で の レセ プ タ ー エ デ ィ テ ィ ン グ に RAG分 子 の再 発 現 が 関 与 して い る可 能 性 は低 い と考 え られ る. 落 ち着 い て 考 え て み る と, 末 梢 リ ンパ 組 織 で V領 域 の 変 換 は ほ とん ど起 こ らず , 抗 体 遺 伝 子 の対 立 遺 伝 子 排 除 が 保 持 され る ほ うが よ り安 全 で , 長 期 間 の 生 体 防 御 で は確 か な も の と考 え ら れ る . 2. 胚 中 心B細 胞 の 増 殖 の 研 究 胚 中 心 で のB細 胞 活 性 化 の分 子 機構 を解 明 す る場 合 , 胚 中 心 で 発 現 が 上 昇 す る分 子 を 同 定 す る 方 法 が あ げ ら れ る. こ れ ま で に胚 中 心 で 発 現 が 増 強 し て い る 分 子 が 種 々 報 告 さ れ て き た . 最 も よ く用 い ら れ て き た の は 胚 中 心 で 特 異 的 に 発 現 す る遺 伝 子 を サ ブ トラ ク シ ョ ン 法 で単 離 す る方 法 で あ る.Christophら は, 抗 原 で 免 疫 し た マ ウ ス の リ ンパ 節 か ら胚 中 心B細 胞 をFACS(fluores-cence-activated cell sorter) で ソ ー テ ィ ン グ し,PCR法 を 組 み 合 わ せ た サ ブ トラ ク シ ョ ン法 に よ っ て胚 中 心B細 胞 に 発 現 し て い るが ,T細 胞 また はLPS( リポ 多 糖 )で 刺 激 し た 脾 臓B細 胞 に は発 現 して い な い遺 伝 子 ク ロ ー ン を選 別 し た28).M17と 名 づ けた 新 規 遺 伝 子 は細 胞 質 の 蛋 白 質 を コー ドし, 脂 質 結 合 ドメ イ ンとITAM(immuno-recep-tortyrosine-base dactivation motif) を も っ て い て ,
シ グ ナ ル 伝 達 分 子 で あ る こ とが 示 唆 さ れ て い るが , ど の よ う な機 能 を 担 っ て い るの か は こ れ ま で の と こ ろ不 明 で あ る. 最 近 ,Kuoら は ヒ ト扁 桃 腺 よ り胚 中 心B細 胞 を分 離 して ,cDNAラ イ ブ ラ リー を作 製 し, や は り サ ブ トラ ク シ ョ ン法 に よ っ て胚 中 心B細 胞 特 異 的 に発 現 す る遺 伝 子 を ク ロ ー ニ ング し てい る29). 得 られ た遺 伝 子 はDNA修 復 に 関 係 す る8-オ キ ソ グ ア ニ ンDNAグ リ コ シ ラ ー ゼ を コ ー ド し, 胚 中 心 の 暗 帯 で 発 現 が 増 強 してお り, 実 際 にDNA修 復 に働 き体 細 胞 突 然 変 異 に何 らか の 機 能 を し て い る 可 能 性 が 考 え られ る. さ ら に, MAPキ ナ ー ゼ 類 似 構 造 を もつGCキ ナ ー ゼ とい う分 子 も胚 中 心B細 胞 で の シ グ ナ ル 伝 達 分 子 と して 注 目 され て い る30). また ,Bcl-6の よ う に, 分 子 の 解 析 を行 な っ て い る過 程 で た ま た ま胚 中心 で 発 現 が 増 強 し て い る こ とが 明 らか に な っ た分 子 や ,OCA-Bの よう に, 遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス の 解 析 の 結 果 か ら胚 中 心 で の 発 現 上 昇 を認 め た 分 子 も あ る (表2) . 3. 胚 中 心B細 胞 の 増 殖 関 連 分 子GANP A. 