岡 山 医 誌 (1994) 106, 401∼413
レ ー ザ ー サ イ トメ ー タ ー を 用 い た
heat shock
protein
72の 加 温 お よ び
抗 癌 剤 添 加 に よ る 動 態 の 検 討
岡山大学医学部産科婦人科学教室(指 導:工 藤尚文教授)
澤
井
秀
秋
(平 成6年1月31日 受 稿)
Key words:レ ー ザ ー サ イ ト メ ー タ ー, heat shock protein,抗 癌 剤
緒 言 我 々 は, 1961年 よ り子 宮 頸 癌,卵 巣 癌,外 陰 癌,腟 癌 な ど 多種 の 婦 人 科 悪 性 疾 患 に 対 し て 温 熱 治 療 を併 用 し,良 好 な 治 療 成 績 を得 て きた1) 2) 3). 温 熱 治 療 を 臨 床 で 行 う場 合 の 留 意 事 項 と し て, そ の 腫 瘍 に 適 し た 加 温 装 置 の 選 択,加 温 温 度 及 び 加 温 時 間 の 設 定,正 確 な 測 温 な どが あ り,さ らに 温 熱 耐 性 の 問 題 が あ る.温 熱 耐 性 と は 細 胞 に1度 亜 致 死 的 な 加 温 をす る こ と に よ り,そ の 細 胞 が 次 の 加 温 に 対 し て1時 的 に 温 熱 抵 抗 性 に
な る4)こ とで あ る. heat shock protein(HSP)
は ス トレ ス 蛋 白 と も 呼 ば れ,こ の 温 熱 耐 性 の 獲 得 に 最 も 関 与 し て い る物 質 と考 え ら れ て い る. な か で もHSP 70 familyと 呼 ば れ る1群 の 蛋 白質 の 誘 導 動 態 が,特 に 細 胞 の 温 熱 耐 性 の 獲 得 に 密 接 に 関 係 して い る こ とが 多 くの 研 究 者 に よ っ て 報 告 さ れ て い る5) 6) 7).す な わ ち,こ のHSP 70 familyは,熱 で 変 性 した 蛋 白 質 複 合 体 をATP の エ ネ ル ギ ー を使 っ て修 復 し,凝 集 し た 蛋 白質 を解 離 させ る 働 き を持 ち8) 9),ま た 正 常 温 度 で も 分 子 シ ャ ペ ロ ン と し て,標 的 とな る ポ リペ プ チ ド鎖 の 折 り畳 み(folding)や,複 合 体 を 形 成 す る 場 合 は そ の 集 合(assembly)を 手 助 け し て い る と考 え られ て い る10).さ らに 最 近 で は 温 熱 耐 性 ば か り で な く,こ のHSPが 抗 癌 剤 耐 性 の 一 因, ひ い て は 癌 の 予 後 因 子 に な り う る の で は な い か と の 報 告 も み られ る11). そ こ で 今 回 我 々 は, HSP 70 familyの な か で も代 表 的 なhsp72の 加 温 及 び 抗 癌 剤 添 加 に お け る誘 導,局 在 な どの 培 養 細 胞 中 に お け る動 態 変 化 を, Meridian社 製 の レー ザ ー サ イ トメー タ ー, ACAS570(ACAS)を 用 い 検 討 し た.こ のACAS は ア ル ゴ ン イ オ ン レ ー ザ ー を用 い た 蛍 光 分 析 に よ り付 着 細 胞 の 形 態 的,定 量 的 解 析 お よ び選 別 機 能 な ど 多機 能 を も つ レ ー ザ 一 顕 微 鏡 で あ る. 材 料 と 方 法 1.実 験 材 料 子 宮 頚 癌 由 来 のHeLa細 胞 を 用 い,こ れ を37℃ の5%CO2イ ン キ ュ ベ ー ター 内 で, 10%ウ シ胎
児 血 清, penicilin-G 200IU/ml, streptomycin
100μg/mlを 含 有 す るRPMI-1640培 養 液 を用 い て
単 層 培 養 し た.実 験 に は この 対 数 増 殖 期 の 細 胞
を使 用 し た.蛍 光 抗 体 法 に 供 す る 際 はLab-Tek
chamber slide, Western blotting法 お よ び 感 受
性 試 験 に 供 す る 際 は そ れ ぞ れ100mm, 60mmのcul ture plateを 使 用 し培 養 し た. 2.実 験 方 法 1)温 熱 お よ び 抗 癌 剤 感 受 性 試 験: clonogenic assayを 用 い 加 温 お よ び 抗 癌 剤 に 対 す るHeLa細 胞 の 感 受 性 を 決 定 し た.加 温 は 43℃ 恒 温 水 中 で 行 い,加 温 時 間 を15∼120分 と し た.抗 癌 剤 は 現 在 婦 人 科 悪 性 疾 患 で 頻 用 さ れ て い るcisplatin(CDDP), adriamycin(ADM) , peplomycin(PEP), etoposide(VP-16)を 使 用 し,接 触 時 間 は2時 間,接 触 濃 度 は0.01∼10 μg/mlと した.加 温 お よ び 薬 剤 処 理 したHeLa細 401
表1 •@Immunofluorescence protocol of hsp 72
1) HeLa cells were seeded in a Lab-TeK chamber slide and incubated for 3 days at 37•Ž in a CO2 incubator.
