ヘムオキシゲナーゼの酵素反応を原子スケールで追
跡する
著者
齋藤 正男
ヘムオキシゲナーゼの酵素反応を原子スケールで
追跡する
(課題番号14380300)
平成1 4年度∼平成1 5年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))
研究成果報告書
平成1 6年5月
研究代表者 斎藤 正男
(東北大学･多元物質科学研究所･教授)
ヘムオキシゲナーゼの酵素反応を原子スケールで
追跡する
(課題番号14380300)
平成1 4年度∼平成1 5年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))
研究成果報告書
平成1 6年5月
研究代表者 斎藤 正男
(東北大学･多元物質科学研究所･教授)
-1-平成1 4年度∼-1-平成1 5年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))
研究成果報告書
ヘムオキシゲナーゼの酵素反応を原子スケールで追跡する
はしがき
ヘムオキシゲナ-ゼ(HO)は酸素を還元的に活性化することにより､ヘム(鉄ポルフィ
リン錯体)をどリベルジン･一酸化炭素(co) ･鉄イオンへと分解する酵素である｡当初､
ほ乳類におけるへム代謝･鉄の恒常性維持に中心的な役割を果たすと考えられてきたが､近
年になってどリベルジン(およびその誘導体)の抗酸化作用や､ coによるシグナル伝達作
用についても明らかにされつつある｡また､細菌･植物･昆虫などのHOも次々に同定され､
その多彩かつ重要な生理的役割に興味が持たれている｡
生体内での重要性にもまして､ HO反応はその特異な反応機構についても多くの研究者の
注目を集めている｡ヘム分解は3段階の酸素活性化によって進行するが､ HOは補酵素を持
たない単純蛋白質であり､酸素の活性化は基質であるヘム自身が行う｡ -ムによる酸素の活
性化はP-450などで古くから良く知られているが､通常の-ム酵素は｢ヘムを活性種に用い
て外来基質を酸化する｣のみで､ ｢ヘムを分解する｣ことはない｡このため､ -ムの酸化分
解を行うHO独自の酸素活性化機構や､それを可能にする酵素の役割などに興味が持たれ､
精力的な研究が成されてきた｡
本研究を開始した時点で､ HO反応の多くの中間体が同定されており､通常のへム酵素と
の反応経路の違いなどは解明されていた｡また､反応の開始段階に当たるH0-へム複合体の
結晶構造も報告されており､ -ム分解に重要なアミノ酸残基なども明らかにされていた｡し
かし､なぜ反応経路が異なり､重要なアミノ酸はどのように反応を制御するか､といったHO
反応の本質は未だ不明であった｡その主な原因に挙げられるのは､ ｢ヘムおよびその代謝中
間体｣を観測してはいるが､ ｢これらを取り巻くHO酵素｣を見ていない点である｡つまり､
反応中のHOの構造は反応開始時の構造から類推せざるを得ず､ HOの多段階反応を考える
上ではあまりにも不確実であった｡
本研究ではHO反応の本質を詳細に至るまで徹底的に解明するために､全反応中間体のⅩ
線結晶構造解析を目標とした｡ HOの結晶化法､結晶状態での中間体詞製法､および､その
評価法などを確立することにより､現在までに同定されている8つの反応中間体のうち､ 5
っまでの結晶構造解析に成功した｡残りの中間体に関しても､その調製法におおよその目途
はついており､近い日に全ての構造が解明出来ると考えている｡これらの構造解析により､
HO反応への理解が深まるのは当然であるが､全反応中の酵素の動きを原子レベルで捉える
ことにより､他の酵素についても｢酵素が如何にして反応を触媒するか｣を考える上で貴重
な見解を与えるものと期待している｡
平成16年5月
研究代表者 斎藤正男
平成1 4年度∼平成1 5年度科学研究費補助金(基盤研究(B)(2))
[課題番号] 14380300[研究課題] -ムオキシゲナ-ゼの酵素反応を原子スケールで追跡する
[研究組織]
研究代表者:欝藤 正男
研究分担者:富田 毅
研究分担者:松井 敏高
研究分担者:海野 昌喜
【交付決定額(配分額)]
(東北大学･多元物質科学研究所･教授)
(東北大学･多元物質科学研究所･助手)
(東北大学･多元物質科学研究所･助手)
(東北大学･多元物質科学研究所･助手)
(金額単位:千円)
直接経費 亊I ｨﾆ N 合計 平成15年度 途ﾃc 0 途ﾃc 平成16年度 釘ﾃS 0 釘ﾃS 総計 "ﾃ 0 "ﾃ-3-[研究発表]
(I)学会誌など
I. Davydov, R., Kofman, V･, Fujii, H･, Yoshida, T･, Ikeda-Saito, M･, and Hoffman, BI M･ (2002) J･
Am. Chem. Soc. 124(8), 1798-1808. --Catalytic mechanism of heme oxygenase through EPR and
ENDOR ofclツOreduced叩-heme opgenase and its ASP 140 mutants"
