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An Immunohistochemical Study on Fetal Mouse Condylar Cartilage Masako Ishii 2nd Department of Orthodontics, Faculty of Dentistry, Tokyo Medical and De

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16口 病 誌 平成7年3月

マ ウス胎 仔 下 顎頭 軟 骨 に お け る

I,II型

コ ラー ゲ ン に 関 す る免疫 組 織 学 的 研 究

石 井 昌 子 東京 医科 歯科 大学 歯学 部歯科 矯正 学 第2講 座(主 任 ・指導:黒 田敬 之教 授) (1994年12月8日 受 付)

An Immunohistochemical Study on Fetal Mouse Condylar Cartilage

Masako Ishii

2nd Department of Orthodontics, Faculty of Dentistry, Tokyo Medical and Dental University

(Chief and Director : Prof. Takayuki Kuroda)

Mandibular condylar cartilage is considered as one of the growth cartilages, but it repre-sents many distinct features. Collagens in cartilage matrix consist mainly of type II collagen but lack type I collagen. Recently it is reported that condylar cartilage contained both type I and type II collagens, while type I collagen was lacking in growth plate cartilages of adult rat tissue. In order to investigate whether such difference in matrix collagen exists in the embryonic period, an immunohistochemical study of type I and type II collagen was performed on fetal mouse condylar cartilage and compared to the limb bud cartilage (tibial anlage).

When the first appearance of condylar cartilage was recognized at the 15th day of gestation, reaction to anti-type I collagen was detected in the cartilage matrix, while reaction to anti-type II collagen was very faint. After the 16th day, the pattern of immunohistochemical reaction was almost the same as that after birth. These observations of fetal condylar cartilage were completely different from those of limb bud cartilage.

These results suggest that the abilities of the condylar cartilage and the limb bud to synthesize matrix collagen are different from the embryonic period.

1.緒 言 下 顎 頭 軟 骨 は 下 顎 の 成 長 発 育 に 関 与 す る主 要 な 成 長 の 場 と考 え られ て お り,そ の 成 長 の機 構 を解 明 す る 目的 で,従 来 よ りさ ま ざ ま な研 究 が行 わ れ て き た。 組 織 学 的 研 究 か ら は,下 顎 頭 軟 骨 と長 管 骨 の 成 長 板 で は,軟 骨 細 胞 の 配列 様 式,軟 骨 内骨 化 の 過 程 に お け る軟 骨 基 質 の石 灰 化 の様 式,血 管 の侵 入,分 布 の パ ター ン な どが 異 な る こ とが 報 告 さ れ て い る1)。また,下 顎 頭 軟 骨 は発 生 様 式 の特 異 性 に よ り,他 の 軟 骨 を一 次 軟 骨 とす る の に 対 して, 二 次 軟 骨 と分 類 され て い る2,3)。下 顎 頭 軟 骨 の発 生 は きわ め て特 徴 的 で あ り,長 管 骨 の 軟 骨 原 基 の 出 現 よ り遅 れ て 胎 生 後 期 に 起 こ り,膜 性 骨 化 に よ り 形 成 され る下 顎 骨 体 の 遠 心 端 に 出 現 す る こ とが知 られ て い る。