2) Heat shock procedure.
3) Fix cells in 1:1, ethanol: acetone, for 10 minutes at 2-8•Ž.
4) Block non-specific binding by treating with normal sheep serum for 20 minutes at room temperature.
5) Incubate with monoclonal anti-72kD heat shock protein (Amersham, U. S. A.), at a dilution of 1: 500 in PBS for 1 hour at room temperature.
6) Incubate with biotinylated anti-mouse 1g, diluted 1:100 in PBS for 1 hour.
7) Incubate with fluorescein-streptavidin, diluted 1:50 in PBS for 1 hour.
8) Incubate with Propidium iodide, diluted 0.5ƒÊg/ml in PBS for 20 minutes.
9) Mount slides and view slides using an ACAS 570.
表2•@ Western blotting procedure of hsp 72
1) HeLa cells were seeded in a culture plate (100mm in diameter) and incubated for 3 days at 37•Ž.
2) Heat shock procedure.
3) The cells were lysed by sonication for 20-30 seconds in SDS-sample buffer (Laemmli 1970). Protein concentration was measured with Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad, U. S. A.).
4) The proteins in the cell lysate were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
5) Transfer onto nitrocellulose membrane.
6) Non-specific binding sites were blocked by immersing the membrane in 5% blocking agent in PBS-T.
7) Incubate the membrane with monoclonal anti-72kD heat shock protein (1/500 dilution in PBS) for 1 hour.
8) Incubate the membrane with biotinylated link antibody (LSAB kit, DAKO, JAPAN) for 10 minutes.
9) Incubate the membrane with HRP-conjugated streptavidin (LSAB kit, DAKO, JAPAN) for 10 minutes.
10) Immunodetection using ECL Western blotting products (Amersham, U. S. A.).
11) Expose to autoradiography film and paper.
12) The density of each band was measured by Scanning Imager (Molecular Dynamics) and relative volume was obtained.
図2 •@ Surviving fraction curves of heating (43•Ž) on HeLa cells. 胞 をPBSに て3回 洗 浄 後, 37℃ に 再 び 戻 し7 日間 培 養 し コ ロ ニ ー を形 成 させ た.形 成 し た コ ロ ニ ー を メ タ ノ ー ル 液 で 固 定 し,続 い て ギ ム ザ 染 色 を行 い,細 胞 数50個 以 上 の コ ロ ニ ー 数 を カ ウ ン トし,こ れ を コ ン トロ ー ル と比 較 し た. 2) hsp72の 間 接 蛍 光 抗 体 法 に よ る染 色 お よび ACASで のhsp72の 半 定 量 法: HeLa細 胞 を加 温 及 び 抗 癌 剤 処 理 後,間 接 蛍 光 抗 体 法 に よ り染 色,こ れ を 通 常 の 蛍 光 顕 微 鏡 お よ びACASに よ り観 察,測 定 し た.こ の 蛍 光 抗 体 法 の概 略 を 表1に 示 す. 1次 抗 体 と し て は
Amersham社 製 のmonoclonal anti-hsp72を 使
レ ー ザ ー サ イ トメ ー タ ー に よ るhsp72の 動 態 検 討 403 る核 染 色 を行 な い2重 染 色 と し た. ACASで の 測 定 は ス ラ イ ド染 色 面 上 を4等 分 し,一 定 出 力 の レー ザ ー 照 射 に よ り, 4等 分 し た そ れ ぞ れ の 領 域 か ら任 意 に144μm四 方 に 相 当 す る画 像 を テ レ ビ 画 面 上 に 表 示 させ,こ れ を デ ィ ス ク に 記 録 し た. hsp72の 半 定 量 解 析 は, ACAS内 蔵 の 解 析 ソ フ トに て,記 録 し た 画 像 か ら そ れ ぞ れ 任 意 に 約20個 ず つ,合 計80∼100個 の 細 胞 に つ い て の 蛍 光 量,面 積,周 囲 長,形 態 等 を 計 測,数 量 化 し た.こ の デ ー タ ー よ り細 胞1個 あ た りの 平 均 蛍 光 量 を 計 算 し,こ れ を コ ン トロ ー ル と比 較 し た (図1).な お 観 察 の み の 場 合 は レー ザ ー 出 力, 倍 率 を 任 意 に 変 え フ ィ ル ム に 撮 影 し た. 3) Western blotting法 に よ るhsp72の 半 定 量 法: 概 略 を表2に 示 す. Laemmliの 方 法12)に従 い 処 理 細 胞 をSDS sample buffer中 で 溶 解 し た 後, SDS-PAGEに て 電 気 泳 動 を 行 っ た.
