Real-time RT-PCR 法による RS ウイルス遺伝子の検出と サブグループ型別
千葉市環境保健研究所
横井 一 田中 俊光 水村 綾乃 北橋 智子
（平成 24 年 3 月 30 日受付）
（平成 24 年 7 月 2 日受理）
Key words : RS virus, Real-time RT-PCR, subgrouping
要 旨
RS ウイルス（Respiratory Syncytial Virus：RSV）の検出とサブグループ型別を目的とする Real-time RT- PCR 法を開発した．RSV の F 遺伝子を標的配列として選択し，プライマーと TaqMan MGB プローブを新 たに設計した．RSV サブグループ A（RSV-A）および B（RSV-B）（コントロールプラスミド）ともに 2.5×
101から 2.5×107copies!tube の範囲で RSV 遺伝子の定量が可能であった．Real-time RT-PCR 法の検出限界 は，Conventional RT-PCR 法と比べて 10 倍から 100 倍高く，Nested PCR 法と同等であることが確認され，
他の呼吸器系ウイルス（インフルエンザウイルス，メタニューモウイルス，麻疹ウイルス，コクサッキーウ イルス，エンテロウイルス，エコーウイルス，ムンプスウイルス，パラインフルエンザウイルス，およびラ イノウイルス）との交差反応は認められなかった．
急性呼吸器症状を呈する患者から採取された 154 検体について Real-time RT-PCR 法により RSV の検出 を行った結果，40 検体から RSV 遺伝子が検出された．また，Real-time RT-PCR 法で陽性となった 40 検体 のうち，25 検体が RSV-A，15 検体が RSV-B であり，Nested PCR 法によるサブグループ型別の結果と一致 した．
以上の結果から，今回開発した Real-time RT-PCR 法は，RSV 遺伝子の検出定量と同時にサブグループの 型別も可能であり，RSV の遺伝子診断に有用であると考えられた．
〔感染症誌 86：569〜576，2012〕
序 文
RS ウイルス（Respiratory Syncytial Virus：RSV）
は，急性呼吸器感染症，特に小児の下気道感染症にお ける主要な原因ウイルスであり，1956 年に鼻感冒症 状を呈するチンパンジーから初めて分離１）された．RSV は，ゲノムとして全長約 15.2 kb の 1 本鎖マイナス RNA を有し，パラミクソウイルス科に分類される．ウ イルス粒子の大きさは 100〜350nm，形状は多形性を 示し，エンベロープを有する．エンベロープには F（Fu- sion glycoprotein），G（Attachment glycoprotein），
および SH（Small hydrophobic）蛋白が存在し，ヌク レオカプシドには N（Nucleoprotein），P（Phosphopro- tein），および L（Large）蛋白などが存在する．RSV の血清型は 1 種類であるが，G 蛋白の抗原性２）により
2 つのサブグループ（RSV-A，RSV-B）に分類される．
RSV の主な臨床症状は細気管支炎であり，特に乳 幼児において重症化しやすい傾向があると同時に，高 齢者における下気道感染症の原因ウイルス３）としても 重要視されている．
RSV 感染症の疫学的解析には，従来から HEp-2 や VeroE6 細胞等による分離培養，蛍光抗体法，および 酵素抗体法等が用いられてきたが，ウイルス量が少な い検体からの抗原検出やサブグループ型別は困難で あった．
近年，Reverse transcription-polymerase chain reac- tion（RT-PCR）法が RSV の検出に用いられるように
なり４）〜６），高感度なウイルス遺伝子の検出とウイルス
株のサブグループ型別や遺伝子解析が可能であること から，RSV の流行状況調査７）や集団感染事例の疫学的 解析８）９）における主要な診断技術として用いられてい 原 著
別刷請求先：（〒261―0001）千葉市美浜区幸町 1―3―9 千葉市環境保健研究所健康科学課 横井 一
る．しかしながら，RT-PCR 法による遺伝子検出は，
電気泳動による PCR 産物の確認と得られた PCR 産物 のシークエンス解析を必要とするため，迅速性に欠け る一面もある．
そこで，本研究では迅速性，高感度，定量性を兼ね 備えた Real-time RT-PCR 法を用いた RSV 検出法の 開発を目的として，RSV 遺伝子の検出と同時にサブ グループ型別が可能な遺伝子診断法の構築について検 討した．