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口病 誌1995,62/117 従 来,下 顎 頭 軟 骨 の発 生 に関 す る研 究 は,組 織 学 的 手 法 に よ る もの が 多 く,ヒ ト4∼7),および,動 物8∼10)を用 い た研 究 が 報 告 され て い るが,下 顎 頭 軟 骨 の 出 現 と下 顎 骨 体 と の位 置 的 関 係 に つ い て は,異 な る観 察 結 果 が 報 告 さ れ て い た8,10)。そ の た め,天 願11)は,マ ウ ス胎 仔 を用 い て,下 顎 頭 軟 骨 の 連 続 切 片 を作 製 し,組 織 学 的 観 察 に供 す る と と も に,コ ン ピュ ー ター を用 い 組 織 切 片 を三 次 元 立体 構 築 す る こ とに よ り,下 顎 頭 軟 骨 の発 生 様 相 に つ い て 詳 細 な観 察 を行 っ た。 そ の 結 果,ト ル イ ジ ン ブ ル ー で メ タ ク ロマ ジー を示 す 軟 骨 基 質 を有 す る 下 顎頭 軟 骨 は,下 顎 骨 体 原 基 の 遠 心 部 に,内 側 を 形 成 中 の 下 顎 骨 体 に,外 側 を下 顎 骨 体 周 囲 か ら連 続 して い る未 分 化 間 葉 細 胞 に 接 して 出 現 し て く る こ と を明 らか に した 。 近 年,細 胞 外 基 質 の 構 成 成 分 に 関 す る検 索 も進 み,軟 骨 基 質 を構 成 す る蛋 白 も明 らか に され つ つ あ る12)。軟 骨 基 質 は 主 に コ ラー ゲ ン とプ ロ テ オ グ リカ ン か ら構 成 さ れ るが,一 般 的 に軟 骨 基 質 を構 成 す る コ ラー ゲ ン の 約80%はII型 コ ラー ゲ ンが 占め,残 りはIX,X,XI型 コ ラ ーゲ ン が数%ず つ 含 まれ て い る こ とが知 られ て い る。 ま た,プ ロ テ オ グ リカ ンは,そ の 大 部 分 が ピア ル ロ ン酸 と結 合 し,高 分 子会 合 体 を形 成 す る軟 骨 型 プ ロ テ オ グ リ カ ン と呼 ば れ る タ イ プ で あ る こ とが 明 らか と な っ て い る。 一 方 ,下 顎 頭 軟 骨 の 基 質 に は1型 コ ラー ゲ ン13,14),テネ イ シ ン15)などの,一 般 的 に 軟 骨 基 質 に は 存 在 しな い 基 質 蛋 白の 存 在 が 報 告 され て きて い る。最 近,溝 口 ら16)は,4週 齢 の ラ ッ ト組 織 を用 い て,I,II型 コ ラー ゲ ンの 免 疫 染 色 を行 い,下 顎 頭 軟 骨 と脛 骨 成 長 板 軟 骨 の 所 見 を比較 した。 そ の 結 果,成 長 板 軟 骨 で はII型 コ ラー ゲ ンの 反 応 の み が 認 め られ た の に 対 して,下 顎 頭 軟 骨 で は成 熟 し た 層 にII型 コ ラー ゲ ン の 反 応 を認 め,さ ら に,全 層 に1型 コラー ゲ ン の 反 応 も認 め られ た こ と を示 した。 これ らの結 果 よ り,両 者 の 軟 骨 基 質 を構 成 す る蛋 白成 分 に相 違 の あ る こ とを 明 らか に して い る。 長 管 骨 の 軟 骨 原 基 の 発 生 に 関 して は,von der Markl7,18), Silverl9)らが 細 胞 外 基 質 の構 成 蛋 白 に つ い て検 索 を行 い,未 分 化 間葉 細 胞 は1型 コ ラー ゲ ン を分 泌 す るが,未 分 化 間葉 細 胞 が 軟 骨 細 胞 に 分 化 す る と1型 で は な くII型 コ ラー ゲ ン を分 泌 す る こ と を報 告 して い る。 他 方,下 顎 頭 軟 骨 の 発 生 過 程 に お け る基 質 蛋 白 に 関 す る研 究 は,こ れ ま で報 告 され て お らず,下 顎 頭 軟 骨 と成 長 板 軟 骨 に お け る基 質 コ ラー ゲ ンの 違 いが,い つ の 時 点 か ら存 在 す るの か は 明 らか で は な い。 この 点 に関 して,生 後 の 下 顎 頭 軟 骨 と脛 骨 成 長 板 軟 骨 に お い て 軟 骨 基 質 コ ラー ゲ ン の構 成 に 相 違 が 認 め られ た こ とか ら,以 下 に 示 す 二 通 り の 可 能 性 が考 え られ る。(1)各々 の 軟 骨 が 発 生 した 時 点 よ り,そ れ ぞれ の 軟 骨 で分 泌 され る基 質 蛋 白 が 異 な っ て い た 。(2)発生 初 期 に は分 泌 され る 基 質 蛋 白 に差 は な か っ た が,成 長 発 育 して ゆ く過 程 で, も し くは,な ん らか の機 能 的 要 因 等 に よ り差 が 生 じた 。 本 研 究 は,上 記 の 可 能 性 の いず れ で あ る の か を 明 らか にす る こ と を 目的 と して お り,マ ウ ス胎 仔 の下 顎 頭 軟 骨 を用 い て,抗I,II型 コ ラー ゲ ン抗 体 で 免 疫 染 色 を行 っ た。 さ らに,脛 骨 の 軟 骨 原 基 に も同 様 に免 疫 染 色 を施 し,下 顎 頭 軟 骨 と比 較 を 行 っ た 。 II.材 料 お よび 方 法 1.胎 仔の摘 出 と固 定 試 料 と して,C57BL/6Nマ ウ ス 胎 仔 を 用 い た。 交 配 時 間 を,夜9時 か ら翌 朝9時 まで と し, 朝9時 に 腟 栓 を確 認 し た 日 を妊 娠0日 と した 。 妊 娠13∼18日 目 ま で の 母 獣 マ ウ ス を頸 椎 脱 臼 に よ り屠 殺 し た後 に 開腹 して 胎 仔 を摘 出,下 顎 頭 軟 骨 お よ び脛 骨 軟 骨 原 基 を観 察 す るた め に,頭 部 と後 肢 を切 断 して 試 料 と し た。 固定 は4%パ ラホ ル ム ア ル デ ヒ ドに て,4℃ で24時 間 浸 漬 固 定 した。 2.レ ジ ン包 埋 と切片 作製 0.01Mリ ン 酸 緩 衝 食 塩 水(pH7.2,以 下PBS と略 す)で 洗 浄 した 後,10%EDTA溶 液(pH7.4) で3∼10日 間 脱 灰 し,通 法 に 従 い エ タ ノー ル 系 列 に て 脱 水 した 。 以 上 の操 作 は4℃ で行 っ た。 そ の