SDS-PAGEの 各 レー ン にはBio-Radのprotein assay
kitを 使 い総 蛋 白 量 を調 整 した 試 料 を流 した.得 られ た ゲ ル か ら 蛋 白 質 を ニ トロ セ ル ロー ス メ ン
ブ レ ン に 転 写 し, LSAB kit(DAKO社), ECL
system(Amersham社)を 使 用 し,フ ィ ル ム 上
に 感 光 さ せ た.得 ら れ た バ ン ド はMolecular
Dynamics社 のScanning Imagerを 用 い て 半
定 量 化 し た.こ の 結 果 をACASに て 測 定 し た hsp72の 半 定 量 の 結 果 と比 較 検 討 し た. 結 果 1.温 熱 お よ び 抗 癌 剤 感 受 性 の 決 定 43℃ の 加 温 及 び 抗 癌 剤 接 触 後clonogenic assayに よ り得 ら れ た 生 存 曲 線 を 図2, 3に 示 す.こ の 温 度 で は30分 加 温 で コ ロ ニ ー 形 成 は 約 50%抑 制 さ れ, 120分 加 温 で は ほ とん ど コ ロ ニ ー 形 成 は 認 め られ な か っ た.図3か ら 回 帰 直 線 法 に よ り得 られ た 各 薬 剤 の50%抑 制 濃 度 値(IC50: 50% inhibition concentration)はCDDP, ADM, PEP, VP-16に お い て そ れ ぞ れ, 0.17μg/ ml, 0.002μg/ml, 0.08μg/ml, 0.04μg/mlで あ っ た.以 後 の 実 験 で は こ のIC50と そ の10倍, 100倍 の 濃 度 を用 い た. 前 実 験 と して 行 っ たWestern blotting法 に
よ るhsp72の 加 温 に よ る 誘 導 合 成 は 加 温 終 了 後 8時 間 の 時 点 で は, 43℃ 加 温 に お い て 最 も著 明 で あ っ た た め,以 後 の 実 験 で は43℃ で 加 温 し た. ま た こ の 温 度 で は 間 接 蛍 光 抗 体 法 に よ る観 察 で, 1時 間 加 温 で 約80%, 2時 間 加 温 で ほ ぼ100%の HeLa細 胞 に お い てhsp72の 核 へ の 移 行 お よ び 集 束 が 認 め られ た.し た が っ て, hsp72の 核 へ の 移 行 に つ い て は2時 間 加 温 で 観 察 し た. 2.加 温 に よ るhsp72のACASお よ び 通 常 の 蛍 光 顕 微 鏡 を使 用 し た 動 態 観 察 ま ず43℃ 2時 間 加 温 に お け るhsp72の 局 在 の 経 時 的 変 化 をFITC標 識 に て 通 常 の 蛍 光 顕 微 鏡 を使 用 し観 察 した(図4).加 温 前 の 無 処 理 の 状 態 で は, hsp72は 細 胞 質 の み に 均 等 に 見 ら れ,中 央 の 核 の 部 位 に は 存 在 し な か っ た.加 温 直 後 で は 核 内 に 集 束 し, hsp72が1部 顆 粒 状 に染 色 さ れ た.核 内 に 集 ま っ たhsp72は 加 温 終 了4∼6時 間 後 に 細 胞 質 に 戻 り,再 び 細 胞 質 の み 均 等 に 染 色 さ れ た.こ の 経 時 的 変 化 をACASで 観 察 し た 結 果 を 図5-7に 示 す.図5は 無 処 理 の 細 胞 で あ る が,左 側 はFITC標 識 に てhsp72を,右 側 が PI標 識 に て 核 内DNAを 観 察 し て い る.こ の 図 に お い て 中 央 の カ ラ ー テ ー ブ ル の 下 方 よ り上 方,つ ま り青 か ら赤 に 変 わ る程 蛍 光 量 が 多 い 事 を示 す. PI標 識 と比 較 す る とFITC標 識 のhsp72 は 構 成 的 に 細 胞 質 の み に 存 在 す る こ と が 分 か っ た.先 程 と同 様 の43℃ 2時 間 加 温 し た 細 胞 を経 時 的 にACASで 観 察 し た.図6が 加 温 直 後,図 7が 加 温 後8時 間 経 過 し た 細 胞 で あ る.加 温 直 後 にhsp72は 核 に 集 束 し8時 間 後 に ほ ぼ 完 全 に 細 胞 質 へ 戻 っ た.し か も8時 間 後 で は 明 らか に 蛍 光 量 の 増 加 が 認 め ら れhsp72の 増 加 が うか が え た.