材料および方法 1．供試検体
Real-time RT-PCR 法の検出感度と特異性を確認す るため，RSV 感染症患者の鼻汁から VeroE6 細胞に より分離された RSV-A と RSV-B の 2 株を VeroE6 細 胞により 1 回継代した後，培養上清を回収し，RNA の抽出時まで−80℃ に保存した．
一方，他の呼吸器系ウイルスとの交差反応の有無を 確認する目的で，A 型インフルエンザウイルス（5 株），B 型インフルエンザウイルス（2 株），メタニュー モウイルス（4 株），麻疹ウイルス（3 株），コクサッ キー A 群ウイルス（7 株），コクサッキー B 群ウイル ス（5 株），エンテロウイルス 71（1 株），エコーウイ ルス（2 株），およびムンプスウイルス（1 株）の分離 株について，培養上清を回収し，RNA の抽出時まで−
80℃ に保存した．また，RT-PCR 法によりパライン フルエンザウイルス遺伝子が検出１０）された咽頭拭い液
（1 検体）と鼻汁（2 検体），およびライノウイルス遺 伝子が検出１１）された鼻汁（3 検体）を RNA の抽出時 まで−80℃ に保存した．
さらに，臨床検体に対する本法の有用性を確認する ため，上気道炎または下気道炎（気管支炎，肺炎）の 急性呼吸器症状を呈した患者から採取された臨床材料 154 検体（咽頭拭い液 74 検体，鼻汁 76 検体，気管吸 引液 2 検体，および喀痰 2 検体）を RNA の抽出時ま で−80℃ に保存した．なお，臨床検体の採取に際し，
患者に対してその目的が感染症発生動向調査に基づく ものであることを説明し，口頭で同意を得た．
2．Real-time RT-PCR 用 プ ラ イ マ ー お よ び TaqMan MGB プローブの設計
RSV ゲノムにおける F 遺伝子領域を Real-time RT- PCR 法の標的配列に選択した．GeneBank に登録さ れている RSV 34 株（RSV-A：19 株，RSV-B：15 株）
の配列アライメントを行い１２），RSV-A と B に共通の 配列を検索した（Fig. 1）．
検索結果に基づき，RSV-A と RSV-B の配列に共通 の sense プライマーと antisense プライマーを設計し た．また，RSV をサブグループ別に検出するため，
RSV-A と B の配列にそれぞれ特異的な VIC 標識，お
よび FAM 標識 TaqMan MGB プローブを設計した
（Table 1）．
なお，各プライマーの合成は Invitrogen に依頼し，
TaqMan MGB プローブについては Applied Biosys- tems（ABI）に依頼した．
3．ウイルス RNA の抽出
ウイルス分離株の培養上清 200μL，または臨床検体 の遠心上清 200μL から High Pure Viral RNA Kit
（Roche）を使用してウイルス RNA の抽出を行った後，
DNaseI により処理した．抽出 RNA 18μL に対して，5 units!μL RNase-free DNaseI（TaKaRa）4.0μL，およ び 10×DNaseIBuffer 21.0μL を混合した反応液を 2μL 加えた後，37℃ で 30 分，次いで 75℃5 分の反応後，4℃
で保持したも の を DNaseI 処 理 ウ イ ル ス RNA と し た．
4．逆転写反応による cDNA の作製
DNaseI 処理ウイルス RNA 20μL に対し，RNase- free 滅菌蒸留水 4.5μL，5×First-Strand Buffer 8.0μL，
10mM dNTP Mix 2.0μL，3.0μg!μL Random Primers 0.4μL，100mM DTT 2.0μL，40units!μL RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor（Invitrogen）1.1 μL，200units!μL Super ScriptIIIRNaseH（−）revers transcriptase（Invitrogen）2.0μL を加えた後，42℃60 分，99℃5 分の反応後，4℃ で保持したものを cDNA とし，−30℃ に保存した．