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18口 病 誌 平 成7年3月 後,室 温 に て 親 水 性 レ ジ ン で あ る,包 埋 樹 脂Tech-novit7100に 包 埋 し た 。 頭 部 は 前 頭 断,後 肢 は 脛 骨 原 基 の 長 軸 に 平 行 に2μmの 連 続 切 片 を 作 製 し,連 続 し た2枚 を 同 一 の ス ラ イ ドグ ラ ス に 貼 付 し た 。 ス ラ イ ド グ ラ ス は 表 面 を0.025mg/mlポ リ-L-リ ジ ン 溶 液 で コ ー テ ィ ン グ し た も の を 用 い,切 片 は ホ ッ トプ レ ー ト上 で40℃ で10分 間 乾 燥 さ せ,接 着 の 強 化 を 計 っ た 。 連 続 し た3枚 の ス ラ イ ドグ ラ ス を 一 組 と し て,そ れ ぞ れ に トル イ ジ ン ブ ル ー 染 色(0.1%,pH7.0),I,II型 コ ラ ー ゲ ン の 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 トル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 は 室 温 で3分 間 行 っ た 。 3.免 疫 染 色 は じ め に,ピ ア ル ロ ニ ダ ー ゼ(Boehringer Man-nheim社,50mg/ml)で2時 間,抗II型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 で 染 色 を 行 う も の に は,さ ら に プ ロ テ ア ー ゼ(type XXIV, Sigma社,0.5mg/ml)で30分 間, 酵 素 処 理 を 行 っ た 。ブ ロ ッ キ ン グ と し て は,block-ing kit(vector社)を 用 い,avidin溶 液 で30分 間,PBSで 濯 い だ 後,biotin溶 液 で30分 間 反 応 さ せ た 。PBSで 洗 浄 し た 後 に,正 常 ヤ ギ 血 清 で さ ら に30分 間 ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 。 酵 素 処 理,ブ ロ ッ キ ン グ は,37℃ で 行 っ た 。 一 次 抗 体 と し て, PBSで500倍 に 希 釈 し た ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 ラ ッ ト1型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体(LSL社),ま た は,ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 ウ シII型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体(LSL社)を 用 い,37℃ で12∼18時 間 反 応 さ せ た 。PBS洗 浄 後,正 常 ヤ ギ 血 清 で37℃ で30分 間 ブ ロ ッ キ ン グ し,二 次 抗 体 と し て,PBSで250倍 に 希 釈 し た ビ オ チ ン 標 識 ヤ ギ 抗 ウ サ ギIgG抗 体 と37℃ で30分 間 反 応 さ せ た 。PBSで よ く洗 浄 し た 後,1nmの コ ロ イ ド金 標 識 し た ス ト レ プ ト ア ビ ジ ン(Bio Cell社)をPBSで100倍 希 釈 し て,37℃ で30分 間 反 応 さ せ た 。 蒸 留 水 に て 繰 返 し洗 浄 後,Silver enhancing kit(BioCell社)を 用 い て 銀 粒 子 に よ る 増 感 を 行 い,再 び 蒸 留 水 に て 洗 浄 し た 後 に トル イ ジ ン ブ ル ー 染 色(0.05%,pH7.0)に よ り核 染 を施 し た 。 封 入 後,光 学 顕 微 鏡 で 検 鏡 し た 。 III.結 果 本 研 究 に お い て は,ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 に よ る メ タ ク ロ マ ジ ー を 軟 骨 基 質 の 指 標 と し,は じ め て メ タ ク ロ マ ジ ー を 認 め た 時 点 を 軟 骨 化 の 開 始 と し た 。 免 疫 染 色 の 反 応 は,光 学 顕 微 鏡 下 で 黒 い 銀 粒 子 の 沈 着 と し て 観 察 さ れ,一 次 抗 体 の 代 わ り にPBS を 用 い た 陰 性 対 照 群(図1b)に は,反 応 は 認 め ら れ な か っ た 。 1.下 顎 頭 軟 骨 下 顎 頭 軟 骨 は,胎 齢15日 で 下 顎 骨 体 原 基 の 遠 心 端,上 外 側 に,メ タ ク ロ マ ジ ー を 示 す 小 さ な 領 域 と し て 出 現 し(図2),加 齢 と と も に 遠 心 上 外 側 へ 成 長 し て い っ た 。 胎 齢16日 以 降,下 顎 頭 軟 骨 は, 棍 棒 状 の い わ ゆ るcarrot shapeを 示 し,軟 骨 細 胞 図1胎 齢18日 の 下 顎 頭 軟 骨 肥 大 細 胞 層 。a,bは 近 接 し た切 片 の ほ ぼ 同一 の 部 位 。bar=25μm a:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色b:一 次 抗 体 の 代 わ りにPBSと 反 応 させ た 陰 性 対 照 。 免 疫 反 応 は 認 め られ て い な い 図2胎 齢15日 の 下 顎 頭 軟 骨 。下 顎 骨 体 の 遠 心 部 上 外 側 付 近 に メ タ ク ロ マ ジー を認 め た(→)。m:メ ッ ケ ル 軟 骨, bar=100μm 図3胎 齢18日 の 下 顎 頭 軟 骨 。carrot shapeを 示 し,軟 骨 細 胞 の 形 態 か ら層 区 分 が 可 能 と な っ て い る。m:メ ッ ケ ル 軟 骨,bar=200μm 図4胎 齢15日 の 下 顎 頭 軟 骨(図2)の 強 拡 大 。a,b,cは 近 接 し た 切 片 の ほ ぼ 同 部 位 を示 す 。bar=25μm a:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 。丸 み の 強 い,細 胞 質 の 明 る い 軟 骨 細 胞 の 周 囲 の 基 質 に 弱 い メ タ ク ロ マ ジー が 認 め られ る b:抗I型 コ ラ ー ゲ ン抗 体 に よ る 免 疫 染 色 。 軟 骨 基 質 に 比 較 的 明 瞭 な 反 応 が 観 察 さ れ た C:抗II型 コ ラ ー ゲ ン抗 体 に よ る 免 疫 染 色 。 軟 骨 基 質 に 非 常 に 弱 い 反 応 が 認 め ら れ た

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口病 誌1995,62/119 T.B.:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 ont.:陰 性 対 照 群 co1.I:抗I型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 に よ る 免 疫 染 色 col.II:抗II型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 に よ る 免 疫 染 色 図1a∼4c