2. Denisov, I. G., Ikeda-Saito, M., Yoshida, T., and Sligar, S. G. (2002) FEES Left. 532(1-2),
203-206. "CTTOgem'c absorption spectra of hydT10PeT10XOjerric heme oxygenase, the active E'ntermediate ofenzymatic heme oJygenation ''
3. Gonzalez, G., Dioum, E. M., Bertolucci, C. M., Tbmita, T., Ikeda-Saito, M., Cheesman, M. R.,
Watmough, N. J.,and Gilles-Gonzalez, M･ A･ (2002) Biochemistry 41(26), 8414-8421. ''Natwe
of the displaceable heme-axial residue in the EcDos pllOteL'n, a heme-based sensor Pom
Escherichia coliT'
4. Sasakura, Y., Hirata, S., Sugiyama, S., Suzuki, S., Taguchi, S., Watanabe, M., Matsui, T., Sagami,
1.,and Shimizu, T. (2002) ). Biol. Chem. 277(26), 23821-23827. ''Characterization of a direct
oxyge? sensor heme pIVtein Pom Escherichia coli･ Enects of the heme redox states and
mutat10nS at the heme-binding sL'te on catalysis atui
structuT4-5. Tomita, T., Gonzalez, G., Chang, A. L., Ikeda-Saito, M., and Gilles-Gonzalez, M. A. (2002)
BiochemistTy 41(15), 4819-4826. '■A comparative resoluZnCe Raman analysis of heme-binding
fnS domains: heme iT10n COOTdination structures of the EjFixL,, AxPDEAl, EcDos, afui MtDos
protein51.
6. Watanabe, M., Matsui, T., Sasakura, Y., Sagami, I., and Shimizu, T. (2002) BLlochem. Biophys.
Res. Commun. 299(2), 169-172. .'Unusual cyanide bindings to a heme-regulated
phosphodiesterase Pom Escherichia colt: eHect ofMet95 mutations'.
7. Bulteau, A.し., Ikeda-Saito, M., and Szweda, L I. (2003) BiochemistTT 42(50), 14846114855.
-'Redar-dependent modulation ofaconitase activityin intact mitochondrid'
8. Coyle, C. M., Vogel, K. M･, Rush, T･ S･, 3rd, Kozlowski, P･ M., Williams, R., Spiro, T. G., Dou,
Y., Ikeda-Saito, M., 01son, J. S.,and Zgierski, M. Z. (2003) Biochemistry 42(17), 4896-4903.
"FeNO structuT･e in distal pocket mutants ofmyoglobin based on resot∽nce Raman
spect710SCOPy-9. Davydov, R., Matsui, T., Fujii, H･, Ikeda-Saito, M･, and Hoffman, BI M. (2003) J. Am. Chem. Soc.
125(52), 16208-16209. "Kinetic LIsotope eHects on the rateJimiting step of heme oやgenaSe cataLysis L'tuiicate concerted proton trafLSfeT'/heme
hydT10itylation●-10. Hirata, S., Matsui, T., Sasakura, Y., Sugiyama, S., Yoshimura, T., Sagami, I., and Shimizu, T.