3. ACAS法 とWestern blotting法 の 半 定 量
法 の 比 較 ACASで の 半 定 量 測 定 の 有 用 性 を確 か め る た め, Western blotting法 に よ りhsp72の 増 減 を 測 定 し, ACAS法 で 得 ら れ た 結 果 と比 較 検 討 し た.ま ず43℃ 2時 間 で 加 温 後,加 温 直 後 か ら10 時 間 後 のhsp72の 変 化 を検 討 した.で き あ が っ た バ ン ドを 前 記 の イ メー ジ ス キ ャ ナ ー を使 用 し, 未 処 理 のhsp72量 を1と し て 相 対 量 を測 定 した. hsp72は 加 温 終 了2時 間 後 よ り増 量 し,加 温 終 了 8時 間 後 ピ ー ク値 を 示 し 未 処 理 の 細 胞 の 約8倍 図8 Western blotting法 で 測 定 し た, 43℃ 2時 間加 温 後 のhsp72の 加 温 直 後 か ら10時 間 後 まで の変 化; SDS-PAGEを 使 用 し,各 レー ン に は総 蛋 白量 を調 整 した試 料 を流 した.右 側 は得 られ た バ ン ドを イ メー ジ ス キ ャナ ー を使 用 し,コ ン トロー ル に対 す る相 対 量 を測 定 しグ ラ フ化 した. hsp72は 加 温終 了2時 間後 よ り増 量 し,加 温終 了8時 間 後 に ピー ク値 を示 した.
レー ザ ー サ イ トメ ー ター に よ るhsp72の 動 態 検 討 405
図9 ACASで 測 定 した, 43℃ 2時 間加 温 後 のhsp72の 加 温 直後 か ら10時 間後 まで の 変化; Western blotting
法 の 結 果 とほ ぼ 同 様 の 増 減 パ ター ン を示 した. 図10 Western blotting法 で 測 定 し た, 43℃ 15分 か ら4時 間 の 加 温 終 了8時 間 後 のhsp72の 変 化; 15分 , 30 分 と 加 温 時 間 を 長 くす る に つ れ 増 量 し, 30分 で ほ ぼ プ ラ トー に 達 し, 4時 間 で は や や 減 量 し た. に 増 量 し た(図8).一 方,図9はACASに て 半 定 量 測 定 した 細 胞1個 あ た りの 蛍 光 量 を 未 処 理 の 細 胞 群 を1と して プ ロ ッ トし た もの で あ る が, Western blotting法 の 結 果 と ほ ぼ 同 様 の 増 減 パ タ ー ン を 示 した. さ ら に, 43℃ で の 加 温 時 間 を変 え て,加 温 終 了8時 間 後 のhsp72の 変 化 を 同 様 に 検 討 し た. 図10が そ の 結 果 で あ る が, 15分, 30分 と加 温 時 間 を 長 くす る に つ れ てhsp72は 増 量 し30分 で ほ ぼ プ ラ トー に 達 し, 4時 間 で は や や 減 量 した . こ の 条 件 下 で もACASで の 測 定 でWestern blotting法 と 同 様 の 増 減 パ タ ー ン が 得 られ た(図 11). 以 上 よ り, ACASに て 細 胞1個 あ た りの 蛍 光
図11 ACASで 測 定 し た, 43℃ 15分 か ら4時 間 の 加 温 終 了8時 間 後 のhsp72の 変 化; Western blotting法 の 結 果 と ほ ぼ 同 様 の 増 減 パ タ ー ン を 示 し た. 表3 抗 癌 剤 添 加 に よ るhsp72の 変 化 hsp72の 増量 が コ ン トロール に比 して50%未 満 では-, 50%以 上100%未 満 では+, 100%以 上 では2+,任 意 の4区 画 で細胞 数 の合 計が50個 に満 た ない場 合 細胞 破壊 著 明 と表記 した.濃 度 は IC50の何 倍 であるか を示 す.なお2時 間接 触 のみ薬 剤接 触 後, PBS にて 洗浄 し37℃ で8時 間培 養 後 固定 した.他 は接 触終 了 後直 ち に 固定 した.
量 を測定 す る今 回 の方 法 は,
hsp72の 量 的変 化 を
観 察 す るの に有 用 と考 え られ た.