新 規 胚 中 心B細 胞 特 異 分 子 の 同 定 胚 中 心 に関 す る分 子 機 構 は 近 年 し だ い に 明 ら か に さ れ て い る が , 最 も重 要 な 点 は , 抗 原 の 刺 激 で 激 し く細 胞 分 裂 を行 な うセ ン トロ ブ ラ ス トが ど の よ う な機 構 に よ っ て 突 然 に細 胞 分 裂 を 止 め る こ とが で き る の か , こ の と き ど の よ う に して 細 胞 に対 す る ダ メ ー ジ を極 力 抑 え て , 次 の ス テ ー ジ の セ ン ト ロ サ イ トに 分 化 させ , 免 疫 系 に 必 要 なB細 胞 ク ロ ー ン と して 選 択 を 受 け るの か , と い う こ とで あ ろ う. 現 在 の と こ ろ, こ れ に つ い て は ほ とん ど わ か っ て い な い . こ の セ ン トロ サ イ トで 発 現
図2 GANP蛋 白 質 の 構 造 * :核 移行 シ グナ ル , ■ :コイル ドコイル 構 造 , 一 フ . LXXLLモ チ が 増 強 して い る分 子 を 見 つ け る こ とが , こ の 増 殖 制 御 の 機 序 を明 らか に す る 早 道 で あ る と考 え た . 筆 者 ら は, こ れ ま で と は ま っ た く異 な る手 法 で , 胚 中 心 で 発 現 が 増 強 す る 分 子 を組 織 標 本 の 上 で 同 定 す る こ と を試 みた5). マ ウスB細 胞 株WEHI-231をNP-40 で 可 溶 化 し,PBS(phosphate buffered saline) で 透 析 後 , これ を免 疫 原 と して ラ ッ トの 足 底 に免 疫 した .3 回 の 免 疫 後 , 膝 窩 リ ン パ 節 を取 り出 し, 型 どお り ミエ ロ ー マ 細 胞 株X63と 細 胞 融 合 を行 な い , 種 々 の ハ イ ブ リ ドー マ を 樹 立 し た . そ れ らの 培 養 上 清 を 用 い て , マ ウ ス の バ イ エ ル 板 の 凍 結 切 片 を 免疫 染 色 して , 胚 中 心 で 発 現 が 増 強 す る分 子 を 認 識 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を ス ク リー ニ ング し た . バ イ エ ル板 は腸 管 内 の 食 物 抗 原 に よ っ て 常 に 刺 激 を受 け, 恒 常 的 に胚 中 心 形 成 が起 こ っ て い る た め , 筆 者 らの ス ク リー ニ ン グ に有 用 で あ っ た . 樹 立 し た 約1,500個 の ハ イ ブ リ ドー マ か ら最 終 的 に1個 の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を選 別 し, こ の 抗 体 を 29-15と 名 づ け た . B.GANP蛋 白 質 の 構 造 続 い て,29-15mAbが 認 識 す る分 子 を コー ドす る遺 伝 子 の単 離 を 行 な っ た5). λgt11-WEHI231 cDNAラ イ ブ ラ リー を作 成 し,29-15mAbと125Ⅰ 標 識 ヤ ギ抗 ラ ッ トIg抗 体 を組 み合 わ せ て 免 疫 ス ク リー ニ ング を行 な い,1×106ク ロー ンよ り1個 の 陽 性 ク ロ ー ン を得 た . こ の ク ロ ー ンは 全 長4.9kbで 約1,500ア ミノ 酸 を コ ー ド す る 新 規 遺 伝 子 で あ っ た . しか し, まだ5'側 を欠 い た ク ロ ー ン で あ っ た た め , さ らに5'-RACE法 を 行 な い, 最 終 的 に1,971ア ミノ酸 を コ ー ドす る全 長cDNAク ロ ー ン を 得, こ の 遺 伝 子 をgang(germinal center-associated nuclear protein) と名 づ け た . 