5．RSV 陽性コントロールプラスミドの作製 RSV-A および B の F 遺伝子を RSVABf-F，および RSVABf-R プライマー（Table 1）を用いた Conven- tional RT-PCR 法によって増幅させた．これらの PCR 産物を TOPO TA Cloning Kit for Sequencing（Invi- trogen）を用いてサブクローニングした．PCR 産物 の塩基配列をダイレクトシークエンス法により確認し た後，Plasmid Mini Kit（QIAGEN）により環状プラ スミドを精製し，制限酵素 SpeI で切断した．得られ た直鎖状プラスミドの OD 値を測定し，プラスミドの コピー数を算出した後，TE buffer（10mM Tris-HCl，
pH8.0；1mM EDTA，pH8.0）にて 1.0×109copies!μL の濃度に調製し，使用時まで−80℃ に保存した．
6．Real-time RT-PCR 法
1 tube あたり 25μL の反応量で実施した．Quan- tiTect Probe PCR Master Mix（QIAGEN）12.5μL，100 μM sense プライマー 0.1μL，100μM antisense プライ マー 0.1μL，10μM VIC 標識プローブ 0.25μL，10μM FAM 標識プローブ 0.25μL，および RNase-free 滅菌 蒸留水 9.3μL を混合した反応液（22.5μL）に cDNA 2.5 μL を加え，ABI 7300 リアルタイム PCR システム
（ABI）を使用して，95℃15 分の反応後，94℃15 秒と 56℃75 秒の反応を 45 回繰り返した．
Fig. 1 Aligment of 34 nucleotide sequences in fusion glycoprotein (F) gene of respiratory syncytial virus sub- group A and B.
The subgroup/accession number is shown beside the sequence. Asterisks below the alignment indicate the nu- cleotide sequence consensus. Solid-line arrows: newly designed primers. Double-line arrows: TaqMan MGB probes.
一方，RSV-A および B のコントロールプラスミド については，それぞれ 1.0×107から 1.0×101copies!μL までの 10 倍段階希釈系列（TE buffer を使用）を作 製した後，cDNA と同様に増幅反応を行った．反応 終了後に ABI Sequence Detection System Software ver. 1.4 を使用し，ウイルス遺伝子の検出と定量解析 を実施した．
7．Conventional RT-PCR 法および Nested PCR 法 RSV の N 遺伝子に設計された Stockton ら４）のプラ イマーセット（Table 1）を用いた．Conventional RT- PCR 法は，10×Ex Taq Buffer 5.0μL，100μM プライ マー各 0.25μL，2.5mM dNTP Mix 4.0μL，5units!μL Ex Taq Hot Start Version（TaKaRa）0.25μL，およ び RNase-free 滅菌蒸留水 35.25μL を混合した反応液
（45μL）に cDNA 5.0μL を加え，GeneAmp PCR Sys- tem 9700（ABI）を使用して，95℃3 分の反応後，94℃
60 秒，50℃60 秒，および 72℃60 秒の反応を 35 回繰 り返した．
Nested PCR 法によるサブグループ型別は，10×Ex Taq Buffer 2.5μL，100μM プライマー各 0.125μL，2.5 mM dNTP Mix 2.0μL，Ex Taq Hot Start Version 0.125μL，お よ び RNase-free 滅 菌 蒸 留 水 18.875μL を 混合した反応液（24μL）に PCR 産物 1.0μL を 加 え，
95℃3 分の反応後，94℃60 秒，60℃60 秒，および 72℃
60 秒の反応を 35 回繰り返した．PCR 産物の確認は 2.5％（w!v）アガロースゲル電気泳動により行った．ア ガロースゲルをエチジウムブロマイド染色後，UV 照 射下で目的のバンドが確認されたものを陽性とした４）．
Fig. 2 Amplification of 10-fold serial dilution from respiratory syncytial virus subgroup A and B control plasmid template in real-time RT-PCR assay.
