OyiginaS Argiege
Die
Immunocytochemische
Mitochondrien der
Lokalisation der Sulfitoxydase in
Rattenleber-Parenchymzellen
den
AnaLomisches Instit'ttt
Sadaki Yokota
der Aiedizinischen Hochschttle Yamanashi*
Zusammeltfassung: Die Lokalisation (ler Sulfitoxydase in clen Mitochoxxdrien der Ratten-leber-parenchymzellen wurde unter Einsatz der Immunoenzym- und Immunogold-Techniken untersucht. Lichtmikroskopisch war das dunkelbraune Reaktionsprodukt f(ir dicses Enzym in kleinen cyteplasmatischen Granula nachweisbar. Elektronenmikroskopisch wui"den die Goldpartikel, spezifisch ftir den Sitz des Antigens, in allen Mitochondrien der Parenchym-zellen beobachtet. Die meisten Goldpartikel befanden sich auf den Cristae oder auf dem Intermcmbranraum der Mitochondrien. In Kontrollschnitten, die rnit absorbiertem IgG
inkubiert wurden, wurden keine Goldpartikel auf den Mitochondrien beobachtet. Die
Ergebnisse zeigcn morphologisch, daB die Sulfitoxydase ausschlieBlich in dem Interrnem-branraum der Mitochondrien lokalisiert ist.
Schltisselw6rter: Immunocytochemie, Sulfuoxydase, Intermembranraum der Mitochondrien,
Parenchymzelle, Rattenleber
EINLEITUNG
Sulfitoxydase (sulfite: oxigen oxidoreduc-tase E.C. 1.8.8.l.) ist ein molybdafthaltiges
HamoproteiR, das bei dem oxydativen
Abbau der Schwe£elaminosauren als
teTmi-nales Enzym dient, Das Enzym ist auis der
Leber vofi Rind3・4・5), HUhncheni4) und
Mensch9> gereinigt und charakterisiert
worden. Ebenfalls ist die Beziehung
zwi-schen diesem Enzym und dem Stoffwechsel
des Molybdans bei der Ratte sehr
um-fassend untersucht worden6,i-O,ii,i3). Diese
Oxydase kann aus unverle£zten
Mitochon-drien entweder mit einer hypotonischen
L6sung oder mit Detergenzien 'extrahiert
werden8・L'3). Aus dieseR biochemischeR
UR-tersuchungen verrr}utet man, daB das
Enzym zwischen der auBereR und der
iRneren Mi£ochondrienmerfibran, also iR
* Tamaho, Yamanashi 409-88, Japan
Received May 25, I987
dem Intermembranraum lokalisiert ist.
Es gibt aber bisher keinen eindeutigen
morphologischen Beweis fUr diese
Vermu-ttmg. In der vorliegenden Arbeit haben
wir mit e}ektronenmikroskopischer
Im-munocytochemie die intrazellulare
Lokali-sation der Sulfitoxydase in den
Paren-cl}ymzellen der Rattenleber untersucht.
MATERIAL UND METHODEN
Prmparation de7- Protein A-GoldProbe.
Das kolloidale Gold wurde nach der
Methode von Stathis und FabrikanosL'i>
vorbereitet und an Protein A (Pharmacia,
Schweden) bei pH6.0 gekoppelt. Die
Protein A-Goldpartikel mit einem
Durch-messer von etwa l2nm wurden durch
Dichtegradienten-Zentrifugation in
Glyze-rin (IO%-80%) isoliert2e). Vor der
Anwen-dL}ng wurde die Probe 50mal mit
Koch-salzl6suRg verdUnRt.
HersteZlze7zg cle?" Antikbb'Pe7" gegen
Sulfi-toac.yctase der Rattenlebe7". Die
IgG-Frak-tioR von Kaninchen-Antik6rper gegen
Sul-fitoxydase wurde von Herm Dr. Ito
(De-partmeRt oE Biology, Faculty of Science,
Kyushu Universi£y) hergestellt emd tms zur
VerftiguRg geste}1£. Die Spezifitat des
Anti-k6rpers wurde rnit dem
Doppelimmuno-diffmsion-Test von Ouchterlony uRtersiL}cht.
Ferner wurde die spezifische Real<tivittit
des Antlk6rpers durch "XiVesterR BIo£''
fest-gestel}tee').
Psroparation des Gezvebes. Die Leber von
I80-200 g schweren Mlistar-Ratten wurde in
2gther-Narkose durch die Vena Po7"tae miti
dem Fixans 10 min. Iang perfundiert.