実 際 にganp mRNAが 胚 中 心 で 発 現 増 強 して い る こ と は ,in situ RNAハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン に て 確 認 し た . 胚中心の分子生物学 5 GANPの 構 造 上 の 特 徴 と し て は,2カ 所 の 核 移 行 シ グ ナ ル と2カ 所 の コ イ ル ドコ イ ル 領 域 を 認 め , さ ら に 核 内 コ ア クチベ ー タに よ く見 られ るLXXLL配 列 が4カ 所 見 られ た (図2) . しか し な が ら, 現 在 まで にGANP がSRC−1な どの よ う にLXXLLモ チ ー フ を介 して エ ス トロ ゲ ン レ セ プ タ ー や レ チ ノ イ ン酸 レ セ プ タ ー と リ ガ ン ド依 存 性 に 結 合 す る とい う デ ー タ は 得 られ て お らず , GANPが コ ア ク チ ベ ー タ と して 機i能す る か ど うか につ い て は不 明 で あ る . gangシ ー ク エ ン ス を デ ー ター べ 一 ス 上 で ホ モ ロ ジー 検 索 す る と, 中 央 部 分 約600ア ミ ノ酸 に わ た っ て , 出 芽 酵 母 のSAC3と ア ミノ酸 レ ベ ル で23% の有 意 な相 同 性 を認 め た .SAC3は も と も と, ア クチ ン変 異 を相 補 す る遺 伝 子 と して ク ロー ニ ン グ され た1,301ア ミノ 酸 か らな る核 内 分 子 で あ る31>.SAC3を 欠 損 させた 出 芽 酵 母 は 致 死 で は な い が , な ぜ か 正 常 の 酵 母 に 比 べ て 大 き く な る32). また 細 胞 分 裂 (と くにM期 に お い て ) が 遅 延 し, 細 胞 周 期 との 関 連 が 強 く示 唆 され て い る . ほ ぼ 同 時 期 にStellaら は 酵 母 が ロ イ シ ン, イ ソ ロ イ シ ン, バ リ ン を 取 り込 む 際 に働 く ロ イ シ ン透 過 酵 素 の 転 写 制 御 に か か わ る分 子 と してLEP1を ク ロ ー ニ ング した が , こ れ はSAC3と 同 一 分 子 で あ る こ とが わ か り,DNA結 合 蛋 白質 で は な い もの のSAC3は 転 写 調 節 に働 くこ とが 考 え られ た .SAC3は ア ク チ ン ま た は ア クチ ン 結 合 分 子 の 発 現 調 節 に 関 与 して い る可 能 性 が あ る . C.GANP分 子 の 増 殖 に及 ぼ す 機 能 最 近 ,TakeiとTsujirnotoは 細 胞 複 製 に必 須 な分 子 と し て 知 ら れ るMCM3をbait( 餌 ) に し た 酵 母two hybrid法 を 用 い て ,721ア ミ ノ酸 か ら な る 新 規 ヒ ト分 子Map80を 同 定 した33). 彼 ら はMap80がMCM3の 核 移 行 シグ ナ ル に結 合 し,MCM3の 核 移 行 を促 進 す る こ と を 示 し て い る が , 驚 い た こ と に こ の 分 子 は マ ウ ス GANPのC末 端 側700ア ミ ノ酸 とア ミノ酸 レベ ル で76 % の 高 い 相 同性 を も つ こ とが 明 らか とな っ た . そ の た め ,GANPがMCM3分 子 と会 合 で き る 可 能 性 が 考 え られ た . こ こでMCM複 合 体 につ い て 紹 介 して お く.MCMと はminichromosome maintenanceの 略 で , もと も と出 芽 酵 母 のDNAを 安 定 化 す る 染 色 体 外 に存 在 す る遺 伝 子 と して見 い だ され た もの で あ る34).MCMは 真 核 生 物 に 広 く存 在 し,MCM2∼7の6種 類 の フ ァ ミ リー か らな り, これ ら は細 胞 内 で 安 定 な ヘ テ ロ6量 体 を 形 成 す る
