*総 合 理 工 学研 究 科 理 学 専 攻

41 (2005) 23-29 J. School Sci. Eng. Kinki Univ.

ブ ラジル 産 ジョロウグモか ら単 離 され た新 規 アシル ポリアミンの構 造 決 定1)

西 丸 貴 弘*,中 嶋 暉 躬**,板 垣 又   ***,直 木 秀 夫****,岩 下 孝*****, 藤 田 剛 司*****,山 口 仁 宏 艸****,若 宮 建 昭******

Structural Determination of Novel Acylpolyamines

from the Venom of Nephila clavipes, a Brazilian Joro spider

Takahiro NISHIMARU*, Terumi NAKAJIMA * *, Yasuhiro ITAGAKI * * *, Hideo NAOKI * * * *, Takashi I WASHITA * * * * *, Tsuyoshi FUJ ITA * * * * *, Yoshihiro YAMAGUCHI * * * * * *

and Tateaki WAKAMIYA * * * * * *

Acylpolyaminetoxins in spider venom are known to inhibit glutamatergic neuromuscular transmission of arthropods or glutamate receptor in the mammalian central nervous system. Therefore, these toxins seem to be valuable for elucidating the mechanism of glutamatergic neurotransmission in the brain.

Recently, a fraction containing novel acylpolyamine with molecular weight of 787 was obtained from Nephila clavipes, a Brazilian Joro spider, by HPLC purification of the crude venom. Three kinds of structures composed of five amino acids and one polyamine were proposed to these compounds by means of MS/MS analysis of the fraction.

In the proposed structures, the sequence of four residues at left side in each molecule is the same. However, they differ from each other in the composition or the sequence of two amino acid residues at right side.

In the present study, the chemical syntheses of 1-3 and the comparison of synthetic compounds with natural products by means of MS-MS analysis were carried out to determine the structures of novel acylpolyamines.

Key words : Acylpolyaminetoxin, N-(4-Aminobutyl)glycine, N-(3-Aminopropyl)-fi-alanine, Cadaverine, Putreanine,

Spider toxin, MS-MS analysis

最 近,中 嶋 らは ブ ラジ ル 産 ジ ョロウ グ モ(1吻 梛oc1α 吻 ε5) の 毒 嚢 か ら,分 子 量787の 新 規 な ア シ ル ポ リア ミン 数 種 を含 む 画 分 を 得 た.し か し,そ の 量 が 極 め て 微 量 で あ っ た た め,そ れ らの 分 離 精 製 お よびNMRに よる構 造 決 定 が 不 可 能 で あ っ た.

そ こで,混 合 試 料 のMSIMSス ペ クトル に お け るフ ラ グメン トピ ー クの 解 析 を 行 うことに より

,Fig.1に 示 す3種 類 の 推 定 構 造 式 を 提 出 し,そ れ ぞ れ,NPTX‑787‑X(1),‑NPTX‑787‑Y(2),

お よびNPTX‑787‑Z(3)と 名 付 け た.

NPTX‑787‑X(1)は,4一 ヒ ド ロ キ シ イ ン ドー ル ー3一酢 酸 (4‑Hyia),ア スパ ラギ ン(Asn),1,5一 ジ ア ミノプ ロパ ン(カ ダ ベ リ ン:Cad),淋(4一 ア ミノブ チ ル)一β 一ア ラニ ン(プ トレア ニ ン:Pua) 各1残 基 と革(3一ア ミノプ ロピ ル)一β 一ア ラニ ン(Apa)2残 基 の 計 6残 基 か ら 構 成 さ れ て い る.ま た,NPTX‑787‑Y(2)お よび NPTX‑787‑Z(3)は い ず れ も 分 子 の 左 側4残 基 ま で は NPTx‑787‑xと 共 通 の 部 分 構 造 で あ るが,Fig.1のRに 相 当 す る 右 側2残 基 の 塩 基 性 ア ミノ酸 の 組 成 あ る い は 配 列 が NPTX‑787‑Xと 異 な っ て い る.