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20口 病 誌 平成7年3月

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口 病 誌1995,62/121 の形 態 か ら軟 骨 の 層 区分 が 可 能 とな った 。 ま た胎 齢17日 以 降 で は,近 心 の下 顎 骨 体 部 に近 い 部 分 で は,軟 骨 内骨 化 の 開 始 が み られ た。 免 疫 組 織 学 的 な所 見 は,胎 齢 を追 うにつ れ 反 応 強 度 は 強 くな っ たが,胎 齢16日 以 降 は そ の パ ター ン に大 き な違 い を認 め な か っ た た め,胎 齢18日(図3)の 所 見 を 記 載 す る。 胎 齢15日:下 顎 頭 軟 骨 は 膜 内 骨 化 に よ り形 成 中 の下 顎 骨体 原 基 の 遠 心 端,上 外 側 に メ タ ク ロマ ジー を示 す 小 さ な 領 域 と し て は じめ て 認 め られ た。 そ の領 域 は,内 側,上 方,下 方 を下 顎 骨体 の 骨 形 成 領 域 に よ り取 り囲 ま れ,下 顎 頭 軟 骨 と下 顎 骨 体 周 囲 は 未分 化 間葉 細 胞 に よ って 取 り囲 まれ て い た(図2)。 メ タ ク ロマ ジー を示 す 基 質 で 囲 まれ た 軟 骨 細 胞 は,そ の 周 囲 の 骨 基 質 に 近 接 した 骨 芽 細 胞 とほ ぼ 同 等 の 大 き さ を有 し,円 形 に 近 い 形 態 を示 す もの が 多 く,明 調 な細 胞 質 を有 して い た(図 4a)。 抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る 反 応 は,下 顎 頭 軟 骨,下 顎骨 体 両 組 織 を取 り囲 む 未分 化 間 葉 細 胞 周 囲 の 細 胞 外 基 質 に弱 く認 め ら れ,下 顎 頭 軟 骨 基 質 と下 顎 骨 体 の 骨 基 質 に も明 瞭 に認 め られ た。 た だ し,下 顎骨 体 の 骨 基 質 の 反 応 の ほ うが,下 顎頭 軟 骨 の もの よ り明 瞭 で あ っ た(図4b)。 これ に対 して 抗II型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る 反 応 は,下 顎 頭 軟 骨 基 質 に若 干 認 め られ た が,そ の 強 度 は非 常 に 弱 か っ た(図4c)。 胎 齢18日:下 顎 頭 軟 骨 は棍 棒 状 の,い わ ゆ る carrot shapeを 呈 し,軟 骨 細 胞 の 形 態 か ら軟 骨 の 層 構 造 が 認 め られ た。す な わ ち 表 層 か ら,繊 維 層, 増 殖 層,軟 骨 層,肥 大 細 胞 層 な どの 大 まか な細 胞 層 区分 が 可 能 とな って い た。 関 節 表 層 に近 い 層 で は,細 胞 外 基 質 中 に 明 瞭 な メ タ ク ロマ ジー は 認 め られ な い が,あ る程 度 成 熟 した 軟 骨 細 胞 層 で は細 胞 外 基 質 中 に 明瞭 な メ タ クロ マ ジー が 認 め られ た (図3,5a1∼3)。 免 疫 染 色 に よ る所 見 で は,抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に対 す る反 応 が下 顎 頭 軟 骨 全 層 に わ た っ て 細 胞 外 基 質 に観 察 さ れ た が,関 節 に近 い 細 胞 層 ほ ど そ の 反 応 は 明 瞭 で あ り,成 熟 した 層 に な る に従 い 不 明 瞭 に な った が,肥 大 軟 骨 細 胞 層 に お い て も弱 い 反 応 は認 め られ て い た(図5b1∼3)。 一 方,抗II 型 コ ラー ゲ ン抗 体 に対 す る反 応 は,関 節 表 層 の繊 維 層 で は 認 め ら れ ず,軟 骨 基 質 で の メ タ ク ロ マ 図5胎 齢18日 の 下 顎 頭 軟 骨(図3)の 強 拡 大 。a,b,cは 近 接 した 切 片 の ほ ぼ 同 部 位 を示 し,1,2,3は 図3の 1,2,3に 対 応 す る。bar=25μm a:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 a-1:繊 維 層 に お い て は メ タ ク ロ マ ジ ー は 認 め られ ず,増 殖 層 で は 薄 い メ タ ク ロ マ ジ ー を 認 め た a-2:軟 骨 細 胞 層 に な る と,メ タ ク ロ マ ジ ー は か な り明 瞭 に な っ た 。a-3:肥 大 軟 骨 細 胞 層 で は ,強 い メ タ ク ロ マ ジ ー が 認 め られ た b:抗1型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 b-1:繊 維 層,増 殖 層 で は 明 瞭 に 反 応 が 認 め られ た 。b-2:軟 骨 細 胞 層 に な る と徐 々 に 反 応 は 弱 くな っ た b-3:肥 大 軟 骨 細 胞 層 で は 非 常 に 薄:い反 応 が 観 察 さ れ た C:抗II型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 c-1:繊 維 層 で は 反 応 は 認 め られ な か っ たが,増 殖 層 よ り徐 々 に 反 応 が み ら れ る よ うに な っ た c-2:軟 骨 細 胞 層 で,反 応 は 次 第 に 強 く な っ た c-3:肥 大 軟 骨 細 胞 層 に お い て 最 も強 い 反 応 が 観 察 さ れ た T.B.:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 cont.:陰 性 対 照 群 col.1:抗I型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 col.II:抗II型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色