(2003) Eur. J. Biochem. 270(23), 47714779...Characterization of Met95 mutants of a heme-reguLated phosphodiesterase Pom Escherichia coli･ Optical absorption, magnetL'c ciyICular dichT10ism, cillCular dichroism, and redox potentialsH
ll. Li, Y., Syvitski, R. T., Chu, G. C., Ikeda-Saito, M., and Mar, G. N. (2003) J. Biol. Chem. 278(9), 665116663. 1'Solution lH NMR investigation of the active site molecular and electronic
structwes of substrate-bound, cyanide-inhibited HmuO, a bacterial heme oLqgenaSe Pom
12.富田毅･斎藤正男(2003)生化学75(7),577-587. ｢最近のヘムタンパク質研究｣
13･ Voegtle, H･ L., Sono, M･, Adak, S･, Pond, A･ E･, Tomita, T･, Perera, R･, Goodin, D･ B･･
Ikeda-Saito, M., Stuehr, D. J.,and Dawson, J. H. (2003) BiochemistTy 42(8), 2475-2484･ "spectroscopic chwacterization of βye- and sir-coordinate ferrous-NO home complexes･
Evidence for heme Fe-pTximal cysteinate bond cleavage in the ferrous-NO adducts of the
Trp-409Tyr/Phe proximal envlrOnment mutants Of neuTVnal lu'tric oxide syruhasef'
14･ Yang, H･ J･, Matsui, T･, Ozaki, S･, Kato, S" Ueno, T･, Phillips, G･ N･, Jr･, Fukuzumi, S"and
Watanabe, Y. (2003) Biochemistry 42(34), 10174-10181･ '■MoLecuLar engineeriTg of myogLobin:
injluence of residue 68 0n the rate and the erumtioselectivityof oxiddtion reactl0nS Catalyzed by
fI64D/V68X myoglob in '■
15. Zhang, X., Fujii, H., Matera, KI M., Migita, C･ T･, Sun, D･, Sato, M･, Ikeda-Saito, M･,and Yoshida, T. (2003) Biochemistry 42(24), 741 8-7426. I-SteT7eOSelectivityof each of the three steps ofthe heme opgeruZSe reaCtionl hemin to meso-hydrophemin, meso-hydroLqhemin to vendoheme,
and veTdoheme to biliveTdin"
16. Hirotsu, S., Chu, G. C., Unno, M.,Lee, D. S., Yoshida, T., Park, S. Y., Shiro,Y., and lkeda-Saito,
M. (2004) J. Biol. Chem. 279(12), 11937-11947. "The crystal structures of the fe-'c atuiferrou∫
forms of the heme complex ofHmuO, a heme oxygenase of CoTynebacterium dl'phtheriae''
17. Taguchi, S., Matsui, T･, IgaJaShi, J･, Sasakura, Y･, Araki, Y･, Ito, 0･, Sugiyama, S･, Sagami, I･, and Shimizu, T. (2004) J, BioL. Chem. 279(5), 334013347. "Binding of opgen and carbon monoxide
to a heme-ngukzted phosphodiesterase Pom Escherichia colt. Kinetics and inPared spectra of