Log10 of known numbers of subgroup A (A) and B (B) control plasmids containing 2.5×107 to 2.5
×101 copies per tube plotted against corresponding cycle threshold (Ct) values to generate a stan- dard curve.
Table 1 Primer and probe oligonucleotides used for real-time RT-PCR, conventional RT-PCR and nested PCR of respiratory syncytial virus.
PCR assay Primer or
Probe Sequence (5ʼ → 3ʼ)＊a Gene position
(Polarity＊b) Location
Real-time RT-PCR
RSVf-F1 CARCAAAGTTAYTCTATCATGTC F (＋) 6460-6482＊e
RSVf-R1 GATCCTGCATTRTCACARTACCA F (−) 6656-6634＊e
RSVfA-TPf2＊c VIC-TGTAGTACAATTRCCACT-MGB-NFQ F (＋) 6510-6527＊e RSVfB-TPf＊d FAM-TGTRCAGCTRCCTATC-MGB-NFQ F (＋) 6513-6528＊e Conventional
RT-PCR＊g
RSV AB-F GTCTTACAGCCGTGATTAGG N (＋) 1628-1647＊e
RSV AB-R GGGCTTTCTTTGGTTACTTC N (−) 2465-2446＊e
Nested PCR＊g
RSV A-F GATGTTACGGTGGGGAGTCT N (＋) 1863-1882＊e
RSV A-R GTACACTGTAGTTAATCACA N (−) 2197-2178＊e
RSV B-F AATGCTAAGATGGGGAGTTC N (＋) 1905-1924＊f
RSV B-R GAAATTGAGTTAATGACAGC N (−) 2089-2070＊f
Construction of plasmid DNA＊h
RSVABf-F CATTRATCAATGATATGCCTATAAC F (＋) 6389-6413＊e
RSVABf-R TCACTTGGTAATGTYAAACTGTTCA F (−) 6746-6722＊e
＊a Mix bases in degenerated primers and probe are as follows: Y, C or T; R, G or A.
＊b (＋), Sense; (−), antisense.
＊c The minor groove binder (MGB) probe is labeled with VIC reporter dye at the 5ʼ end and with MGB and a nonfluores- cent quencher (NFQ) at the 3ʼ end of the oligonucleotide.
＊d The MGB probe is labeled with FAM reporter dye at the 5ʼ end and with MGB and a NFQ at the 3ʼ end of the oligo- nucleotide.
＊e Location is relative to the genome of respiratory syncytial virus (RSV) subgroup A (accession number M11486).
＊f Location is relative to the genome of RSV subgroup B (accession number AY353550).
＊g Conventional RT-PCR and nested PCR were performed with Stocktonʼs primer set.4)
＊h PCR products were generated using primers designed external to real-time RT-PCR primers.
結 果
1．Real-time RT-PCR 法の定量性と特異性
RSV-A と B の各コントロールプラスミドの 10 倍段 階希釈系列を用いて，Real-time RT-PCR 法の増幅曲 線および検量線の検討を行った．その結果，2.5×101
から 2.5×107copies!tube の範囲内で，RSV-A および B ともに PCR サイクル数に比例した遺伝子の増幅が 認められた．また，X 軸にコントロールプラスミドの コピー数（対数表示），Y 軸に PCR サイクル数（Ct 値）をプロットした検量線は，Fig. 2（A，B）に示
Table 2 Reproducibility of real-time RT-PCR assay of respiratory syncytial virus.
Subgroup and reproducibility
CV (%) for concentration of RSV control plasmid (copies/tube)＊a
2.5×101 2.5×102 2.5×103 2.5×104 2.5×105 2.5×106 2.5×107 RSV-A
Intra-assay＊b 0.99 0.55 0.37 0.35 0.38 0.20 0.42
Inter-assay＊c 1.37 0.63 0.94 0.52 0.46 0.45 0.64
RSV-B
Intra-assay 0.91 0.78 0.41 0.22 0.36 0.37 0.49
Inter-assay 1.07 0.84 0.61 0.67 0.83 0.50 0.86
＊a Ten-fold serial dilution of respiratory syncytial virus control plasmid; dilution series thawed on three dif- ferent days and assays performed in triplicate for each dilution. CV: coefficient of variation.