本 研 究 で は,新 規 ポ リア ミン トキ シ ン の 構 造 を 決 め るた め に 1〜3の 推 定 構 造 式 に 相 当 す る 化 合 物 を 合 成 し,そ れ ら の MSIMSス ペ クトル の 比 較 検 討 に より,天 然 物 の 構 造 決 定 を行 うことを 目 的 とした.

1.緒 言

グル タミン酸 は 昆 虫や 甲殻 類 等 の節 足 動 物 にお ける神 経 一 筋 間 接 合 部 に お ける神 経 伝 達 物 質 として 知 られ て いる2).ま た,哺 乳 動 物 にお いて は,中 枢 神 経 系 で の 興 奮 性 神 経 伝 達 物 質 として機 能 し,学 習 や 記 憶 に密 接 に 関 与 してい る3).

一 方 ,ク モ毒 の 一 種 で あるアシル ポリアミン型 の 化 合 物 は, グル タミン酸 に よる神 経 伝 達 を強 力 か つ 特 異 的 に遮 断 す る神 経 毒 ペ プ チ ドであることが知 られ てお り4),過 剰 の グル タミン 酸 放 出 が 引 き金 とな る脳 虚 血 症 や アル ツハ イマ ー 病 の ような 脳 疾 患 の原 因解 明,ま た は それ らを含 め た種 々の 脳 神 経 科 学研 究 にお ける重 要 なツー ル とな ることが 期 待 され る.

2.目 的

平成17年6月11日 受 理

*総 合 理 工 学研 究 科 理 学 専 攻

**星 薬 科 大 学

*纏 コロンビア 大 学

**騨 ㈱ トロピカル テクノセ ンター 艸*躰 サ ントリー 生 物 有 機 科 学研 究 所

*鯨 艸*理 学 科

4七 ドロキ シイ ン ドー ル ー3一酢 酸iア スパ ラギ ンiカ ダ ベ リン{革(3一ア ミノプ ロピル)一、β一ア ラニ ン

(Cad)(Apa) (Asn)

(4‑Hyia)

さ り  

i1》 一(4一ア ミノブ チ ル)グ リシ ン (Abg)

四 ρ■曽」■ ρ璽「巳7

Proposed structures of NPTX-787s.

Fig. I

3.1.2カ ダ ベ リン 騰 導 体 の 鯛 製

Cad誘 導 体 の 調 製 は,Ma賃iglyの 方 法7)を 参 考 に して 行 った.す な わ ち,5一 ア ミみ1一ペ ンタ ノー ル(9)の ア ミノ基 を ∫。ブ トキ シ カル ボ ニ ル(B㏄)基 で 保 護 した 後 に メシラ ー ト11と し, ア ジ 化 ナ トリウム と臭 化 テ トラブ チ ル ア ン モ ニ ウム を 用 い て ア ジ 化 物12へ と導 い た.得 られ た ア ジ 化 物12は,接 触 還 元 を行 う と2級 お よ び3級 ア ミン を 生 成 す る 事 が 明 ら か に な っ て い るた め8),ト リフ ェ ニ ル ボ ス フ ィン に よりア ミノ基 に 変 換 しCad誘 導 体13を 調 製 した(Scheme2).

3.NPTX‑787‑X‑Zの 合 成

推 定 構 造 式1〜3で 示 され るNPTX‑787・X〜Zの 合 成 を 進 め る に あ た り,ま ず,市 販 品 として 入 手 で き な い4‑Hyia,Cad, Apa,Pua,淋(4一 ア ミノブ チ ル)グ リシ ン(Abg)の 各 構 成 単 位 誘 導 体 の 調 製 を 行 っ た.

3.1各 構 成 単 位 誘 導 体 の 調 製

3.1,14一 ベ ン ジ ル オ キ シ イン ドー ル ー3一酢 酸 の 鯛 製

4‑Hyiaは 最 終 脱 保 護 時 に 接 触 還 元 を 適 用 す ることか ら,4 位 水 酸 基 を ベ ン ジ ル(Bz1)基 で 保 護 す る ことに した.市 販 の 4一ヒドロキ シ イ ン ドー ル(4)の フ ェ ノー ル 性 水 酸 基 をベ ン ジ ル 化 後,Mamich反 応 で4一 ベ ン ジ ル オ キ シ グ ラミン(6)と した, さらに,ヨ ー ドメタ ン に よ り4級 ア ン モ ニ ウム 塩 とし た 後,シ ア ン 化 ナ トリウム を用 い てニ トリル 体7へ と導 き,StoHら の 方 法5・6) で,4一 ベ ンジ ル オ キ シ イ ン ドー ル ー3一酢 酸(4‑Boia)(8)を 調 製 した(Scheme1).