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22口 病 誌 平 成7年3月 ジー が 明 らか に な る に つ れ徐 々 に 出 現 し,明 瞭 な メ タ ク ロ マ ジー の み られ る軟 骨 細 胞 層 よ り下 の 成 熟 し た層 に お い て,細 胞 外 基 質 に 明 瞭 な反 応 が 認 め られ る よ うに な り,そ の 反 応 は 肥 大 軟 骨 細 胞 層 に お い て最 も強 か っ た(図5c1∼3)。 2.脛 骨 軟骨原 基 脛 骨 の軟 骨 原 基 で は 胎 齢13日 に,そ の 細 胞外 基 質 に は じめ て 淡 い メ タ ク ロ マ ジ ー を 認 め た(図 6)。 そ の 後,軟 骨 原 基 は 間 質 性 お よ び添 加 性 成 長 に よ り成 長 し,ま た 骨 幹 部 で は骨 化 の 開 始 が観 察 され た。胎 齢14日 以 降 の 軟 骨 領 域 の 免 疫 組 織 学 的 な所 見 で は,日 齢 を追 う と と もに 反 応 強度 が 増 加 し たが,そ の 反 応 パ ター ン に は 大 き な変 異 を認 め なか っ た た め,胎 齢16日(図7)の 所 見 を記 載 す る。 胎 齢13日:脛 骨 軟 骨 原 基 に お い て,細 胞 外 基 質 に は じめ て メ タ ク ロマ ジー が 認 め られ た。 軟 骨 細 胞 の形 態 は 扁 平 で,脛 骨 軟 骨 原 基 の 長 軸 に 細 胞 長 軸 を 直行 す る よ うに 配 列 して お り,分 裂 像 を示 す 細 胞 も認 め ら れ た(図6,8a)。 免 疫 染 色 に よ る所 見 で は,軟 骨 基 質 に お い て抗 II型 コ ラー ゲ ン 抗体 に 対 す る反 応 が 明 瞭 に 認 め ら れ,さ ら に,抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る反 応 も認 め られ た が,抗II型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る 反 応 と比 較 す る と弱 い もの で あ っ た(図8b,c)。 胎 齢16日:脛 骨 原 基 全 体 は か な り大 き くな り, 骨 幹 中央 部 分 の 骨 髄 に接 す る部 位 に お いて は 血 管 の侵 入,初 期 の 骨 髄 の形 成 が は じ ま って お り,軟 骨 内 骨 化 の 開 始 が 観 察 され た。 軟 骨 領 域 の 関 節 に 近 い 領 域 に お い て は,軟 骨 細 胞 の 配 列 は ラ ン ダ ム で 小 円 形 の 形 態 を示 して い る。 こ れ に 対 して 軟 骨 領 域 の 骨 幹 に 近 い部 分 で は,軟 骨 細 胞 の 形 態 は 幼 弱 な形 態 を示 す もの か ら肥 大 軟 骨 細 胞 に い た る ま で の 細 胞 形 態 の 変 移 が 認 め られ,数 個 の細 胞 が 長 軸 方 向 に連 な っ た成 長 板 軟 骨 に 認 め ら れ る柱 状 構 造 様 の 配列 も認 め られ た(図7,9a1∼3)。 免 疫 染 色 に よ る所 見 か らは,抗II型 コラ ー ゲ ン 抗 体 に対 す る反 応 が,メ タ ク ロマ ジー の み られ る 基 質 中 に 細 胞 の 形 態 に 関 わ りな くほ ぼ 一 様 な 強 度 で認 め られ た(図9c1∼3)。 ま た,骨 端 最 表 層 の 数 個 の細 胞 か ら な る層 の 細 胞 外 基 質 に,明 瞭 な 抗 1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る 反 応 を認 め た。 そ の 反 応 は,表 層 か ら離 れ るに つ れ て徐 々 に 弱 くな り, 将 来 成 長板 軟 骨 に な る と考 え られ る骨 幹 部 に 近 い 部 分 で は 認 め られ な か っ た(図9b1∼3)。 IV.考 察 1.軟 骨化 の時 期 につ いて 軟 骨 は,一 般 的 に そ の基 質 に 軟 骨 型 プ ロ テ オ グ リカ ン とII型 コ ラー ゲ ン が 存在 す る こ とに よ っ て 軟 骨 と し て 同定 され て い る20)。プ ロ テ オ グ リカ ン は,ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 な ど で メ タ ク ロマ ジー を示 す が,生 体 で は 他 に軟 骨 ほ ど 多量 の プ ロ テ オ グ リカ ン を有 す る組 織 が な い ため,組 織切 片 の観 察 に お い て は簡 便 な方 法 と して メ タ ク ロマ ジー を 示 す 基 質 を もつ 組 織 を軟 骨 と同 定 し て い る21)。本 研 究 で も下 顎頭,脛 骨 の発 生 過 程 に お い て,細 胞 間 隙 に は じめ て メ タ ク ロマ ジー が 観 察 され た 時 点 を も っ て軟 骨化 開 始 と同 定 し た。 下 顎 頭 に お い て は,胎 齢15日 に下 顎 骨 原 基 の 遠 心 端 上 側 方 の 間 葉 細 胞 の 細 胞 外 基 質 に は じめ て メ タ ク ロ マ ジー の 出現 が観 察 さ れ た 。 天 願11)は同様 の 所 見 を胎 齢14.5日 に 認 め た こ と を報 告 し て い る。 同系 の マ ウ ス を用 い た に もか か わ らず,メ タ ク ロマ ジ ー の 出 現 に0.5日 の 差 が 生 じた の は,微 妙 な飼 育 状 況 や 個 体 発 育 の 差 な どに よ る と考 え て い る。 しか し なが ら,そ の 後 の下 顎 頭 の成 長 発 育 に 伴 う組 織 構 築 の変 化 に つ い て の観 察 結 果 は,天 願11)の報 告 と一 致 して い た。 下 顎 頭 原 基 に お い て,細 胞 間 基 質 に は じめ て メ タ クロ マ ジー が 観 察 され た の は,下 顎 骨 体 原 基 の 遠 心 端 の 骨 梁 に接 し た狭 い領 域 で あ り,少 数 の 明 調 な 細 胞 質 を有 す る細 胞 が認 め られ た。 そ れ ら の 細 胞 間 隙 は,周 囲 の 骨 芽 細 胞,間 葉 細 胞 の そ れ よ りは 広 くな っ て い た 。 こ の よ う な メ タ ク ロマ ジー の認 め られ る領 域 は,近 遠 心 的 に も きわ め て 狭 い 範 囲 に 限 られ て い た。 免 疫 染 色 に よ り得 られ た興 味 深 い 所 見 は,メ タ クロ マ ジー を示 す 細 胞 外 基 質 に お い て,抗1型 コ ラー ゲ ンに 対 す る反 応 が 明 ら か で あ っ た の に 対 して,抗II型 コ ラ ー ゲ ン に対 す (22)