＊b Determined from three replicates within each assay.
＊c Determined from three independent assays performed on different days.
Table 3 Comparison of detection limit of real-time RT-PCR with that of conventional RT-PCR or nested PCR in culture fluid of respiratory syncytial virus.
Subgroup Concentration of virus cDNA (copies/tube)
Maximum 10-fold serial dilution detected by PCR assay＊a Real-time RT-PCR (Ct＊b) Conventional RT-PCR＊c Nested PCR＊c
A 1.70×107 10−6 (40.34) 10−5 10−6
B 3.13×106 10−6 (40.98) 10−4 10−5
＊a cDNA solution obtained from each subgroup of respiratory syncytial virus RNA by the RT reaction was 10-fold serial diluted by sterilized TE buffer.
＊b Ct: threshold cycle
＊c Conventional RT-PCR and nested PCR results were considered positive when the excepted amplification product was visible on agarose gel.
すように RSV-A（R2＝0.999，Slope：-3.42）および B
（R2＝0.999，Slope：-3.41）において，それぞれ直線 性を示した．
さらに，コントロールプラスミドの 10 倍段階希釈 系列ごとに実験内における Ct 値（n＝3）の変動につ いて検討した結果，RSV-A の変動係数（CV）は 0.20％
から 0.99％，RSV-B では 0.22％ から 0.91％ の範囲で あった．また，実験間における Ct 値（n＝3×3 回）の 変 動 に つ い て も 検 討 し た と こ ろ，RSV-A の CV は 0.45％ か ら 1.37％，RSV-B で は 0.50％ か ら 1.07％ の 範囲であった（Table 2）．
以上の結果から，本法による RSV のサブグループ 型別と再現性の良い定量が可能であることが明らかと なり，検出感度は各サブグループともに 2.5×101copies
!tube であると推定された．
一方，A 型インフルエンザウイルス，B 型インフル エンザウイルス，メタニューモウイルス，麻疹ウイル ス，コクサッキー A 群ウイルス，コクサッキー B 群 ウイルス，エンテロウイルス 71，エコーウイルス，ム ンプスウイルス，パラインフルエンザウイルス，およ びライノウイルスに対する交差反応性について確認し た結果，遺伝子の増幅は認められなかった．
2．Real-time RT-PCR 法における RSV 遺伝子の検 出限界
RSV-A と B から作製した各 cDNA を TE buffer に て 10 倍段階希釈（10-1から 10-7倍希釈）し，Real-time RT-PCR 法の検出限界について確認した（Table 3）．
その結果，RSV-A では 10-6希釈（Ct 値：40.34），RSV- B も 10-6希釈（Ct 値：40.98）まで遺伝子が検出され た．
一方，同じ cDNA の 10 倍段階希釈系列を用 い て Conventional RT-PCR 法と Nested PCR 法を行った ところ，Conventional RT-PCR 法において，RSV-A では 10-5希釈，RSV-B では 10-4希釈まで遺伝子が検出 された．Nested PCR 法においては，RSV-A で 10-6希 釈，RSV-B で 10-5希釈まで遺伝子が検出された．
3．臨床検体からの RSV 遺伝子の検出
Real-time RT-PCR 法によって 154 検体のうち 40 検 体から RSV 遺伝子が検出された．Conventional RT- PCR 法を基準とした場合の Real-time RT-PCR 法の感 度は 100％，特異性は 92.7％ であった．一方，Nested PCR 法を基準とした場合は感度，特異性ともに 100％
であった（Table 4）．このことから，Real-time RT-PCR 法の感度と特異性は，Conventional RT-PCR 法より も高く，Nested PCR 法と同等であることが明らかと なった．
Fig. 3 Amount of respiratory syncy- tial virus subgroup A and B detected from clinical specimens (n＝40) by re- al-time RT-PCR.