4.抗
癌 剤 添加 に よ るhsp72の 動 態 変化
前記2.お
よび3.の
結 果 をふ まえ て,抗 癌
剤 添加 に よ るhsp72の 動 態 変化 をACASに
て
検 討 した.な おACASで
の測 定 で は,測 定 細 胞
数 を増 やせ ば定 量 の 正確 性 は増 す が,今 回の 実
験 で は 測 定 細 胞 数 を 約100個 と限 定 した ため 厳 密 な 正 確 性 は 期 待 で き な い 可 能 性 も あ る.し た が っ て,以 下 の 実 験 で は そ の 結 果 を, hsp72の 増 量 が コ ン トロ ー ル に 比 し て50%末 満 で は-, 50% 以 上100%未 満 で は+, 100%以 上200%未 満 で は 2+と して 表 記 し た(表3). ま ず 抗 癌 剤 添 加 の み に よ るhsp72の 動 態 変 化 を検 討 し た.抗 癌 剤 を 前 記 の3段 階 の 濃 度 で 培 養 液 に 添 加 す る と, 2時 間 の 接 触 に よ り接 触 終 了 直 後,接 触 終 了8時 間 後 と もに コ ン トロ ー ル に 比 し てhsp72の 局 在,誘 導 合 成 に 著 明 な 変 化 は 見 られ な か っ た.し か し24時 間 接 触 実 験 で は PEPの10倍 お よび100倍 濃 度 に お い ての みhsp72 の50%以 上 の 増 量 が 認 め ら れ た.さ ら に48時 間 接 触 で は 全 て の 抗 癌 剤 添 加 細 胞 に お い てhsp72 の50%以 上 の 増 加 が 認 め ら れ た.一 方, hsp72の 局 在 に 関 して は 抗 癌 剤 添 加 に よ る 変 化 は 認 め ら れ ず,図12で 示 す よ う に 加 温 時 に み ら れ る よ う なhsp72の 核 へ の 移 動 は 認 め られ な か っ た. 次 に43℃ 加 温 と 抗 癌 剤 添 加 を 同 時 に2時 間行 い,加 温 終 了 直 後PBSに て 細 胞 を よ く洗 浄 し, 再 び37℃ に 戻 し8時 間 培 養 す る 実 験 を行 っ た. そ の 結 果,加 温 終 了 直 後 で はhsp72量 に 変 化 は 認 め ら れ な か っ た が,加 温 終 了8時 間 後 で はレ ー ザ ー サ イ ト メー タ ー に よ るhsp72の 動 態 検 討 407 ADM 10倍 お よび100倍 濃 度 添 加 細 胞 に お い て の み,加 温 の み の 細 胞 に 比 しhsp72の 増 加 が50% 以 上 抑 制 さ れ た.こ の 実 験 に お い て も抗 癌 剤 添 加 に よ るhsp72の 局 在 の 変 化 は 認 め ら れ な か っ た.す な わ ち,抗 癌 剤 を 添 加 し て もhsp72は 加 温 に よ り核 へ 移 動 し,加 温 終 了 後 再 び 細 胞 質 へ 戻 っ た. 考 察 HSPは そ の 分 子 量 に よ りい くつ か の フ ァ ミ リ ー に 分 類 さ れ て い る.真 核 細 胞 で は, HSP100, 90, 70, 60,そ の 他 の 低 分 子 な ど の フ ァ ミ リー に 大 別 さ れ る.そ の 働 きは 多 岐 に わ た るが,い ず れ の フ ァ ミ リー も ス トレ ス に よ る 障 害 か ら の 防 御,さ ら に 正 常 な 生 理 的 条 件 下 に お い て も何 ら か の 細 胞 の 基 本 的 な 機 能 を果 た して い る と考 え られ て い る13).哺 乳 動 物 細 胞 に お い てHSP70 フ ァ ミ リー はHSC70(constitutive form), HSP70(inducible form), grp78, grp75の 少 な く と も4つ の メ ン バ ー か ら な っ て い る.そ の う ちHSP70はHeLa細 胞 に お い て は 構 成 的 に も 合 成 さ れp72(あ る い はhsp72)と も呼 ば れ る. こ のHSP70(構 成 型 お よ び 誘 導 型 を含 め て)の 細 胞 内 含 有 量,特 にp53な ど の 他 の 物 質 と結 合 し て い な い フ リー のHSP70量 が 最 もよ く温 熱 耐 性 と相 関 す る と考 え られ て い る6).