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口 病 誌1995,62/123 図6胎 齢13日 の 脛 骨 軟 骨 原 基 。 軟 骨 基 質 に は じめ て メ タ ク ロマ ジー を認 め た。bar=100μm 図7胎 齢16日 の 脛 骨 原 基 近 心 端 。 骨 幹 部 で は 軟 骨 内 骨 化 が 開 始 され て い る 。bar=200μm 図8胎 齢13日 の 脛 骨 軟 骨 原 基(図6)の 強 拡 大 。bar=25μm a:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 b:抗1型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 。 細 胞 外 基 質 に 弱 い 反 応 が 認 め ら れ た c:抗II型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 。bに 比 較 す る と,は っ き りした反応 が基質 中に認 め られ た る反 応 は 非 常 に 弱 い もの で あ っ た こ とで あ る。 す な わ ち,下 顎 頭 軟 骨 の 発 生 初 期 段 階 で は,細 胞 外 基 質 に プ ロ テ オ グ リカ ン と と も にI型 コ ラー ゲ ン の 存在 が 確 認 さ れ,軟 骨 特 有 のII型 コ ラー ゲ ン は わ ず か し か 存 在 して い な い こ と が 明 ら か と な っ た。 この 所 見 は 通 常,長 管 骨 の 軟 骨 原 基 に み られ る もの とは全 く異 な る もの で あ る。 本 実 験 で の 脛 骨 原 基 に お け る結 果 で は,胎 齢13日 目で は じめ て メ タ ク ロマ ジ ー が 観 察 され た 細 胞 外 基 質 に お い て, 明 瞭 な抗II型 コ ラー ゲ ン抗体 に対 す る反 応 と,弱 い 抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る 反 応 が 認 め られ

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た 。 長 管 骨 原 基 で の 軟 骨 化 に お い て,未 分 化 問葉 細 胞 は1型 コ ラー ゲ ン を分 泌 す る が,こ れ らの細 胞 が 軟 骨 細 胞 に分 化 す る とII型 コラー ゲ ン を分 泌 す る こ とは,す で に 報 告 され て い る。 す な わ ち, von der Markら17,18)は 鶏 の 長 管 骨 原 基 の 軟 骨 化 に お い て,未 分 化 間 葉 細 胞 は1型 コラー ゲ ン を分 泌 す るが,軟 骨 に分 化 す る とII型 コラー ゲ ン を分 泌 す る こ とを免 疫 組 織 学 的 手 法 に よ り報 告 して い る。また,笹 野 ら22)はマ ウ ス胎 仔 の 軟 骨 組 織 を用 い て基 質 中 の コ ラー ゲ ン を免 疫 組 織 学 的 に検 索 して い る。 彼 ら は,前 肢 中手 骨 の 軟 骨 原 基 に お い て, 胎 齢12日 で は 間 葉 細 胞 の凝 集 塊 が観 察 され,抗1 型 コラ ー ゲ ン抗 体 に 反 応 を示 す が,抗II型 コ ラー ゲ ン抗 体 に は 弱 く しか 反 応 しな い こ と,基 質 が ア ル シ ア ン ブ ル ー 染 色 で染 色 さ れ る胎 齢13日 で は 抗II型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 して 反 応 が 認 め られ, さ ら に抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る反 応 も弱 く 認 め られ る こ と,胎 齢14日 で は抗II型 コラー ゲ ン 抗 体 に 対 す る 反 応 が 強 くな る 一 方 で,抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る反 応 は軟 骨 膜 の み に 限局 し て くる こ と を報 告 して い る。 彼 らの 結 果 か らは, 軟 骨 基 質 のI型 コ ラー ゲ ン は軟 骨 細 胞 に 分 化 す る 前 の 間 葉 細 胞 が分 泌 した もの の残 存 で あ る と考 え られ る。 しか し なが ら,本 研 究 で得 られ た 胎 齢15 日の 下 顎頭 軟 骨 基 質 で の 抗1型 コ ラー ゲ ン抗 体 に 対 す る反 応 は 骨 基 質 で 認 め られ た もの よ りは,若 干 弱 い もの で は あ っ た が,間 葉 細 胞 周 囲 に認 め ら れ た もの よ りは,格 段 に 強 く,軟 骨 細 胞 自体 が分 泌 した もの で あ る可 能 性 が 強 い よ うに 考 え ら れ た 。 こ の可 能 性 が 肯 定 され るの で あ れ ば,下 顎頭 軟 骨 の 細 胞 は,発 生 の初 期 に は,メ タ ク ロマ ジ ー を示 す プ ロ テ オ グ リカ ン を分 泌 しつ つ,同 時 に1 型 コ ラー ゲ ン を分 泌 し,さ らに 若 干 のII型 コラー ゲ ン を分 泌 す るわ け で あ り,基 質 コ ラー ゲ ン の分 泌 に お い て,長 管 骨 の軟 骨 原 基 とは全 く異 な る性 質 を有 す る こ とに な る。 また,未 分 化 間 葉 細 胞 か ら軟 骨 芽 細 胞 を経 て軟 骨 細 胞 に 分 化 して行 く過 程 で,軟 骨 特 有 の 基 質 の 分 泌 が徐 々 に行 わ れ るが,こ の と きプ ロテ オ グ リ カ ン の分 泌 に先 だ って,II型 コ ラー ゲ ン の分 泌 が 開 始 され る こ とが 鶏 のlimbbudを 用 い た研 究 よ り報 告 され て い る20)。しか し,今 回得 られ た 胎 齢 15日 の 下 顎 頭 軟 骨 で の 所 見 で はII型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に対 す る反 応 が 非 常 に 弱 く,下 顎 頭 軟 骨 に お い て もプ ロ テ オ グ リカ ンの 分 泌 に 先 だ っ てII型 コ ラー ゲ ンの分 泌 が 開 始 され て い るの か ど うか は 疑 問 に思 わ れ た。 こ れ らの 点 を 明 らか にす る た め に は,免 疫 電 顕 法 やin situ hybridization法 に よ る

