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Development of rapid genetic identification system of Mycobacterium species and reclassification of members of genus Mycobacterium. 1) Application of colorimetric microdilution plate hybridization for rapid genetic identification of 22 Mycobacterium spec

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Academic year: 2021

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Title

Development of rapid genetic identification system of

Mycobacterium species and reclassification of members of genus

Mycobacterium. 1) Application of colorimetric microdilution

plate hybridization for rapid genetic identification of 22

Mycobacterium species. 2) Proposal of Mycobacterium

peregrinum sp. nov., nom. rev., and elevation of Mycobacterium

chelonae subsp. abscessus (Kubica et al.) to species status :

Mycobacterium abscessus comb. nov.( 内容の要旨(Summary) )

Author(s)

楠, 伸治

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(医学)乙 第1168号

Issue Date

1998-06-17

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/15105

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

(2)

氏名 (本籍) 楠 伸 治(奈良県) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員

士(医学) 乙第1168 号

平成10

年 6

月17

学位規則第4条第2項該当

Development of rapid geneticidentjfication system ofMycobacterhJm SPeCies and recIassification of members of genus Mycobacterium.

1)Appfication of colorimetric microdilutjon p]ate hYbridization for rapid geneticidentification of22Mycobacte血m species・

2)ProposaL ofMycobacte血mpereg/血um sp.nov・.nOm・reV・.and erevation ofMycobacterbm chek)nae Subsp.abscessus(Kubica et aI.)to species status:

(主査)教授 江 崎 孝 行 (副査)教授 渡 連 邦 友 教授 清 島 満 論 文 内 容 の 要 旨 【目的】従来の生化学的手法では数週間を要していたA勿co占∝fer血m属菌の同定にDNA相同性に基づく定量的 マイクロプレートハイプリグイゼーション法を応用し,迅速で正確な同定法の開発を目指した。また,遺伝学的 同定法で得られた知見をもとに,物coムαC£er血m属菌の分類学上の整理を行うことを目的とした。 【材料と方法】坤co占∝とer血m属菌22菌種の基準株および披検菌として従来法で同定されていた保存株183株を 使用した。 基準株の抗酸菌は固型培地で大量培養し,回収した菌体をリゾチームで長時間処理する方法を作成してDNA /DNAハイブリッド法に適した純度のDNAを回収する方法を作成した。純化した基準株のDNAを96穴のマイク ロプレートに固定し,臨床材料から分離される抗酸菌を使って同定するシステムを作成した。まず臨床材料から 分離された菌株の集落を1白金耳とり,ガラスビーズで破砕し,定量的DNA/DNAハイプリット実験の標識 DNAとする方法を作成した。披検菌から抽出したDNAをビオチンで標識し,予め基準株DNAを固定して作製し たマイクロプレートの各ウェル内で2時間のDNA-DNAハイプリグイゼーションを行った。形成されたハイブリッ ドはパーオキシダーゼーストレプトアピジンで標識した後.基質である過酸化水素およびテトラメチルベンジジ ンにより発色させ定量的に検出した。 【結果】本法により22菌種のうちM.tuberculosisとM.bouisは高い相同性を示したためM.tubeJ℃ulosiscomplex としての鑑別に止まったが,残る20菌種は各々明確に鑑別することができた。従来,分類学的には定量的ハイブ リッド形成実験には24時間のハイブリッド形成時問が必要とされていたが,マイクロプレート法を使用し,2時 間の反応で定量的DNA/DNAハイブリッド形成で同定ができることがわかった。本法によりMycobacterium属 菌の同定が3時間で実施可能となった。 保存株183株を披検菌とした評価試験の結果,178株がいずれかの菌種として同定できた。しかし,従来法によ る同定と本法の結果には特定の数菌種で20∼50%の不一致例が見られたことやgenomic speciesの存在が示唆さ れるなど,A勿CO占αC亡er血m属の分類にはさらに検討の必要があると考えられた。そこで巨財./br払血mcompl既 について分類学的な軽理を試みた結果,従来同義とされていた〟.ルr血£昆mと〟.per喀rよ几αmはDNA相同性や 表現形質上の鑑別点から各々独立した菌種であることを確認した。また.〟.deわ几αeを構成する2亜種は至適

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-67-条件下でのDNA相同性が35%にすぎず亜種とする必然性がないことを肝諾した。以上の結果より‥財.pe喝血肌 およぴ〟.α占5αぶ5比ぶをそれぞれ独立した菌種として記載すること提案した。 論文審査の結果の要旨 抗酸菌の同定には従来法では1カ月以上を要していたが.申請者 楠 伸治は分類学で種を決定する際に使用 する定量的DNA/DNAハイブリッド法を応用し,市販の96穴のマイクロプレートで薗種間の煩似度を測定する 方法を作成し,抗酸菌を3時間以内で同定する方法を完成させた。さらにこの方法を利用し.これまで表現形で 分類されてきた抗酸菌群の分類体系の不備を指摘し,新しい抗酸菌の分類学的提案を行った。 以上,申請者の研究成果は臨床微生物学及び細菌学の進歩に重要な貢献をしたものと認める。 [主論文公表誌]

Developmentofrapidgeneticidentificationsystem of坤cob∝Eerium species and reclassifIcation of members ofgenusMi,COb∝terium.

1)Application of colorimetric microdilution plate hybridization for rapid geneticidentification of 22物coわαC亡er血爪SpeCies.

平成3年8月発行J.Clin.Microbiol.29(8):1596∼1603

2)ProposalofめcobacteriuTnPeregrinum

sp.nov.,nOm.reV.,and elevation of MycobacteriuTnCheZonae subsp.abscessus(Kubicaetal.)tospeciesstatus:

Mi,CObacterizLm

abscesszLS COmb.nov.

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