そ の 詳 しい メ カ ニ ズ ム は 未 だ 解 明 さ れ て い な い が, HSP70は 加 温 に よ り変 性 した 蛋 白 質 の 疎 水 性 領 域 に 結 合 し,変 性 蛋 白質 ど う しが お 互 い の 疎 水 性 領 域 を 介 して 反 応 す る の を 抑 制 す る とい わ れ て い る14). 今 回 検 討 し たhsp72は,加 温 に よ り速 や か に 細 胞 質 か ら核 内 へ 移 動 を開 始 し, 43℃ で は2時 間 で 全 て の 細 胞 でhsp72の 核 内 集 束 が 観 察 さ れ た.こ の 時 点 で はhsp72は リ ボ ゾ ー ム の 周 辺 に 存 在 す る こ とが 電 顕 で 証 明 さ れ て い る8). hsp72 は 加 温 終 了 後4∼6時 間 で 再 び 核 内 よ り細 胞 質 へ 戻 り,受 け た 刺 激(温 熱)強 度 に 応 じて8∼10 時 間 を ピー ク と し て 細 胞 質 で の 誘 導 合 成 が 増 加 す る.こ のhsp72の 量 的 変 化 と 同 時 に 局 在 の 変 化 を 明 瞭 に 観 察 す る手 段 と し て,今 回 レー ザ ー サ イ ト メ ト リー, ACASを 使 用 しhsp72の 画 像 化 お よ び 数 量 的 解 析 を 試 み た. ACASで は1画 面 に 同 一 細 胞 内 の2つ の 蛍 光 色 素 に 標 識 され た
物 質 の表示 が可 能 で あ り, FITC, PE(phycoer
ythrin), Texas Red, PIな どに よ り標 識 され
た物 質 を重 ね て あ るい は並 列 して表 示 が可 能 で
あ る.そ の ため 核 をPIに
て染 色 し, hsp72を
FITC標
識 す る こ とに よ り,
hsp72が 核 よ り細 胞
質 へ,あ
るい は細 胞質 よ り核 へ 移 動 す る現 象 を
1画 面 に 表示 され た2つ の 画像 を比較 しなが ら
観 察す る こ とが 可 能 で あ った.ま た蛍光 強度 を
カ ラー テー ブ ル にて段 階 表 示 す る こ とに よ り,
一 目瞭然 にhsp72の
誘導 合 成 を観 察 す るこ とが
可 能 で あ った.通 常 の蛍 光 顕微 鏡 で観察 す る場
合,標 識 され た抗 原 の局 在 は あ る程 度 識別 で き
るが,詳 しい量 的 変化 ま では分 か ら ない のが 現
状 で あ る.し か し, ACASは
標 識 され た抗 原 の
局 在 と同時 に そ の量 的変 化 まで 同時 に観 察 可 能
であ る.特 にhsp72の
よ うに局 在 お よび発 現 量
の両 者 が変化 す る もの の観 察 で は特 に有益 と思
われ た.し か も通 常 の蛍 光 顕微 鏡 で は速や か に
写 真 に記 録 す る必 要 が あ り,ま た1度 写真 撮 影
す る と2度 と観 察 す るこ とが で きな い.し か し,
ACASで
は感 度 が 高 く,標 本 に照 射 す る レー ザ
ー 強 度 が非 常 に微 量 で も観 察
,測 定 が 可 能 な た
め,今 回検 討 した方 法 で は1回 の レー ザ ー照 射
で1%未
満 の蛍 光 量 の低 下 しか 認め られ ず,同
一 部位 の頻 回 の観 察 が可 能 であ っ た
.し か も高
感 度 の ため10日 後 の 染色 標 本 も十分 観 察 可 能 で
あ った.さ らに,得 られ た画像 をデ ィ ス クに保
存 す るこ とに よ り,い つ で も取 り出 して解析 が
で きた.今 回Western blotting法 との 比較 で,
ACASに
よ る細 胞1個 あ た りの平 均 蛍光 量 の 測
定 は,半 定 量解 析 の ため に極 め て 有用 で あ る こ
とが分 か っ た.た だ し, 1次 抗 体, FITC, PIの
濃度 お よび反 応 時間 の 設定 や 染 色 の均 一 性 を計
るこ とな どに熟練 を要 す こ と,あ るい は細 胞 を
ひ とつ ひ とつ分 離 して計 測す るた め に解 析 に 時
間が か か る こ とな どが 難 点 で あ った.