こ とが 知 られ て い る.MCM複 合 体 は出 芽 酵 母 のMCM変 異 体 の 解 析 か ら,DNA複 製 開 始 に 必 須 な分 子 で あ る こ とが 明 らか に され て い る . 以 前 よ りア フ リ カ ツ メ ガ エ ル を 用 い た 系 で ,1回 の 細 胞 分 裂 で1 度 の ゲ ノ ムDNA複 製 を保 証 す る ラ イ セ ン ス 因 子 (replica-tion licensing factor) の 存 在 が 提 唱 さ れ て い た が , こ れ ま で の研 究 で こ の ラ イ セ ン ス 因 子 の 中 心 的 役 割 を 果 た す の が MCM複 合 体 で あ る こ と が 明 らか に されて い る35). 真 核 生 物 の 複 製 に か か わ る 因 子 と して , まず 複 製 開 始 領 域 に 結 合 す る ORC(origin recognition complex) が あ る . ア フ リカ ツ メ ガ エ ル 卵 無 細 胞DNA複 製 系 の 解 析 か ら, 複 製 可 能 な 染 色 体 の 形 成 に は , まず 染 色 体 上 にORCが 結 合 し, 次 に Cdc6が , 最 後 にMCMが 結 合 す る こ とが 必 要 で あ る36).い っ た ん 複 製 が 進 行 す る と, Cdc6とMCM複 合 体 は ク ロ マ チ ン か ら遊 離 し, 細 胞 周 期 が 完 了 す る まで 再 び 複 製 領 域 に 結 合 す る こ と は で き な い . 図3GANP分 子 の 胚 中 心 に お け る 発 現 上 昇
(a)正 常 マ ウス の バイエ ル板 の 凍 結切 片 を抗GANP抗 体 (29-15mAb) と抗B220抗 体 ,29-15mAb と抗IgD抗 体 とで二 重 染色 した .GANPの 発 現 は バ イ エル 板 胚 中心 の 中央 部 に認 め,GANP陽 性 細 胞 はB220陽 性IgD陰 性 であ っ た. この 表 現 型 は胚 中心B細 胞 の 表 現 型 と一 致 する . (b)ヒツ ジ赤 血 球 を免 疫 した 脾 臓 凍 結 切 片 を抗GANP抗 体 (29-15mAb) ,PNA, 抗BrdU抗 体 とで三 重 染 色 した.GANP陽 性 細 胞 は 胚 中 心 の なか で もセ ン トロサ イ トが 多い 明 帯 に発 現 して い た. (c)ヒ ツ ジ 赤血 球 を 免 疫 した 脾 臓 凍 結 切 片 を抗GANP抗 体 (29-15mAb)と 抗CR1抗 体 とで 二 重 染 色 し た.GANP陽 性 細 胞 は 明 帯 でFDCに 取 り囲 まれ る よ う に 存 在 し て い た. [文 献5(Blood,95, 2321-2328,2000) よ り許 可 を得 て転 載 ] MCM複 合 体 の ク ロマ チ ンか らの遊 離 には リン酸 化 が 重 要 な 役 割 を果 た して い る こ とが 示 されて い る37).哺 乳 動 物 培 養 細 胞 を 用 い た 実 験 で は ,MCM2とMCM3がS 期 の 進 行 と と も に リ ン酸 化 が 起 こ る こ とが 報 告 さ れ て お り, ク ロ マ チ ンか ら遊 離 したMCM複 合 体 は脱 リン 酸 化 さ れ た の ち , ク ロ マ チ ン に 結 合 で き る よ う に な る と考 え ら れ る .MCM2とMCM3がCdc7/Dbf4のin vitroで の リン酸 化 基 質 にな る こ とが知 られ て い るが, 最 近Hunterら はCdc7/Dbf4がin vivoでMCM2を リン 酸 化 す る ことを示 した38.MCM複 合 体 の構 成 分 子 をin vivo で リ ン酸 化 す る酵 素 が 何 で あ る か は まだ 明 らか に され て い な い が ,DNA複 製 を考 え る う えで 非 常 に重 要 で あ る. 