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<Original Article> Die Immunocytochemische Lokalisation der Sulfitoxydase in den Mitochondrien der Rattenleber-Parenchymzellen 利用統計を見る

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(1)

OyiginaS Argiege

Die

Immunocytochemische

Mitochondrien der

Lokalisation der Sulfitoxydase in

Rattenleber-Parenchymzellen

den

AnaLomisches Instit'ttt

Sadaki Yokota

der Aiedizinischen Hochschttle Yamanashi*

Zusammeltfassung: Die Lokalisation (ler Sulfitoxydase in clen Mitochoxxdrien der Ratten-leber-parenchymzellen wurde unter Einsatz der Immunoenzym- und Immunogold-Techniken untersucht. Lichtmikroskopisch war das dunkelbraune Reaktionsprodukt f(ir dicses Enzym in kleinen cyteplasmatischen Granula nachweisbar. Elektronenmikroskopisch wui"den die Goldpartikel, spezifisch ftir den Sitz des Antigens, in allen Mitochondrien der Parenchym-zellen beobachtet. Die meisten Goldpartikel befanden sich auf den Cristae oder auf dem Intermcmbranraum der Mitochondrien. In Kontrollschnitten, die rnit absorbiertem IgG

inkubiert wurden, wurden keine Goldpartikel auf den Mitochondrien beobachtet. Die

Ergebnisse zeigcn morphologisch, daB die Sulfitoxydase ausschlieBlich in dem Interrnem-branraum der Mitochondrien lokalisiert ist.

Schltisselw6rter: Immunocytochemie, Sulfuoxydase, Intermembranraum der Mitochondrien,

Parenchymzelle, Rattenleber

EINLEITUNG

Sulfitoxydase (sulfite: oxigen oxidoreduc-tase E.C. 1.8.8.l.) ist ein molybdafthaltiges

HamoproteiR, das bei dem oxydativen

Abbau der Schwe£elaminosauren als

teTmi-nales Enzym dient, Das Enzym ist auis der

Leber vofi Rind3・4・5), HUhncheni4) und

Mensch9> gereinigt und charakterisiert

worden. Ebenfalls ist die Beziehung

zwi-schen diesem Enzym und dem Stoffwechsel

des Molybdans bei der Ratte sehr

um-fassend untersucht worden6,i-O,ii,i3). Diese

Oxydase kann aus unverle£zten

Mitochon-drien entweder mit einer hypotonischen

L6sung oder mit Detergenzien 'extrahiert

werden8・L'3). Aus dieseR biochemischeR

UR-tersuchungen verrr}utet man, daB das

Enzym zwischen der auBereR und der

iRneren Mi£ochondrienmerfibran, also iR

* Tamaho, Yamanashi 409-88, Japan

Received May 25, I987

dem Intermembranraum lokalisiert ist.

Es gibt aber bisher keinen eindeutigen

morphologischen Beweis fUr diese

Vermu-ttmg. In der vorliegenden Arbeit haben

wir mit e}ektronenmikroskopischer

Im-munocytochemie die intrazellulare

Lokali-sation der Sulfitoxydase in den

Paren-cl}ymzellen der Rattenleber untersucht.

MATERIAL UND METHODEN

Prmparation de7- Protein A-GoldProbe.

Das kolloidale Gold wurde nach der

Methode von Stathis und FabrikanosL'i>

vorbereitet und an Protein A (Pharmacia,

Schweden) bei pH6.0 gekoppelt. Die

Protein A-Goldpartikel mit einem

Durch-messer von etwa l2nm wurden durch

Dichtegradienten-Zentrifugation in

Glyze-rin (IO%-80%) isoliert2e). Vor der

Anwen-dL}ng wurde die Probe 50mal mit

Koch-salzl6suRg verdUnRt.

(2)

HersteZlze7zg cle?" Antikbb'Pe7" gegen

Sulfi-toac.yctase der Rattenlebe7". Die

IgG-Frak-tioR von Kaninchen-Antik6rper gegen

Sul-fitoxydase wurde von Herm Dr. Ito

(De-partmeRt oE Biology, Faculty of Science,

Kyushu Universi£y) hergestellt emd tms zur

VerftiguRg geste}1£. Die Spezifitat des

Anti-k6rpers wurde rnit dem

Doppelimmuno-diffmsion-Test von Ouchterlony uRtersiL}cht.

Ferner wurde die spezifische Real<tivittit

des Antlk6rpers durch "XiVesterR BIo£''

fest-gestel}tee').