Nach der Fixierung wuyde die Leber mit
physiologischer Kochsalz16sung 3 min.
wei-ter perftmdierti'4). Die FixieruRgsl6sung
enthielt: 4% Para£ormaldehyd, O.l%
Glu-taraldehyd, O.I5M Cacodylatpuffer' (pH
7.4) und O.Ol% CaCIL,. Etwa 100 ptm dicke
Schnitte aus der Leber wurden mit dem
Vibratom hergestellt und i;i lmmxlmm
groBe Schnittchen weiter zerteilt. Ohne
Nachfixierung mit Os04 wurdeR diese
klei-neren Schnitte Uber Athanol oder
Dime-thylformamid entwassert tmd in Epon oder
Lowicryl K4M eingebetteti9).
Znzn?zLn・ocytoche77zische Behandlzmg.
Li-chtmikroskopie: Semidiknnsc}mitte (1ptm
dick) von Epon-eingebettetem Material
wurden mit einem LKB-Ultrotom mit
Glasmessern angeEertigt und auf saubereR
Objekttragern aufgeklebt. Nach
Entfer-Rung des Epoxyharzes mit 10% NaOH mit
Athanoli5) wurden die Schni£te mit
Tryp-sin (1 mg/ml) 2-IO min. bei 870C verdaut,
mit 5`% RinderserumalbumiR (RSA) 5 min.
behandelt, mit dern An£ik6rper ges.eR
Sul-fitoxydase 2h bei Zimmerteinperatur
ilt-kubiert und mit Peroxydase-markierterr}
Anti-Kaninchen-IgG (Cappel, USA) 80 miR.
weiter inkubiert. Nach der Spglullg mit
Kochsalz16su¥ig wurdeR die Schnitte l5
min. Iang £gr Perexidase Rach Graham und
KamovskyT) gefarb£.
Elektronenmikroskopie: Die
UltradUnn-schnitte von Lowicryl K4M- oder
Epon-eingebettetem Material wurden mit einem
LKB-Ultrotoii2 mit Glasmessem geschnitten
und auf NickelnetzcheR aufgenommen.
Vor der Immunogoldfarbung wurden die
Epoxi-Schnitte 1 Stunde mit einer
gesat£ig-ten L6simg von Natriummetaperiodit
be-handelt. Die immuRocytochemische
IRku-bation der Schnitte wurdelt Rach der
Methode von Rothi7> ausge£"hrt.
Schrit-tweise wuyden die Sclmitte erst mit 5%
RSA und dan mit dem spezifischen
Anti-k6rper l8 h bei 40C, und danach mlt
Pro-tei.n A-Gold 30min. inkubiert und mit
B}eizitrat und Urai}ylazetat deppelt
kor}-trastlert.
Zur Kontrolle wurdeR die SchRitte mit
einer absorbierteR Antik6rper16stmg statt
der spezifischen inkubiert und danach
genauso behandelt, wie bereits oben
be-sckrieben.
2zLant'itative A7zalyse der
Goldmarkie-rung. Die elektrofienmikroskopischen
Bil-der Bil-der Leberparenchymzellen wurden auf
eine Endvergr6BeruRg von I5.000 £ach
vergr6Bert. Der FlacheRanteil der
Ze]l-l<ompartiinente wurde rr}it Hilfe eines
"Creator'' (Wacom, Japan), der an einem
Computer (NEC 9801F, Nippolt Electric
Co., Japan) aRgeschlossen war, bestimmt.
Danach wurde die Zahl der Goldpartikel
in diesen Zellkompartiraeaten bestimrat.
AIs Dichte der Goldmarkierung w"rde die
Zahl der Goldpartikel/ptm2 wie bereits
beschriebenL'ti)) bezeichRet.,
]ERGEBNISSE
SPezifitdt der Antik6rPe7: Der
Dop-pelimiir}kmodiffusion-Test von Ouchterlony
zeigt eine einzelne PrazipitatioRslinie
zwi-schen dem Leberhoiactogemat bzw. dem
gereinigteR Enzym und dem Antik6rper.
Mit der `CWestern Blot"-Analyse des
Leber-homogenates und dem
Mitochondrien-Ex-trakt wurde ebenfalls eine einzelne Linie
beobachtet (Abb. I). Beide
Prazipitation-slinien entsprechen einem
Molekularge-wicht von etwa 57 KD.