上 述 し た よ う に ,GANPとMap80の 相 同 性 か ら GANPが 細 胞 内 でMCM3分 子 と会 合 す る こ とが 示 唆 され た . そ こ で まず , 抗 体 を 用 い た 共 沈 実 験 を 行 な っ た . な お ,29-15mAbは 免 疫 沈 降 が で き な い抗 体 の た め ,GST-GANP(579∼1,028ア ミノ 酸 ) 融 合 蛋 白 質 を作 製 後 , ラ ッ トに 免 疫 して 新 た な抗GANPモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体42-23を 得 た. マウスB細 胞 株WEHI-231 細 胞 のNP-40可 溶 化 物 を 抗GANP抗 体 で 免 疫 沈 降 し, 抗MCM3抗 体 で ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト した と こ ろ, 分 子 量 約100KのMCM3分 子 のバ ン ドを認 め,GANP とMCM3の 物 理 的 会 合 が 確 認 され た . さ ら
7細 胞 にFLAGで タ ギ ング したgangとHAで タ ギ ン グ したMCM3両 方 の 遺 伝 子 を 導 入 した 共 沈 実 験 で も GANPとMCM3の 会 合 を 認 め , 細 胞 内 に お け る GANPとMCM3の 結 合 が 明 ら か と な っ た . 次 に , GANPの ど の 領 域 でMCM3と 会 合 し て い る の か を , GANPの 種 々 の 欠 失 変 異 体 をGSTと の 融 合 蛋 白 質 と
し て発 現 さ せ , こ れ ら を 用 い たpull down assayに て 調 べ た .GANPとMap80と の相 同 性 か ら,GANPの C末 端 側 がMCM3と の結 合 に 重 要 で あ る こ と は当 初 予 想 した とお りで あ っ た . D. 胚 中 心 に お け るB細 胞 増 殖 ・活 性 化 とMCM3/ GANPの 役 割 抗GANPモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (29-15mAb) を 用 い て , 腸 管 の リ ンパ 組 織 で あ るパ イ エ ル 板 の 凍 結 切 片 を 免 疫 染 色 す る と, 胚 中 心 と思 わ れ る 領 域 に 陽 性 シ グ ナ ル が 見 られ , 種 々 の マ ー カ ー と と も に二 重 染 色 を す る と,29-15陽 性 細 胞 はPNA+B220+IgD-の 表 現 型 を 示 した (図3a)5). した が っ て ,29-15mAbで 染 色 さ れ る細 胞 は胚 中 心B細 胞 で あ る こ とが 示 さ れ た . この こ と を さ ら に 確 認 す る た め に, 脾 臓 胚 中 心 で も同 様 に 陽 性 シ グ ナ ル が 検 出 さ れ るか を 検 討 し た . ヒ ツ ジ赤 血 球 をBALB/cマ ウ ス に 免 疫 し,7日 後 の 脾 臓 凍 結 切 片 を29-15mAbお よ びPNAで 免 疫 染 色 した . この 場 合 もバ イ エ ル板 同 様 , 胚 中 心 に一 致 す る よ うにGANP陽 性 細 胞 を認 めた (図3b) . 興 味 あ る こ とにGANP陽 性 細 胞 は胚 中 心 全 体 で は な く, 明 帯 に比 較 的 強 く見 られ た . ま た , 抗CR1抗 体 と の 二 重 染 色 の 結 果 ,GANP 陽 性 細 胞 はFDCに 取 り囲 まれ る よ う に存 在 す る こ とが わ か り, セ ン トロ サ イ トで 発 現 が 選 択 的 に上 昇 し て い る こ とが 強 く示 唆 さ れ た (図3c) . 