Psroparation des Gezvebes. Die Leber von

I80-200 g schweren Mlistar-Ratten wurde in

2gther-Narkose durch die Vena Po7"tae miti

dem Fixans 10 min. Iang perfundiert.

Nach der Fixierung wuyde die Leber mit

physiologischer Kochsalz16sung 3 min.

wei-ter perftmdierti'4). Die FixieruRgsl6sung

enthielt: 4% Para£ormaldehyd, O.l%

Glu-taraldehyd, O.I5M Cacodylatpuffer' (pH

7.4) und O.Ol% CaCIL,. Etwa 100 ptm dicke

Schnitte aus der Leber wurden mit dem

Vibratom hergestellt und i;i lmmxlmm

groBe Schnittchen weiter zerteilt. Ohne

Nachfixierung mit Os04 wurdeR diese

klei-neren Schnitte Uber Athanol oder

Dime-thylformamid entwassert tmd in Epon oder

Lowicryl K4M eingebetteti9).

Znzn?zLn・ocytoche77zische Behandlzmg.

Li-chtmikroskopie: Semidiknnsc}mitte (1ptm

dick) von Epon-eingebettetem Material

wurden mit einem LKB-Ultrotom mit

Glasmessern angeEertigt und auf saubereR

Objekttragern aufgeklebt. Nach

Entfer-Rung des Epoxyharzes mit 10% NaOH mit

Athanoli5) wurden die Schni£te mit

Tryp-sin (1 mg/ml) 2-IO min. bei 870C verdaut,

mit 5`% RinderserumalbumiR (RSA) 5 min.

behandelt, mit dern An£ik6rper ges.eR

Sul-fitoxydase 2h bei Zimmerteinperatur

ilt-kubiert und mit Peroxydase-markierterr}

Anti-Kaninchen-IgG (Cappel, USA) 80 miR.

weiter inkubiert. Nach der Spglullg mit

Kochsalz16su¥ig wurdeR die Schnitte l5

min. Iang £gr Perexidase Rach Graham und

KamovskyT) gefarb£.

Elektronenmikroskopie: Die

UltradUnn-schnitte von Lowicryl K4M- oder

Epon-eingebettetem Material wurden mit einem

LKB-Ultrotoii2 mit Glasmessem geschnitten

und auf NickelnetzcheR aufgenommen.

Vor der Immunogoldfarbung wurden die

Epoxi-Schnitte 1 Stunde mit einer

gesat£ig-ten L6simg von Natriummetaperiodit

be-handelt. Die immuRocytochemische

IRku-bation der Schnitte wurdelt Rach der

Methode von Rothi7> ausge£"hrt.

Schrit-tweise wuyden die Sclmitte erst mit 5%

RSA und dan mit dem spezifischen

Anti-k6rper l8 h bei 40C, und danach mlt

Pro-tei.n A-Gold 30min. inkubiert und mit

B}eizitrat und Urai}ylazetat deppelt

kor}-trastlert.

Zur Kontrolle wurdeR die SchRitte mit

einer absorbierteR Antik6rper16stmg statt

der spezifischen inkubiert und danach

genauso behandelt, wie bereits oben

be-sckrieben.

2zLant'itative A7zalyse der

Goldmarkie-rung. Die elektrofienmikroskopischen

Bil-der Bil-der Leberparenchymzellen wurden auf

eine Endvergr6BeruRg von I5.000 £ach

vergr6Bert. Der FlacheRanteil der

Ze]l-l<ompartiinente wurde rr}it Hilfe eines

"Creator'' (Wacom, Japan), der an einem

Computer (NEC 9801F, Nippolt Electric

Co., Japan) aRgeschlossen war, bestimmt.

Danach wurde die Zahl der Goldpartikel

in diesen Zellkompartiraeaten bestimrat.

AIs Dichte der Goldmarkierung w"rde die

Zahl der Goldpartikel/ptm2 wie bereits

beschriebenL'ti)) bezeichRet.

,

]ERGEBNISSE

SPezifitdt der Antik6rPe7: Der

Dop-pelimiir}kmodiffusion-Test von Ouchterlony

zeigt eine einzelne PrazipitatioRslinie

zwi-schen dem Leberhoiactogemat bzw. dem

gereinigteR Enzym und dem Antik6rper.