thebll-length wild-type enzyme, isolated Fas domain, and Met-95 mutants"
18. Unno, M., Matsui, T., Chu, G. C., Couture, M., Yoshida, T., Rousseau, D. L., OIson, J. S., and Ikeda-Saito, M. (2004) J. Biol. Chem. 279(20), 21055-21061. "Crystal Structure of the
DL'oxygen-boului Heme Oxygenase Pom Coヮnebacterium diphtheriae: IMPL,ICATIONS FOR
HEME OXYGENASE
FUNCTION'-(ⅠⅠ)口頭発表 1.広津晶子･海野昌書･Grace C. Chu･李東善･朴三用･吉田匡･城宜嗣･斎藤正男｢Ⅹ
線結晶構造解析を基盤としたへムゲナ-ゼの反応機構｣第75回日本生化学会大会
(2002.10.15) 2.富田毅･斎藤正男｢センサー型へムタンパク質｣第75回日本生化学会大会(2002.10.17) 3.松井敏高･吉田匡･斎藤正男｢ヘムオキシゲナ-ゼcompound Iの生成と反応｣第75回日 本生化学会大会(2002. 10.17)4.平就介･富田毅･五十嵐和彦･斎藤正男｢転写制御因子Bachlのヘム配位構造｣第75回
日本生化学会大会(2002.10.17)5. Shoko Hirotsu, Grace C. Chu, Dong-Sun Lee, Masaki Unno, Yoshitsugu Shir°, Masao
lkeda-Saito ｢crystal Structures of Hmu 0, a Heme Oxygenase from C･ diphtheriae｣ Cordon Research
Conference. Metals in Biology (2003.2.2)
ー5-6. Shusuke Hira, Takeshi Tomita, Kazuhiko Igarashi, Masao lkeda-Saito ｢Heme Environments of a
Transcnpt10n Factor, BachlJ Cordon Research Conference･ Graduate Seminar in Bioinorganic
Chemistry (2003.2.7)
7.稲垣さや香･松井敏高･富田毅･吉田匡･藤井浩･斎藤正男｢2,4位置換体ヘムを用い
たヘムオキシゲナ-ゼの反応機構の研究｣日本化学会第8 3春季年会(2003.3.18)8.古川桃子･松井敏高･富田毅･海野昌喜･斎藤正男｢バクテリア型へムオキシゲナ-ゼ
におけるへム近傍アスパラギン酸の役割｣日本化学会第8 3春季年会(2003.3.18)9.平就介･富田毅･五十嵐和彦･君藤正男｢転写制御因子Bachlのヘム近傍構造｣第30回
生体分子科学討論会(2003.6.28)10.松井敏高･古川桃子･海野昌喜･賛藤正男｢バクテリア型へムオキシゲナ-ゼによるヘ
ム分解反応における遠位アスパラギン酸の役割｣第5 3回錯体化学討論会(2003.9.26)
ll. Masao Ikeda-Saito rActive Site Structureand itslmplication for the Catalytic Mechanism of
Heme Oxygenase｣ Heme Oxygenase: Regulation, Functions 良 Clinical Applications (2003･9･29)
12.海野昌喜･松井敏高･富田毅･賓藤正男｢The CrystalStructure of Heme Oxygenase from corynebacterium diphtheriae (HmuO)-heme Complexes Bound to Ligands｣第7 6回生化学会
大会(2003.10.15)
13.松井敏高･古川桃子･海野昌書･斎藤正男｢Role ofa DistalAspartic Acid in Heme Degradation by a BacterialHeme Oxygenase｣第76回日本生化学会大会(2003.10.16)
14.中島彩･松井敏高･藤井浩･吉田匡･斎藤正男｢ヘムオキシゲナ-ゼによるベルドヘム
代謝機構｣日本化学会第84春季年会(2004.3.28)
(ⅠⅠⅠ)出版物
I. Masao Ikeda-Saito, Hiroshi Fujii ''EPR characterization of heme oxygenase reaction
intermediates and its implication for the catalytic mechanism" Paramagnetic Resonance of MetaL Prvteins, ACS Symposium Series VOL. 858, Joshua Tesler, AmeriCanChemicalSociety, 97-112 (2003).