LichtmikToskoPie. Ein dunkelbraunes
Reaktionsprodukt, spezifisch fUr das
An-tigen der Sulfitoxydase wurde in kleinen
Granula im Cytoplasma der
Parenchym-zellen beobachtet (Abb. 2). Diese Granula
hatten entweder ein fadenf6rmiges oder
kugelf6rmiges Profi1, dadurch schienen sie
den Lebermitocho/ndrien tihnlich. Es gab
keinen Unterschied in der Intensitat der
Farbung zwischen dem Zentrum und der
Peripherie des Leberl2ppchens. In
Kon-trolluntersuchungen wurde nach der
Inku-bation mit absorbiertem Antik6rper keine
Farbung in der Leber beobachtet (Abb.
8).ElektronenmikroskOP・ie. In Lowicryl
K4M-Schnitten wurden Goldpartikel, den
intrazellularen Stellen des Antigens
en-tsprechend, in den Mitochondrien der
Parenchymzellen gefunden (Abb. 4). Die
Lyso/somen und Peroxisomen, sowie das
endoplasmatische Retikulum und der
Zellkern enthielten keine Goldpartikel
(Abb. 4). In den Mitochondrien waren die
meisten Goldpartikel auf den Cristae und
einige wenige auf der Matrix lokalisiert
(Abb. 5). In Epon-eingebettetem Material
wurde ein ihnliches Ergebnis beobachtet
(Abb. 6), jedoch war durch die
unspezi-fische Antik6rper-Adsorption an dem
Epoxyharz die cytoplasmatische
Markie-rung viel starker. In den Kontrollschnitten,
die mit dem absorbierten Antik6rper
in-kubiert wurden, war keine spezifische
Go/ldmarkierung in Mitochondrien
vor-handen (Abb. 7).
QzLantitative Analyse der
Goldmarkie-Tung. Tabelle I zeigt das Ergebnis der
Bestimmung der Markierungsdichte der
Abb.
A
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E
1: "Western Blot"-Anaiyse der Extrakte
aus der Mitochondrienfraktion und
aus dem Gesamthomogenat der
tenleber. Nach elektrophoretischer
Auftrennung wurde das Gel mit
Coomassie Brillant Blau gefarbt und
nach t)bertragung auf
Membran (Milipore Co., USA) wurde diese immunoenzymatisch geftirbt. Spur A: Polymerisiertes Cytochrom C
aus dem Pferdeherz als Standard.
Spur B: Mitochondrien-Extrakt. Spur
C: Triton X-100-Extrakt aus dem
Gesamthomogenat der Leber. Spuren D und E: Immunoflirbung fUr toxydase nach Vbertragung der
halte der Spuren B bzw. C. Die Zahlen links von der Spur A zeigen das kulargewicht (Kilo-Dalton) der
ards.
Mitochondrien gegenUber dem restlichen
Cytoplasma der Leberparenchymzelle. Die
Markierungsdichte der Mitochondrien ist
zwar in den Epon-Schnitten h6her als in
Lowicryl K4M-Schnitten, der Hintergrund
ist jedoch fast 10-fach starker bei Epon als
bei Lowicryl K4M.
DISKUSSIoN
Die SPezifitdt des Antikb'rPers. Die
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Strukturen
Die Zellkerneder mit der
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Epon-Schnitt nach immunoenzymatischer Farbung fUr Sulfitoxydase.
einige fadenf6rmige (Pfeile)
chymzellen sind positiv angefarbt. (N) sind ungefarbt.
Lichtmikroskopischer Kontrollschnitt, absorbierten
kubiertwurde.KeineFarbungist denParenchymzellenvorhanden.
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Viele kleine
im Zytoplasma der
x1.680
IgG-Fraktion×1.680
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'¥'ts'lllljslgg. {ieg 3t¢ ."`:i:"xeek,,,eees.ee.k,... twss
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Abb. 4:
eingebettet in Lowicryl
ewss
Ytr.,:{g.
Ausschnitt einer Leberparenchymzelle,
K4M. Die
meisten Geldpartikel liegen auf Mito-chondrien (M), und zwar in der Ntihe
ihrer Cristae. Die Peroxisomen (P) und das endoplasmatische Retikulum (Pfeile> sind negativ. ×37.000
Linie sowohl fttr die
Mitochondrienfrak-tion, als auch fUr das Gesamthomogenat
der Leber, entsprechend einem
Mole-kulargewicht von 57 KD. Dies stimmt mit
dem bereits bekannten Molekulargewicht
des Enzyms Sulfitoxydase9) und bestatigt
die Spezifitat unseres Antik6rpers.