(3)

Mit der `CWestern Blot"-Analyse des

Leber-homogenates und dem

Mitochondrien-Ex-trakt wurde ebenfalls eine einzelne Linie

beobachtet (Abb. I). Beide

Prazipitation-slinien entsprechen einem

Molekularge-wicht von etwa 57 KD.

LichtmikToskoPie. Ein dunkelbraunes

Reaktionsprodukt, spezifisch fUr das

An-tigen der Sulfitoxydase wurde in kleinen

Granula im Cytoplasma der

Parenchym-zellen beobachtet (Abb. 2). Diese Granula

hatten entweder ein fadenf6rmiges oder

kugelf6rmiges Profi1, dadurch schienen sie

den Lebermitocho/ndrien tihnlich. Es gab

keinen Unterschied in der Intensitat der

Farbung zwischen dem Zentrum und der

Peripherie des Leberl2ppchens. In

Kon-trolluntersuchungen wurde nach der

Inku-bation mit absorbiertem Antik6rper keine

Farbung in der Leber beobachtet (Abb.

8).

ElektronenmikroskOP・ie. In Lowicryl

K4M-Schnitten wurden Goldpartikel, den

intrazellularen Stellen des Antigens

en-tsprechend, in den Mitochondrien der

Parenchymzellen gefunden (Abb. 4). Die

Lyso/somen und Peroxisomen, sowie das

endoplasmatische Retikulum und der

Zellkern enthielten keine Goldpartikel

(Abb. 4). In den Mitochondrien waren die

meisten Goldpartikel auf den Cristae und

einige wenige auf der Matrix lokalisiert

(Abb. 5). In Epon-eingebettetem Material

wurde ein ihnliches Ergebnis beobachtet

(Abb. 6), jedoch war durch die

unspezi-fische Antik6rper-Adsorption an dem

Epoxyharz die cytoplasmatische

Markie-rung viel starker. In den Kontrollschnitten,

die mit dem absorbierten Antik6rper

in-kubiert wurden, war keine spezifische

Go/ldmarkierung in Mitochondrien

vor-handen (Abb. 7).

QzLantitative Analyse der

Goldmarkie-Tung. Tabelle I zeigt das Ergebnis der

Bestimmung der Markierungsdichte der

Abb.

A

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E

1: "Western Blot"-Anaiyse der Extrakte

aus der Mitochondrienfraktion und

aus dem Gesamthomogenat der

tenleber. Nach elektrophoretischer

Auftrennung wurde das Gel mit

Coomassie Brillant Blau gefarbt und

nach t)bertragung auf

Membran (Milipore Co., USA) wurde diese immunoenzymatisch geftirbt. Spur A: Polymerisiertes Cytochrom C

aus dem Pferdeherz als Standard.

Spur B: Mitochondrien-Extrakt. Spur

C: Triton X-100-Extrakt aus dem

Gesamthomogenat der Leber. Spuren D und E: Immunoflirbung fUr toxydase nach Vbertragung der

halte der Spuren B bzw. C. Die Zahlen links von der Spur A zeigen das kulargewicht (Kilo-Dalton) der

ards.

Mitochondrien gegenUber dem restlichen

Cytoplasma der Leberparenchymzelle. Die

Markierungsdichte der Mitochondrien ist

zwar in den Epon-Schnitten h6her als in

Lowicryl K4M-Schnitten, der Hintergrund

ist jedoch fast 10-fach starker bei Epon als

bei Lowicryl K4M.

DISKUSSIoN

Die SPezifitdt des Antikb'rPers. Die

(4)

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Die Zellkerne

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Epon-Schnitt nach immunoenzymatischer Farbung fUr Sulfitoxydase.

einige fadenf6rmige (Pfeile)

chymzellen sind positiv angefarbt. (N) sind ungefarbt.

Lichtmikroskopischer Kontrollschnitt, absorbierten

kubiertwurde.KeineFarbungist denParenchymzellenvorhanden.

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Viele kleine

im Zytoplasma der

x1.680

IgG-Fraktion

×1.680

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Abb. 4:

eingebettet in Lowicryl

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Ytr.,:{g.

Ausschnitt einer Leberparenchymzelle,

K4M. Die

meisten Geldpartikel liegen auf Mito-chondrien (M), und zwar in der Ntihe

ihrer Cristae. Die Peroxisomen (P) und das endoplasmatische Retikulum (Pfeile> sind negativ. ×37.000

Linie sowohl fttr die

Mitochondrienfrak-tion, als auch fUr das Gesamthomogenat

der Leber, entsprechend einem

Mole-kulargewicht von 57 KD. Dies stimmt mit

dem bereits bekannten Molekulargewicht

des Enzyms Sulfitoxydase9) und bestatigt

die Spezifitat unseres Antik6rpers.