図9胎 齢16日 の 脛 骨 原 基 近 心 端(図7)の 軟 骨 領 域 の 強 拡 大 。a,b,cは 近 接 し た切 片 の ほ ぼ 同部 位 を示 し,1, 2,3は 図7の1,2,3に 対 応 す る 。bar=50μm a:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 a-1∼3:強 い メ タ ク ロ マ ジ ー が 軟 骨 基 質 全 体 に 認 め られ る b:抗I型 コ ラ ー ゲ ン抗 体 に よ る免 疫 染 色 b-1:関 節 表 層 の 数 層 の 細 胞 か ら な る 層 に,や や 明 瞭 な 反 応 が み ら れ,そ の 下 の 層 に は 薄 い 反 応 が 認 め ら れ た b-2,3:免 疫 反 応 は 認 め ら れ な か っ た C:抗II型 コ ラー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 c-1∼3:関 節 表 層 近 くか ら,肥 大 軟 骨 層 に い た る ま で,ほ ぼ一様 な反応 が認 め られ た T.B.:ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 cont.:陰 性対 照 群 col.1:抗I型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色 co1.II:抗II型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 に よ る免 疫 染 色

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26口 病 誌 平 成7年3月 検 索 が 必 要 と考 え て い る。 Whitson23)は,下 顎 骨 原 基 を構 成 す る 未分 化 間 葉 細 胞 は骨 芽 細 胞 に分 化 し,下 顎 骨 体 の 膜 内骨 化 に 関 与 す る と述 べ て い る。本 研 究 に お け る胎 齢15 日の 下 顎 頭 の 所 見 よ り,下 顎 頭 軟 骨 は 下 顎 骨 原 基 の 遠 心 端 に 下 顎 骨 体 の 骨 梁 に 接 して 出 現 し,か つ 下 顎 骨 体 を取 り囲 ん で い る もの と同 一 の 未 分 化 間 葉 細 胞 に 囲 まれ て お り,そ の 時 点 の 軟 骨 基 質 に は 1型 コ ラー ゲ ン が 存 在 す る こ とが 示 さ れ た 。 天 願11)は,下 顎 頭 軟 骨 は 下 顎 骨 体 原 基 遠 心 部 の上 外 側 に発 生 し,そ の 内側 は 下 顎 骨 体 原 基 に接 し,外 側 は未 分 化 間 葉 細 胞 に 接 して い る こ と,下 顎 骨 体 原 基 の骨 基 質 に連 続 して 細 胞 間 隙 の 開 大 を認 め, その 細 胞 間 隙 に メ タ ク ロマ ジー が 認 め られ た こ と を報 告 して い る。今 回 の 胎 齢15日 の 組 織 学 的 所 見 は,天 願11)の所 見 と胎 齢 を除 け ば 一 致 す る もの で あ る。 以 上 の 組 織 学 的 観 察 よ り,下 顎頭 軟 骨 の 発 生 す る部 位,お よび 周 囲 組 織 の 形 態 的連 続 性 を考 え る と,下 顎 頭 軟 骨 は 下 顎骨 体 原 基 を取 り囲 み, 将 来 骨 芽 細 胞 に分 化 し下 顎骨 体 の 形 成 に 関 与 す る 未 分 化 間 葉 細 胞 集 団 の 一 部 よ り分 化 して くる もの と考 え られ た。 さ ら に,本 研 究 で 明 らか に な っ た 発 生 初 期 の軟 骨 基 質 のI,II型 コラー ゲ ン の局 在 を も考 え あ わせ る と,下 顎 頭 軟 骨 は 骨 芽 細 胞 へ 分 化 す る間 葉 細 胞 集 団 の 一 部 よ り分 化 す る ため,軟 骨 細 胞 に分 化 した 後 も1型 コ ラー ゲ ン分 泌 能 を有 して い る もの と推 察 さ れ た 。 2.軟 骨化 開始 よ り3日 後 の所 見 につ いて 胎 齢16日 以 降 の下 顎 頭 軟 骨 の 組 織 学 的 所 見 で は,生 後 の下 顎 頭 軟 骨 に お い て認 め られ る軟 骨 細 胞 の 層 構 造24,25)がす で に 認 め られ た。 免 疫 組 織 学 的 な所 見 で は,反 応 の 強 弱 は あ る もの の 下 顎 頭 軟 骨 全 層 に わ た って1型 コ ラー ゲ ンの 局 在 が 認 め ら れ て お り,こ れ は,4週 齢 ラ ッ トの 下 顎 頭 軟 骨 で の 所 見16)と同 様 の所 見 で あ っ た 。ま た 胎 齢16日 の 長 管 骨 原 基 に お い て は,軟 骨 細 胞 の 形 態 お よび 配 列 様 式 か ら,将 来,関 節 軟 骨 に分 化 す る部 分 と成 長 板 軟 骨 に 分 化 す る部 分 とが 判 別 され た。 将 来 成 長 板 軟 骨 に 分 化 す る と考 え られ る部 分 で は,メ タ ク ロ マ ジー を示 す 軟 骨 基 質 に1型 コ ラー ゲ ンの 反 応 は な く,軟 骨 細 胞 に 形 態 的 な差 異 が 認 め られ た に もか か わ らず,ほ ぼ 一 様 なII型 コ ラー ゲ ンの 反 応 が 認 め られ た。 こ の よ うな所 見 は4週 齢 ラ ッ ト の 成 長 板 軟 骨 で の所 見16)と同 じ で あ っ た。 こ の よ うに胎 生 後 期 に お い て,す で に下 顎 頭 軟 骨 と長 管 骨 の将 来 の 成 長 板 軟 骨 とで は,I,II型 コ ラー ゲ ン の局 在 パ ター ン は 生 後 に認 め られ る もの と同 様 で あ り,し か も,生 後 と同様 に相 違 が み られ る こ とが 示 され た。 Silvermann26)ら は,新 生 マ ウ スの プ ロゲ ニ ター 細 胞 層,す な わ ち 前 軟 骨 芽 細 胞 層 に お い て は 細 胞 外 基 質 にI型 コ ラー ゲ ン,細 胞 質 内 に は プ ロ1型 コ ラー ゲ ン が 存在 す る こ と を免 疫 組 織 学 的 に 示 し て い る。 本 研 究 に お い て も,下 顎 頭 軟 骨 の 表 層 近 くの 未 分 化 な細 胞 層 か らあ る程 度 成 熟 した 軟 骨 細 胞 層 の 間 で は,1型 コラ ー ゲ ンの 局 在 が 明 確 に示 され て お り,あ る程 度 分 化 し た軟 骨 細 胞 ま で は, 1型 コ ラー ゲ ン を分 泌 して い る と考 え られ る。 ま た,下 顎 頭 軟 骨 の 肥 大 軟 骨 細 胞 層 に お いて,微 弱 な1型 コラ ー ゲ ンの 反 応 が観 察 さ れ た が,そ れ は 4週 齢 ラ ッ トの 組 織 で の 所 見16)で も 同 様 で あ っ た 。 肥 大 軟 骨 細 胞 がII型 コ ラー ゲ ン と と もに1型 コ ラー ゲ ン もわ ず か に分 泌 して い るの か,ま た は, 肥 大 細 胞 層 に ま で成 熟 す る以 前 の,よ り未 熟 な 軟 骨 細 胞 が分 泌 し た もの の 残 存 な の か は 明 らか で は な く,さ ら な る検 索 が 必 要 と考 え られ た。 長 管 骨 の 原 基 で も,将 来,関 節 軟 骨 に分 化 す る 部 分 に お い て は,表 層 にI型 コ ラー ゲ ン とII型 コ ラー ゲ ン両 者 の 存 在 す る層 が 観 察 され る。1型 コ ラー ゲ ンの 反 応 は,深 層 に行 くに従 い,弱 くな り, 将 来 成 長板 軟 骨 に な る部 分 で は 認 め ら れ な い 。 長 管 骨 骨 端 部 表 層 で は,間 葉 細 胞 か ら軟 骨 細 胞 へ の 添 加 性 の 成 長 が あ る こ とが 知 られ て い る が,von der Markら17,18)は,鶏 の 長 管 骨 の 軟 骨 原 基 の 骨 端 部 表 層 部 に免 疫 組 織 学 的 にI型 コ ラー ゲ ンの 局 在 を示 し,添 加 性 に 軟 骨 に分 化 す る前 の 間葉 細 胞 が 分 泌 し た もの の 残 存 で あ ろ う と推 測 して い る。 Mundlosら27)の ヒ ト長 管 骨 の 発 生 過 程 に お け る in situ hybridization法 に よ る実 験 で は,1型 コ ラ ー ゲ ンmRNAは 軟 骨 細 胞 に は 認 め られ ず,周