上 述 の よ う にGANPとMCM3の 会 合 が 見 られ た の で , 次 に胚 中 心 にお いてMCM3分 子 の 発 現 が 上 昇 して い る か を 調 べ た . ヒツ ジ赤 血 球 をBALB/cマ ウ ス に 免 疫 し た7日 後 の 脾 臓 凍 結 切 片 を 抗MCM3抗 体 と PNA,抗MCM3抗 体 と抗CR1抗 体 を用 いて 二 重 染 色 した . そ の 結 果 , 正 常 脾 臓 組 織 にお い てMCM3の 発 現 が ほ と ん ど見 られ な い の に対 し,MCM3の 胚 中 心 に お け る 発 現 上 昇 を認 め た (図4)51. しか し,GANPと は 異 な り胚 中 心 全 体 で 発 現 が 上 昇 して い た .Musahlら は ヒ ト表 皮 組 織 で のMCM3の 発 現 を検 討 して い るが , そ れ に よ る と基 底 部 の細 胞 増 殖 が 盛 んな 領 域 にMCM3の 発 現 は 強 く, 上 方 の 分 化 した 領 域 で はMCM3は ほ とん 胚中心の分子生物学 7 図4 MCM3分 子 の 胚 中 心 に お け る 発 現 上 昇 ヒツジ 赤血 球 を免 疫 した脾 臓 凍 結 切 片 を抗MCM3抗 体 と抗CR1抗 体 , 抗MCM3抗 体 とPNAと で 二 重 染 色 した . こ こ で は 示 さ な い が , 非 免 疫 状 態 で はMCM3の 発 現 は ほ とん ど認 め な い. 胚 中 心 に お け るMCM3の 発 現 上 昇 は,GANPと は異 な り, 胚 中 心 全 体 に 見 られ た . ど発 現 して いな か った39).MCM蛋 白質 の 発 現 は増 殖 し て い る 細 胞 に 強 い発 現 が 見 ら れ , 分 化 し て い る細 胞 で は 発 現 を認 め な い と い う複 数 の 報 告 が あ り, 胚 中 心 に お け るMCM3分 子 の 発 現 上 昇 は細 胞 増 殖 , す なわ ち セ ン トロ ブ ラ ス トと 関 連 が あ る こ と が 予 想 され た . E.GANP分 子 発 現 を 誘 導 す る シ グ ナ ル 胚 中 心 でGANPの 発 現 が 増 強 す る と い う こ とを,in vitroで も再 現 で き るか ど う か マ ウ ス脾 臓B細 胞 を種 々 の マ イ トジ ェ ン で 刺 激 してGANPの 発 現 上 昇 を細 胞 内 染 色 で調 べ た . そ の 結 果 ,CD40か ら の シグ ナ ル に よ っ てGANPの 発 現 が 強 く誘 導 され る こ とが 示 され た. さ らに ,CD40と 抗 原 レ セ プ タ ー か ら, あ るい はCD40と IL-4レ セ プ タ ー か ら の シ グ ナ ル はCD40単 独 に比 べ て さ ら にGANPの 発 現 を 増 強 さ せ た . これ に 対 し て , CD38と 抗 原 レ セ プ タ ー か ら の シ グ ナル は 細 胞 増 殖 は誘 導 す る も の の ,GANPの 発 現 誘 導 は それ ほ ど見 られ な か っ た (筆 者 ら :未 発 表 ). こ れ らの 結 果 か ら,セ ン トロ サ イ トはFDCか らの シ グナ ル を受 け て,GANPの 発 現 を誘 導 して い る可 能 性 が 考 え られ た (図5) . この 発 現 誘 導 シ グ ナ ル はOCA-Bの 場 合 とよ く似 て い るが ,OCA-BはGANPの よ うに セ ン トロサ イ トで 発 現 が 上 昇 す るわ け で は な く, 胚 中 心 全 体 で そ の 発 現 が 増 強 す る40). CD40欠 損 マ ウ ス の 解 析 か ら,CD40-CD40Lの 相 互 作 用 は胚 中 心 形 成 や ク ラ ス ス イ ッ チ に必 要 で あ る こ と