ACASで
は こ う した測 定 の他 に,カ ル シ ウム
濃 度 の測 定,及 び コー ンフ ォー カル シ ス テム を
併 用 した立体 構 造 の 解 明 な どその 応用 は 多岐 に
わ た る.天 神 らは コー ンフ ォー カル シ ス テム に
よ り抗 癌 剤 に よ る核 の立体 構 造 の 変化 を検 討 し
て い る14).今回 も核 あ るい は細 胞の 形態 変 化 を観
察 した が,抗 癌 剤 に よ る核 の ドー ナ ツ 型変 形,
巨 大 化 な ど が 観 察 で き た.詳 し く検 討 す れ ば ACASに よ る抗 癌 剤 の効 果 判 定 も可 能 で あ ろ う. HSPを 誘 導 す る ス トレ ス と して は 熱 刺 激 の ほ か に 呼 吸 障 害,重 金 属,ア ミ ノ酸 ア ナ ロ グ な ど の 薬 剤,細 菌 や ウ イ ル ス 感 染 な ど も挙 げ られ る13). 最 近Cioccaら は 乳 癌 細 胞 に お い て, hsp27の 増 量 とADM耐 性 が 一 部 相 関 す る と い う報 告 を し16),ま た 木 村 ら は 卵 巣 癌 摘 出 標 本 に お い て hsp60量 の 高 レベ ル な 症 例 で は 低 レベ ル な症 例 に 比 し, 5年 生 存 率 が 有 意 に 良 好 で あ っ た と し て い る11).ま た こ う し たHSPの 動 態 に つ い て は 単 に 量 的 問 題 だ け で な く, HSPの 細 胞 内 局 在 性 が 温 熱 感 受 性 の 重 要 な要 因 に な っ て い る こ とが わ か っ て き た8) 17) 18).例 え ば,渡 辺 ら は 熱 に 感 受 性 が 低 い 細 胞 で は 加 温 処 理 後 細 胞 質 か ら核 へ の hsp70の 移 動 が 観 察 さ れ る が,熱 感 受 性 の 高 い 細 胞 で はhsp70の 核 へ の 移 動 が 見 ら れ な い こ と を 報 告 して い る19).今 回 の 研 究 結 果 で は4種 類 の 作 用 機 序 の 異 な る抗 癌 剤 全 て に お い て 長 時 間 接 触 に よ るhsp72の 増 量 が み られ た.す な わ ち,こ れ ら の 抗 癌 剤 は ス トレ ス と して 細 胞 に 認 知 さ れ た と考 え る の が 妥 当 で あ ろ う.し か し,臨 床 的 に は 考 え られ な い 高 濃 度 で, 24か ら48時 間 と い う長 時 間 接 触 が 必 要 で あ っ た.同 時 にhsp72の 局 在 も検 討 した が,抗 癌 剤 に よ るhsp72の 核 へ の 移 動 は 全 くみ ら れ な か っ た.さ ら に 加 温 に よ るhsp72の 移 動 に も抗 癌 剤 添 加 は 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た.大 塚 ら もhsp72の 核 へ の 移 動 は加 熱 時 特 有 の 現 象 で あ っ た こ と を 報 告 して い る20).以 上 の こ と よ り細 胞 の ス ト レ ス 応 答 の メ カ ニ ズ ム は 加 温 と抗 癌 剤 添 加 を 含 む 他 の 刺 激 と で は 異 な っ て い る こ とが 推 察 さ れ る.今 回 はhsp72の 増 量 と 抗 癌 剤 耐 性 と の 関 係 を検 討 し て い な い が, Cioccaら16)の 言 う よ うに 抗 癌 剤 耐 性 に は 数 種 類 のHSPやp-glycoproteinな ど 多 くの 物 質 が 関 与 し て い る と 思 わ れ,今 後 と も さ ら に 多 くの 検 討 が 必 要 で あ る. 癌 治 療 の 臨 床 で は,放 射 線 と温 熱 の 有 効 性 が す で に 認 め ら れ,現 在 温 熱 と抗 癌 剤 の 併 用 治 療 が 多 施 設 で 行 わ れ て い る21).我 々 の 施 設 で も子 宮 頚 癌,卵 巣 癌,外 陰 癌 な ど に 二 者 併 用 療 法 な ら び に 放 射 線 を加 え た 三 者 併 用 療 法 を施 行 し,良 好 な 治 療 成 績 が 得 られ て い る22) 23) 24).今 回 の 検 討 はHSPの う ち のhsp72に つ い て の み の 検 討 で あ る の で,た だ ち に 臨 床 に 還 元 す る こ とは で き な い.し か し, ADMと 加 温 を併 用 す る こ とに よ りhsp72の 増 量 の 抑 制 が 強 く認 め られ た こ と に よ り,こ の 二 者 の 併 用 は 温 熱 耐 性 の 克 服 に 有 用 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た.ま た 今 後,組 織 切 片 に お け るhsp72や 他 のHSPを 今 回 用 い た 方 法 で 検 討 す る こ とに よ り温熱 耐 性,抗 癌 剤 耐 性 の 指 標 と す る こ と も 可 能 と考 え ら れ る. 結 論 hsp72の 加 温 及 び 抗 癌 剤 添 加 に お け る誘 導,局 在 な ど の 動 態 変 化 をHeLa細 胞 に お い て,レ ー ザ ー サ イ トメー ター, ACAS570を 用 い検 討 した. 1. hsp72は 細 胞 質 中 に 構 成 的 に 合 成 さ れ, 43℃ 2時 間 の 加 温 に よ り素 早 く核 内 に 移 行,加 温 終 了 後4∼6時 間 で 再 び 細 胞 質 へ 戻 っ た.