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口 病 誌1995,62/127 囲 の 間 葉 細 胞 と軟 骨 膜 に 観 察 さ れ た 。し た が っ て, 長 管 骨 原 基 の 骨 端 部 表 層 に 観 察 さ れ る1型 コ ラ ー ゲ ン は,軟 骨 細 胞 に よ る 下 顎 頭 軟 骨 の1型 コ ラ ー ゲ ン と は 異 な る 由 来 と 思 わ れ る 。 以 上 よ り,下 顎 頭 軟 骨 はI,II型 コ ラ ー ゲ ン の 局 在 に 関 し て,長 管 骨 原 基 の 軟 骨 と は 胎 生 期 よ り 明 ら か に 異 な る こ と が 示 さ れ,さ ら に,メ タ ク ロ マ ジ ー を は じ め て 認 め た 胎 齢15日 に は,下 顎 頭 軟 骨 の 細 胞 外 基 質 にII型 コ ラ ー ゲ ン よ り は1型 コ ラ ー ゲ ン の 局 在 が 顕 著 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 し か し な が ら,本 研 究 は 免 疫 組 織 学 的 手 法 の み に よ る も の で あ り,細 胞 間 基 質 で の 局 在 は 把 握 で き て も分 泌 し て い る 細 胞 の 同 定 ま で は で き て い な い 。 謝 辞 稿 を 終 え る に あ た り,ご 懇 篤 な る ご指 導,ご 校 閲 を 賜 り ま し た 黒 田 敬 之 教 授 に 謹 ん で 感 謝 の 意 を 表 し ま す 。 ま た,終 始 懇 切 な る ご指 導,ご 教 示 を い た だ き ま し た 歯 学 部 歯 科 矯 正 学 第2講 座 鈴 木 聖 一 助 手 と 天 願 俊 泉 博 士 に 感 謝 い た し ます 。 さ らに 本 研 究 を行 う に あ た り,終 始 ご支 援 い た だ き ま し た 歯 学 部 歯 科 矯 正 学 第1 講 座,第2講 座 の 皆 様,な らび に,多 くの ご 助 言 を い た だ き ま し た 大 学 院 歯 学 研 究 科 生 体 機 能 制 御 歯 科 学 系 発 生 機 構 制 御 学 講 座 の 江 藤 一 洋 教 授 を は じ め とす る 皆 様 に 厚 くお 礼 申 し上 げ ま す 。 本 論 文 の 一 部 は,第40回J.A.D.R.総 会(1992年 11月30日,12月1日),第35回 歯 科 基 礎 医 学 会 総 会 (1993年10月12,13日)に お い て 発 表 した 。 文 献

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参照

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