Preparation of Cad derivative.

Scheme 2

3.1.3プ トレア ニ ン 誘 導 体 の 調 製

β ・ア ラニ ン(14)の カ ル ボ キ シ ル 基 をメチ ル エ ステ ル 化 した 後Ns基 で 保 護 した.得 られ た15と1>‑B㏄ 一4一ア ミノー1一ブ タノー ル(16)お よび1>‑Z‑4一 ア ミノー1一ブ タノー ル(17)を そ れ ぞ れ ア ゾジ カ ル ボ ン 酸 ジ エ チ ル(DEAD)と トリフ ェニ ル ホ ス フ ィン を 用 い る光 延 一福 山 ア ル キル 化 法9)で 縮 合 し,Pua誘 導 体18お よび19と した.次 に,こ れ らを け ん 化 後,1一 エ チ ル ー3‑(3一ジ メチ ル ア ミノプ ロピ ル)カ ル ボ ジ イミド塩 酸 塩(EDGHC1)と1>一 ヒドロ acid

of 4-benzyloxyindole-3-acetic Preparation

(4-Boia).

Scheme 1

リア ジ ン ー2一イ ル)‑4一メチ ル モ ル ホ リニ ウム クロリド(DM玉MM)10) を 用 い て 縮 合 した.縮 合 生 成 物38のBoc基 を ギ 酸 で 除 去 後, Apa活 性 エ ス テ ル 誘 導 体30と 縮 合 し,目 的 化 合 物1〜3の 合 成 の 共 通 中 間 体39へ と導 い た.そ の 後,ギ 酸 に よるB㏄ 基 の 除 去 と,Puaお よびApa活 性 エ ス テ ル 誘 導 体 との 縮 合 を 繰 り 返 し,NPTX‑787‑X完 全 保 護 体40へ と導 い た.得 られ た40の Ns基 を チ オ フ ェ ノー ル と炭 酸 セ シ ウム を 用 い て 除 去 後,逆 相 高 速 液 体 クロ マ トグ ラフ ィー(RP‑HPLC)を 用 い て 精 製 し,還 元 の 際 に 触 媒 毒 とな る硫 黄 を 含 む 成 分 を 完 全 に 除 去 した.こ の ように し て 精 製 した41のBzl基 とZ基 を接 触 還 元 で 除 去 後, RP‑HPLCを 用 い て 再 び 精 製 しNPTX・787‑X(1)を 得 た (Scheme6).

キ シ コハ ク酸 イ ミド(HOSu)に より活 性 エ ステ ル 体22お よび 23と した(Scheme3).

Preparation of active ester derivative of Pua.

Scheme 3

Preparation of active ester derivative of Abg.

Scheme 5

3,3NPTX‑787‑Y(2),NPTX‑787‑Z(3)の 合 成

NPTX‑787‑Y(2)の 合 成 はNPTX‑787‑X(1)と 同 様 の 方 法 を 用 い て行 っ た.す な わ ち,前 述 の 共 通 中 間 体39のB㏄ 基 を 除 去 後,Puaお よびAbg活 性 エ ステ ル 誘 導 体 を順 次 縮 合 し た,得 られ た 完 全 保 護 体42のNs基 を 除 去,RP‑HPLCに よ る 精 製,Bz1基 とZ基 の 除 去,RP‑HPLCに よる精 製 を順 次 行 い, NPTX‑787‑Y(2)を 合 成 した(Scheme7).NPTX‑787‑Z(3)

の 合 成 も 同 様 に 共 通 中 間 体39か ら行 った(Scheme8).