Filled circles represent clinical samples detected by both conventional RT-PCR and nested PCR. Open circles represent clinical samples detected by nested PCR alone.
Table 4 Comparison of sensitivity and specificity of real-time RT-PCR with conventional RT-PCR or nested PCR in detecting respiratory syncytial virus RNA from clinical specimens.
PCR assay
Number of specimens by real-time RT-PCR
Positive Negative Total Conventional RT-PCR
Positive 31 0 31
Negative 9 114 123
Total 40 114 154
Nested PCR
Positive 40 0 40
Negative 0 114 114
Total 40 114 154
Real-time RT-PCR 法で陽性となった 40 検体のう ち，25 検体が RSV-A，15 検体が RSV-B であり，Nested PCR 法によるサブグループ型別の結果と一致した．
Conventional RT-PCR 法と Nested PCR 法の両者が 陽性となった 31 検体（RSV-A が 19 検体，RSV-B が 12 検 体）の コ ピ ー 数 は 7.0×102か ら 6.7×106copies! tube であった．一方，Nested PCR 法のみが陽性となっ た 9 検 体（RSV-A が 6 検 体，RSV-B が 3 検 体）の コ ピー数は，4.8×100から 1.0×102copies!tube であった
（Fig. 3）．
考 察
近年，RT-PCR 法をはじめとする遺伝子検出法がウ イルス感染症の診断に広く用いられるようになった．
特に迅速性，高感度，および定量性を兼ね備えた Real- time PCR 法は，既に RSV 遺伝子の検出と定量にも 応用されている１３）〜１８）．中でも，1 本の tube で RSV 遺 伝子の検出定量と同時にサブグループ型別も可能な Real-time PCR 法 が Do ら１５），Falsey ら１６），お よ び Kuypers１８）らによって報告されている．
Do ら１５）は，N 遺伝子を標的配列として選択し，プ ライマーを設計しているが，プローブについては LNA
（Locked Nucleic Acid）プローブを使用している．こ のプローブは TaqMan MGB プローブよ り も 相 補 DNA に対する熱安定性が上昇することから，結合親 和性が高く，Tm 値をさらに高く設定できる利点があ り，本法よりも 10 倍以上高い検出感度を実現してい る．しかしながら，患者の鼻腔洗浄液に含まれる RSV 量が 103copies から 1010copies!mL の範囲内である１８）こ とを考慮すると，本法は臨床検体からの検出に十分な 感度を有するものと考えられる．
Kuypers ら１８）は，P 遺伝子にプライマーと TaqMan MGB プローブを設計しており，検出感度は本法と同 等であるが，1 反応当たり 10μL の RNA が必要であ るため，複数ウイルスの同時検索においては本法が有
利であると考えられた．また，Conventional RT-PCR 法や Nested PCR 法に対する感度や特異性の比較を実 施していない．一方，Falsey ら１６）は，F 遺伝子にプラ イマーと TaqMan プローブを設計しているが，Con- ventional RT-PCR 法を行った後に Nested PCR 法に よって TaqMan プローブの蛍光を検出する方法であ るため，迅速性に欠ける一面がある．
本研究で構築した Real-time RT-PCR 法は，RSV の F 遺伝子を標的配列として選択し，より多くの RSV 株を検出できるようにプライマーとプローブを設計し た．すなわち，RSV-A と B に共通な配列を検索し，増 幅効率の低下を防ぐためにミスマッチが最小限となる よ う に sense お よ び antisense プ ラ イ マ ー を 設 計 し た．プローブについては，Kuypers１７）らと同様に Tm
（℃）の上昇と特異性の向上を期待し，RSV-A と B を サブグループ別に検出するための TaqManMGB プ ローブをそれぞれ 1 種類ずつ設計した．
その結果，本法は，RSV-A または RSV-B のいずれ においても 2.5×101copies!tube 以上の遺伝子が存在 すれば，1 本の tube で RSV の検出と定量，並びにサ ブグループ型別が可能であり，他の呼吸器系ウイルス との交差反応もなく高い特異性を有することが確認さ れた．また，本法の検出限界は，Conventional RT-PCR 法と比べて 10 から 100 倍高く，Nested PCR 法と比 べて同等であることが確認された．さらに，臨床検体