Die Lokalisation der SulfitoxNdase in
Mitochondrien. Die lichtmikroskopische
Untersuchung zeigte eine positive Farbung
der cytoplasmatischen Granula, welche in
ihrer Form den Mitochondrien ahnlich
gesehen haben. Diese Vermutung wurde
durch die Elektronenmikroskopie
besta-tigt. Die Goldmarkierung fUr Sulfitoxydase
wurde ausschlieBlich in den Mitochondrien
gefunden. Ferner wurde dieser Befund
durch die quantitative Analyse der
Gold-markierung eindeutig belegt.
Die intrazellulire Lokalisation der
Sul-fitoxydase ist von einigen Autoren
$$i
'ingYss "-kS.iiillts{... r i "`'' ligeilTabelle 1 Markierungsdichte fur Sulfitoxydase in den Mitochondrien und im
Hinter-grund (Goldpartikel/Am2±Standard-abweichung)
Einbettung Mitochondrien Hintergrund*
ue('s,"'"!X3 3sF .g,.,gerg,. -"getweq ;:pt
Epon
Lowicryl K4M
22. 74 ± 9. 62 17. 48 + 7. 43 12. 50 ± 2. 85 1. 48 ± 0. 42ueme
ee
ma
ge
Abb. 5: H6here Vergr6Berung der drien. Die meisten Goldpartikel sind auf den Cristae mitochondriales zu sehen. ×55.000
Abb. 6: Ein Epon-Schnitt nach Farbung mit
der Immunogold-Technik. Einige
Goldpartikel befinden sich auf den
Cristae mitochondriales, nicht aber auf
den Peroxisomen (P). Unspezifische
Goldmarkierung ist in der
tischen Matrix vorhanden (Kreise). ×38.000
me
gxwh
as, ss
Abb. 7:ewmex
st x-w #Pbut'. g" geeagec
es. ee"
eeersca
g:.".s ,va, l・Iv.
・ee
V'・-.Skts
Kontrolle: Ein Lowicryl K4M-Schnitt, inkubiert mit absorbiertem IgG. Keine Goldpartikel sind auf Mitochondrien (M), Lysosom (L), Peroxisomen (P) und cytoplasmatischer Matrix vorhanden.
×23.ooO
"Hintergrund enthalt alle FIachenanteile,
au-sgenommen Mitochondrien.
berichtet, daB das Enzym in der
Mikro-somefraktion vorliegt, und Joshi u.a.i2)
fanden die meiste Aktivitat in der
Kern-fraktion. Andererseits hat die
Auftren-nung des Rattenleber-Homogenats durch
die Dichtegradienten-Zentrifugation
erge-ben, daB 60% der Sulfitoxydase in der
Mitochondrienfraktion und der Rest in
der 16slichen Vberstandsfraktion
lokali-siert ist23).
SchlieBIich hat Cohen2) durch die
Mes-sung der Aktivitat und die Analyse der
prosthetischen Gruppe vermutet, daB das
Enzym mit dem Intermembranenraum der
Mitochondrien assoziiert ist. Trotz
zahl-reicher biochemischer Arbeiten Uber dieses
Enzym hat es bis jetzt keine cytochemischen
Studien Uber die intrazellulare
Lokalisa-tion der Sulfitoxydase gegeben. Unsere
immunocytochemische Beobachtung zeigt
eindeutig, daB die Goldpartikel auf den
Cristae mitochondriales liegen. Das
bedeu-tet, daB Sulfitoxydase h6chst
wahrsche-inlich mit dem Intermembranenraum der
Mitochondrien assoziiert ist.
Nach einem Bericht von Oshino und
Chancei7) kommt eine direkte Reduktion
des molekularen Sauerstoffes zu H.Oo durch
." .-J
Sulfitoxydase zustande, wenn die
respira-torische Kette durch Zyanid gehemmt wird.
Das bedeutet, daB in Anwesenheit von
Zyanid das Zer-Verfahren fUr die
Oxyda-seni), die den enzymatisch produzierten
H202 einfangt, fur die
elektronenmikro-skopische Darstelltmg der Sulfitoxydase
'eiRgesetzt werdeR kaRn. Mit dieser
Methode versuchen wir zur Zeit tmsere
immuRocytochemischen Beftmde zu
unter-mauem
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