3.1.4〈 匹(3。ア ミノプ ロ ピル)「β 一ア ラニ ン誘 導 の 調 製

Pua誘 導 体 の 調 製 と同 様 に,3一ア ミノー1一プ ロパ ノー ル の ア ミノ 基 をB㏄ 基 また はZ基 で 保 護 した24ま た は25と,Ns一 ア ミド 15を 光 延 福 山 ア ル キ ル 化 法 で 縮 合 した.こ の ように して 得 ら れ たApa誘 導 体26お よび27の メチ ル エ ステ ル を け ん 化 後, 活 性 エ ス テ ル 体30お よび31と した(Scheme4),

4.NPTX‑787‑X‑Zと 天 然 物 の 質 量 分 析 法 に よ る 比 較 検 討

上 記 の ように して 合 成 した 化 合 物NPTX・787‑X〜Z(1〜3)に つ い て,エ レク トロス プ レ ー イオ ン 化 液 体 クロマ トグ ラフ ィー 四 重 極 型 質 量 分 析 計 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 計 マ ス スペ クトロメトリ ー/マ ス スペ ク トロメトリー(ESI ‑LC・Q‑TOF‑MS/Ms) ,お よ び マ トリックス レ ー ザ ー 支 援 脱 離 イオ ン化 磁 場 型 質 量 分 析 計 マ ス ス ペ ク トロメ トリー/マ ス ス ペ クトロ メトリー(MALDI‑Magnetic‑

sector‑MS/MS)の 測 定 を 行 い,天 然 物 の ス ペ クトル との 比 較 検 討 を 行 っ た.

ESI‑LC‑MSIMSの 測 定 結 果 か ら,化 合 物1お よび3の ス ペ クトル パ タ ー ン は 天 然 物 と類 似 して い る点 が 多 く,毒 の 成 分 と して これ らが 含 まれ て い るも の と推 定 され る.一 方,化 合 物2 の スペ クトル は,全 体 的 に 天 然 物 の ス ペ ク トル パ ター ン とは 全 く異 な っ て い ることか ら,天 然 物 に は2が 含 まれ て い な い と考 え られ る(Fig.2).

Preparation of active ester derivative of Apa.

Scheme 4

3.1。5〈 匹(4一ア ミノブ チ ル)グ リシ ン 騰 導 体 の 鯛 製

Abg誘 導 体 は,グ リシ ン(32)か ら導 い た ノ〉‑Ns一グ リシ ンメチ ル エ ス テル(33)と1>‑Z‑4一 ア ミノブ タ ノー ル(17)を 縮 合 し,最 終 的 に 活 性 エ ス テ ル 体36と して 調 製 した(Scheme5).

3、2NPTX‑787‑X(1)の 合 成

まずCad誘 導 体13とZ一 ア ス パ ラギ ン(Z‑Asn)の 縮 合 を EDC・HCI/1>一 ヒドロキ シ ー5一ノル ボ ル ネ ンー2,3一ジ カ ル ボ ン酸 イ ミ ド(HONb)法 を用 い て 行 っ た.得 られ た 化 合 物37のZ基 を 接 触 還 元 に より除 去 後,4・Boia(8)と4‑(4,6一 ジ メトキ シ ー1,3,5一ト

15一

生 成 す る.天 然 物 の ス ペ クトル に はNPTX‑787‑XとZに 特 徴 的 なm/z722お よび736が 明 瞭 に 確 認 で きる.ま た,m/z737 の フ ラ グ メン トは,NPTX‑787‑Yに 由 来 す る の で は な く, NPTX‑787‑Zに 由 来 す るもの と考 え るの

が 妥 当 で あ ろ う.こ の 事 実 は 前 述 の,NPTX‑787‑Yが 含 ま れ て い な い とい う推 論 を 支 持 す るも の で あ る.

5.結 論

ブ ラジ ル 産 ジ ョロウグ モNの 捌 αclo吻 ε5の 毒 嚢 か ら得 られ た 分 子 量787の 新 規 な ア シ ル ポ リア ミン 毒 に 対 し,MSIMSス ペ クトル の 解 析 結 果 か ら提 出 され た 推 定 構 造 式 に 基 づ き, NPTX‑787‑X(1),NPTX‑787‑Y(2),NPTX‑787。Z(3)を 合 成

した.さ ら に,こ れ ら合 成 化 合 物 と天 然 物 のMSIMSス ペ クトル の 測 定 を 行 い,詳 細 な 比 較 検 討 を 行 っ た 結 果,天 然 物 の 構 造 はNPTX・787‑Xお よびNPTX‑787‑Zで あ る ことを 決 定 す る ことが で きた.