2.海野昌書･斎藤正男｢放射光科学入門｣ (渡辺誠･佐藤繁 編) 9-4 ｢Ⅹ線回折による構
造解析･蛋白質｣ (pp.2341242) (2004)東北大学出版会､仙台
3.棄藤正男｢放射光科学入門｣ (渡辺誠･佐藤繁 編) 1015 ｢EXAFSによる局所構造解析･ 金属蛋白質｣ (pp.270-273) (2004)東北大学出版会､仙台
[研究成果] (Se一ected Pub一ications)
1. Davydov, R., Kofman, V., Fujii, H., Yoshida, T., Ikeda-Saito, M･,and Hoffman, B･ M. (2002) J･ Am. Chem. Soc. 124(8), 1798-1808. "Catalytic mechanism of heme oxygenase thT10ugh EPR and ENDOR ofcTyOreduced oxy-heme oqgenase and its Jhp I40 mLEtantS"
2. Demisov, I. G., Ikeda-Saito, M., Yoshida, T., and Sligar, S. G. (2002) FEBS Left. 532(112), 203-206. "Cryogenic absorption spectra of hydnopelVXO-fe-'c heme oxygenase, the active inteT.mediate ofenzymatic heme oJqgenation ''
3. Gonzalez, G., Dioum, E. M., Bertolucci, C. M., Tomita, T., Ikeda-Saito, M., Cheesman, M. R.,
Watmough, N. J･,and Gilles-Gonzalez, M･ A･ (2002) BiochemistT7 41(26), 8414-842l･ I-Nature
of the dispLaceabLe heme-arial residue in the EcDos protein, a heme-based sensor Pom
Escherichia coli'r
4. Tomita, T., Gonzalez, G., Chang, A. L., Ikeda-Saito, M･, and Gilles-Gonzalez, M･ A･ (2002) BL'ochemistTy 41(15), 4819-4826. I-A comparwive resonance Raman atwlysis of heme-biluiing
FhS domains.･ heme LITlDn COOTdination sかuctures of the EjFixL, ArPDEAl, EcDos, and MtDo∫
pT10teins "
5. Bulteau, A. L., Ikeda-Saito, M.,and Szweda, L. I. (2003) Biochemistry 42(50), 14846114855･ "Redox-dependent modulation ofacotu'tase activityin intact mitochondria "
6. Coyle, C. M., Vogel, K. M., Rush, T. S., 3rd, Kozlowski, P･ M., WllliamS, R･, Spiro, TI G･, Dou,
Y., lkeda-Saito, M., 01son, J. S., and Zgierski, M. Z. (2003) BiochemistTT 42(17), 489614903･ "FeNO structwe in distal pocket mutants ofmyoglobL'n based on resotwnce Raman spect710SCOPyl'
7. Davydov, R., Matsui, T., Fujii, H., Ikeda-Saito, M･, and Hoffman, BI M･ (2003) J･ Am･ Chem･ Soc･
125(52), 16208-16209. llKinetic isotope eHects on the rate-Limiting step Of heme oxygenase caEalysis indicate concerted proton trarLger･/heme
hydrlDPLatiod-8. Li, Y., Syvitski, R. T., Chu, G. C., Ikeda-Saito, M.,and Mar, G. N. (2003) J. Biol. Chem･ 278(9), 6651-6663. 1lSoLution lH NMR investigation of the active site moLecuhzr alui electTIOfu'c
structwes of substrate-bound, cyanide-inhibited HmuO, a bacterial heme oxygenase Pom
ColTnebacterium diphtheriae '1
9.富田毅･斎藤正男(2003)生化学75(7),577-587. ｢最近のヘムタンパク質研究｣
10. Zhang, X., Fujii, H., Matera, K. M., Migita, C･ T･, Sun, D･, Sato, M･, Ikeda-Saito, M･, and Yoshida, T. (2003) Biochemistry 42(24), 741 817426. "Stereoselectivityof each of the three steps
ofthe heme叩genaSe TleaCtion: hemin to meso-hydT10Xyhemin, meso-hydTlDPhemin to veTdoheme, and vendoheme to biliveTdin ■■
ll. Ilirotsu, S., Chu, G. C., Unno, M.,Lee, D. S., Yoshida, T., Park, S. Y., Shiro, Y., and Ikeda-Saito,
M. (2004) J. Biol. Chem. 279(12), 1 1937-1 1947. ■■The crystal structures of the ferric andferT10uS
forms of the heme complex ofHmuO, a heme叩geuSe OfCoTynebacterium diphtheriaeH
12. Unno, M., Matsui, T., Chu, G. C., Couture, M., Yoshida, T., Rousseau, D. L OIson, J. S., and
lkeda-Saito, M. (2004) J. Biol. Chem. 279(20), 21055121061. I-Crystal Structure of the
Dio叩gen-bound Heme Oxygenase Pom Coヮnebacterium dl'phtheriae: IMPLICATIONS FOR
HEME OXYGENASE FUNCTION.