を用いた検討においても，本法は Nested PCR 法と同 等の感度と特異性を有し，4.8×100copies!tube（鼻汁 中の RNA 量に換算する と 9.6×102copies!mL）の 検 体からも遺伝子の検出が可能であった．また，本法に よるサブグループ型別の結果も Nested PCR 法と完全 に一致したことから，サブグループ型別の信頼性も高 く，RSV の遺伝子診断に十分に応用できることが明 らかとなった．
現在，著者らの施設において呼吸器系ウイルスの遺 伝子検索を実施した際に，複数ウイルスの遺伝子が陽 性となるケースが少なくない．このことは，呼吸器感 染症の診断においては，複数ウイルスの遺伝子検索が 必要であることを示唆し，一度に数種類のウイルス検 索が可能な検査方法の導入が必要であると考えられ る．しかしながら，Do ら１５）の検出系は PCR 反応時の アニーリングと伸長反応の温度が 45℃ と低く，多く の呼吸器系ウイルスのリアルタイム PCR で採用され ている反応温度（55℃〜60℃）と 10℃ 以上の開きが あるため，他の呼吸器系ウイルスを 1 台のリアルタイ ム PCR 装置で同時に検索することが困難である．一 方，今回構築した Real-time RT-PCR 法は，将来的に RSV を含めた複数ウイルスの検出系を 1 台の装置で 同時進行させることを想定し，アニーリング温度を 56℃ に設定したことから，検査効率の向上に貢献で きるものと思われる．
本研究で開発した Real-time RT-PCR 法は，従来の Conventional RT-PCR 法や Nested PCR 法と比較し て，PCR 反応後の電気泳動が不要であり，PCR 産物 のシークエンス解析等も不要であることから，簡便で 迅速に，かつ高感度に RSV 遺伝子の検出と定量，さ らにはサブグループ型別が可能である．従って，RSV 感染症の遺伝子診断のみならず，集団感染事例におけ る疫学調査や地域における流行状況調査にも応用可能 であると考えられる．
利益相反自己申告：申告すべきものなし
文 献
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Detection and Subgrouping of Respiratory Syncytial Virus RNA by Real-time RT-PCR Hajime YOKOI, Toshimitsu TANAKA, Ayano MIZUMURA & Tomoko KITAHASHI
Chiba City Institute of Health and Environment
The TaqMan-based quantitative real-time RT-PCR assay we developed uses specific probes to identify respiratory syncytial virus (RSV) and to distinguish RSV subgroups A (RSV-A) and B (RSV-B).
We selected conserved regions of the F gene as assay targets and designed new primers and TaqMan MGB probes to detect RSV-A and B. RSV-A and B control plasmids confirmed real-time reverse transcrip- tion polymerase chain reaction (RT-PCR) reactivity whose efficiency was 2.5×101 to 2.5×107 copies!tube.
The assay detection limit was 10 to 102 times higher than that of the conventional RT-PCR assay and was equal to the nested PCR assay. No cross-reactions occurred against other respiratory viruses, including influ- enza virus, metapneumovirus, measles virus, coxsackievirus, enterovirus, echovirus, mumps virus, parainflu- enza virus, and rhinovirus.
Of 154 clinical specimens derived from subjects with acute respiratory infection and tested by using both real-time RT-PCR and nested PCR, 40 were RSV-positive in both assays. Of these, 25 were identified as RSV-A and 15 as RSV-B by both assays. There was 100％ concordance in RSV subgroup identification be- tween real-time RT-PCR and nested PCR assays.
These results indicate that our real-time RT-PCR assay can be used for rapid detection, quantitative analysis and subgrouping of RSV-A and RSV-B.