が 示 さ れ て い る9).CD40欠 損 マ ウ ス をTD抗 原 で 免 疫 して も, 胚 中 心 が 欠 損 し,IgM以 外 の ク ラ ス の 抗 体 産 生 は ほ と ん ど見 ら れ な い . また , 胚 中 心B細 胞 をin vitroで 培 養 す る と, 急 速 に ア ポ トー シ ス に 陥 るが, この ときにCD40か ら の シ グ ナ ル が 入 る と細 胞 死 か ら回 避 で き る こ とが 知 られ て い る.GANPがCD40の 下 流 に 位 置 す る シ グ ナ ル 伝 達 分 子 か ど う か は現 在 は っ き り して い な い が , セ ン トロ サ イ トで のGANPの 発 現 お よび 明 帯 で 行 なわ れ る ク ラス ス イ ッチ, 記 憶B細 胞 へ の 分 化 にCD40が 関 与 して い る とい う事 実 か ら, GANPがB細 胞 選 択 に何 ら か の 役 割 を果 た し て い る可 能 性 が あ る. ま た ,MCM3が Fasか らの シ グナ ル に よ って蛋 白質 分 解 を受 け る と い う報 告 図5胚 中 心 に お け るGANP発 現 とB細 胞 増 殖 制 御 の モ デ ル セ ン トロ サ イ トに発 現 す るBCR分 子 はFDC上 に捕 獲 され て い る抗 原 を 認 識 し, 細 胞 内 に取 り込 み , プ ロ セ シ ン グ した の ち ,MHCク ラスⅡ 上 にペ プチ ドと して発 現 す る. この 抗 原 を認 識 して 活 性 化 され たCD4+T細 胞 は細 胞 表 面 にCD40Lを 発 現 す る . そ の 結 果 , セ ン トロ サ イ ト上 の CD40に シ グ ナ ル を伝 え,GANPの 発 現 が セ ン トロサ イ トの核 内 で上 昇 し,MCM3分 子 と会 合 し て , セ ン トロサ イ トに お け る 分 裂 , 増 殖 を制 御 して い る とい う可 能 性 を考 え て いる . 一 方 ,Fas 分 子 はMCM3の 分 解 に関 与 して い る と い う報 告 も あ り, セ ン トロ サ イ ト上 でT細 胞 のFasLか らの シ グナ ル を 受 け る可 能 性 が ある .GANP分 子 がFasか らの シ グナ ル に も何 らか の 関 連 を もつ 可 能 性 も否 定 で きな い. も あ り41),GANPが ア ポ トー シス の シ グ ナ ル 伝 達 に 関 与 して い る こ と も考 え られ る . こ れ まで の 解 析 でGANPが リ ン酸 化 蛋 白 質 で あ る こ とが 明 らか とな っ て い るが , マ ウスB細 胞 株 のWEHI-231やBAL17を 用 い た 結 果 で は,CD40や 抗 原 レ セ プ タ ー か らの 刺 激 に よ りGANPの リ ン 酸 化 の 誘 導 がin vitroで 認 め られ て い る.GANPの リ ン酸 化 がin vivo で も認 め られ る か は 現 在 解 析 中 だ が , い ず れ に せ よB 細 胞 の 活 性 化 に お け るGANPの 役 割 は, 蛋 白 質 の発 現 上 昇 と リ ン酸 化 の 誘 導 とい う2つ の 面 か ら今 後 明 らか に し て い く必 要 が あ る. ど の よ う な影 響 を与 え るの だ ろ うか . 今 後 ,GANP欠 損 マ ウ ス の作 製 を と お し て ,GANPのin vivoで の 機 能 (と くに細 胞 周 期 に 対 して 正 に働 くの か 負 に 働 くの か ), 胚 中 心 のB細 胞 分 化 にお け る役 割 を 明 らか に して い きた い と考 え て い る .
文
献
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