Die Lokalisation der SulfitoxNdase in

Mitochondrien. Die lichtmikroskopische

Untersuchung zeigte eine positive Farbung

der cytoplasmatischen Granula, welche in

ihrer Form den Mitochondrien ahnlich

gesehen haben. Diese Vermutung wurde

durch die Elektronenmikroskopie

besta-tigt. Die Goldmarkierung fUr Sulfitoxydase

wurde ausschlieBlich in den Mitochondrien

gefunden. Ferner wurde dieser Befund

durch die quantitative Analyse der

Gold-markierung eindeutig belegt.

Die intrazellulire Lokalisation der

Sul-fitoxydase ist von einigen Autoren

(5)

$$i

'ingYss "-kS.iiillts{... r i "`'' ligeil

Tabelle 1 Markierungsdichte fur Sulfitoxydase in den Mitochondrien und im

Hinter-grund (Goldpartikel/Am2±Standard-abweichung)

Einbettung Mitochondrien Hintergrund*

ue('s,"'"!X3 3sF .g,.,gerg,. -"getweq ;:pt

Epon

Lowicryl K4M

22. 74 ± 9. 62 17. 48 + 7. 43 12. 50 ± 2. 85 1. 48 ± 0. 42

ueme

ee

ma

ge

Abb. 5: H6here Vergr6Berung der drien. Die meisten Goldpartikel sind auf den Cristae mitochondriales zu sehen. ×55.000

Abb. 6: Ein Epon-Schnitt nach Farbung mit

der Immunogold-Technik. Einige

Goldpartikel befinden sich auf den

Cristae mitochondriales, nicht aber auf

den Peroxisomen (P). Unspezifische

Goldmarkierung ist in der

tischen Matrix vorhanden (Kreise). ×38.000

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gx

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Abb. 7:

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Kontrolle: Ein Lowicryl K4M-Schnitt, inkubiert mit absorbiertem IgG. Keine Goldpartikel sind auf Mitochondrien (M), Lysosom (L), Peroxisomen (P) und cytoplasmatischer Matrix vorhanden.

×23.ooO

"Hintergrund enthalt alle FIachenanteile,

au-sgenommen Mitochondrien.

berichtet, daB das Enzym in der

Mikro-somefraktion vorliegt, und Joshi u.a.i2)

fanden die meiste Aktivitat in der

Kern-fraktion. Andererseits hat die

Auftren-nung des Rattenleber-Homogenats durch

die Dichtegradienten-Zentrifugation

erge-ben, daB 60% der Sulfitoxydase in der

Mitochondrienfraktion und der Rest in

der 16slichen Vberstandsfraktion

lokali-siert ist23).

SchlieBIich hat Cohen2) durch die

Mes-sung der Aktivitat und die Analyse der

prosthetischen Gruppe vermutet, daB das

Enzym mit dem Intermembranenraum der

Mitochondrien assoziiert ist. Trotz

zahl-reicher biochemischer Arbeiten Uber dieses

Enzym hat es bis jetzt keine cytochemischen

Studien Uber die intrazellulare

Lokalisa-tion der Sulfitoxydase gegeben. Unsere

immunocytochemische Beobachtung zeigt

eindeutig, daB die Goldpartikel auf den

Cristae mitochondriales liegen. Das

bedeu-tet, daB Sulfitoxydase h6chst

wahrsche-inlich mit dem Intermembranenraum der

Mitochondrien assoziiert ist.

Nach einem Bericht von Oshino und

Chancei7) kommt eine direkte Reduktion

des molekularen Sauerstoffes zu H.Oo durch

." .-J

Sulfitoxydase zustande, wenn die

respira-torische Kette durch Zyanid gehemmt wird.

Das bedeutet, daB in Anwesenheit von

Zyanid das Zer-Verfahren fUr die

Oxyda-seni), die den enzymatisch produzierten

H202 einfangt, fur die

(6)

elektronenmikro-skopische Darstelltmg der Sulfitoxydase

'eiRgesetzt werdeR kaRn. Mit dieser

Methode versuchen wir zur Zeit tmsere

immuRocytochemischen Beftmde zu

unter-mauem

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参照

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