次 に,ESI‑LC・MS/MSよ りもさら に 詳 し い デ ー タ を得 るた め に,高 エ ネ ル ギ ー 衝 突 誘 起 解 離(Highenergy‑CID)に よ る MALDI‑sector‑MSIMSの 測 定 を行 っ た.な お,こ の 測 定 に は Na付 加 イ オ ン を 用 い るこ とに した.そ の 結 果,天 然 物 と合 成 化 合 物1〜3の ス ペ クトル に お い て,m/z594以 下 の 低 質 量 領 域 で は 種 々 の 切 断 様 式 に 基 づ くフ ラ グ メン トが 混 在 す るた め, そ の 相 違 を 論 ず る ことは 出 来 な い.し か しな が ら,m/z700〜

800に は そ れ ぞ れ の 構 造 に 由 来 す る明 確 な 相 違 が 認 め られ た (Fig,3).こ れ まで の 多 数 の ア シ ル ポ リア ミン 系 クモ 毒 のMSス ペ クトル に よる解 析 か ら,Fig.3に 示 す ようにNPTX・787‑Xの Apa残 基 は 矢 印 で 示 した β一γ 間 の 結 合 か ら順 次 切 断 が 生 じ, m/z736が 構 造 の 特 徴 を 示 す フ ラ グメン トとな る ことが 分 か る.

NPTX‑787‑Yに お い て もAbg残 基 の 矢 印 で 示 した β一γ 間 以 降 の 結 合 が 切 断 され,こ の 場 合 はm/z737の フ ラグメン トが 特 徴 的 な もの とな る.一 方,NPTX‑787‑Zで は ア ミノ酸 配 列 の 相 違 に よ り右 側 末 端 成 分 で あ るPua残 基 の β一γ 間 で 切 断 さ れ たm/z722と 笄 δ 間 で 切 断 され た737の フ ラグ メン トが

1) H2, 10 % Pd(OH)2-C / MeOH

`NHBoc

NMM / MeOH 2) 8, DMT-MM,

75.8 EDC•HCI, HONb, Et3N

CH2Cl2 •

94.6 % + Z-Asn-OH

1) HCOOH 2) 30, Et3N / CH2Cl2

75.3 % 'NHBoc

• B2

OBzI

•

/ I

1) HCOOH 2) 22, Et3N / CH2Cl2 3) HCOOH 4) 31, Et3N / CH2Cl2

52.6 % (2 steps)

PhSH, Cs2CO3 ---.-

DMF 53.8 %

H2, 10% Pd(OH)2-C ACOH 7.37 %

1) HCOOH 2) 22,Et3N / CH2Cl2 39 ---•

3) HCOOH 4) 36, Et3N / CH2Cl2

52.6 % (2 steps ) OBzi PhSH, Cs2CO3

H•

OH DMF

67.3 %

H2, 10% Pd(OH)2-C ACOH, MeOH

12.9 %

Synthesis of NPTX-787-Z (3).

Scheme 8

Natural product

NPTX-787-X

NPTX-787-Y

NPTX-787-Z

1

ESI-Q-TOF-LC-MS/MS spectra of synthetic NPTX-787-X—Z (1-3) and natural product [(787 + H)+}.

Fig. 2

Natural product

NPTX-787-X (1)

NPTX-787-Y (2)

NPTX-787-Z (3)

MALDI-sector-MSIMS spectra of synthetic NPTX-787-X--Z (1--3) and natural product [(787 + Na)+].

Fig. 3

3) J. Willetts, R. L. Balster and J. D. Leander, Trend Pharmacol. Sci., 11 (1990), 423.

4) N. Kawai, A. Niwa and T. Abe, Brain Res., 247 (1982), 169.

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6) A. Ek. and B. Witkop, J. Am. Chem. Soc., 76 (1954), 5579.

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