ま た そ の 合 成 量 は 加 温 終 了 後8∼10時 間 で ピー ク と な っ た. 2. Western blottingに よ り測 定 し たhsp72 の 量 的 変 化 は, ACASに よ り測 定 し たhsp72の 量 的 変 化 と ほ ぼ 一 致 し た. 3.現 在 婦 人 科 領 域 で頻 用 され て い るCDDP, ADM, PEP, VP-16を 添 加 し た 細 胞 で は, 48時 間 の 接 触 で4種 類 全 て の 添 加 細 胞 に お いてhsp72 の 誘 導 合 成 が 認 め ら れ た.し か し, hsp72の 核 へ の 移 行 は 抗 癌 剤 に よ る影 響 を 受 け ず,加 温 時 特 有 の 現 象 と考 え られ た. 4. ACASで はhsp72の 細 胞 内 局 在 と 量 の 変 化 を 同 時 に しか も 明 瞭 に 観 察 す る こ とが 可 能 で, こ の よ う な 量 的 お よ び 局 在 の 変 化 を と も な う抗 原 を観 察 す る 方 法 と して 極 め て 有 用 と考 え ら れ た. 稿 を終 え るに あ た り,御 指 導,御 校 閲 を賜 りまし た岡 山 大 学 医 学 部 産 科 婦 人科 学教 室工 藤 尚文 教 授 に 深 甚 の意 を 表 す る と共 に 直 接 御 指 導 頂 いた早 瀬 良 二 講 師 に 深謝 致 し ます. (本文 の要 旨は 第31回 日本 癌 治 療 学 会 総 会 にお いて 発 表 した.)
レー ザ ー サ イ トメ ー ター に よ るhsp72の 動 態 検 討 409
文
献
1) Fujiwara K, Kohno I and Sekiba K: Therapeutic
effect of hyperthermia
combined with chemother
apy on vulvar and vaginal carcinoma.
Acta Med Okayama
(1987) 41, 55-62.
2) 小 橋 勇 二,澤 井 秀 秋,本 郷 淳 司,佐 能 孝,早 瀬 良 二,中 桐 善 康,工 藤 尚 文,関 場 香:進 行 子 宮 頚 癌 の 集
学 的 治 療-温 熱 併 用 治療-.産 科 と婦 人 科(1992) 59, 1356-1360.
3) 小 橋 勇 二,澤 井 秀 秋,関 場 香:婦 人科 悪 性 腫 瘍 に対 す る温 熱療 法 の併 用 療 法別 評 価. Biotherapy(1992)
6, 562-568.
4) 大 塚 健 三:正 常 お よ び腫 瘍 組 織 に お け る温 熱 耐 性.癌 の 臨 床(1986) 32, 1671-1677.
5) Li GC: Elevated levels of 70,000 dalton heat shock protein in transiently
thermotolerant
Chinese
hamster fibroblasts
and in their stable heat resistant variants.
Int J Radiat Oncol Biol Phys (1985)
11, 165-177.
6) 大 塚 健 三,林 康 司,山 根 光 雄,服 部 浩 朋:温 熱 耐 性 の生 物 学 的 お よび 生化 学 的 基礎.日 本 ハ イパ ー サ ー ミ
ア誌(1992) 8, 241-274.
7) Li GC, Li LG, Liu YK, Mak JY, Chen LL and Lee WM: Thermal response of rat fibroblasts stably
transfected
with the human 70-kDa heat shock protein-encoding
gene. Proc Natl Acad Sci USA
(1991) 88, 1681-1685.
8) Welch WJ and Suhan JP: Cellular and biochemical
events in mammalian
cells during and after
recovery from physiological
stress.
J Cell Biol (1986) 103, 2035-2052.
9) Pelham HR: Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated
proteins.
Cell (1986) 46, 959-961.
10) Deshaies RJ, Koch BD, Werner-Washburne
M, Craig EA and Schekman R: A subfamily of stress
proteins
facilitates
translocation
of secretory
and mitochondrial
precursor
polypeptides.
Nature
(1988) 332, 800-805.
11) Kimura E, Enns RE, Alcaraz JE, Arbolede J, Slamon DJ and Howell SB: Correlation
of the
survival of ovarian cancer patients with mRNA expression of the 60-kD heat-shock protein HSP-60.
J Clin Oncol (1993) 11, 891-898.
12) Laemmli UK: Cleavage of structual proteins during the assembly of the head of bacteriophage
T4.
Nature
(1970) 227, 680-685.
13) 吉 田 征 夫:熱 シ ョ ッ ク 蛋 白 質 フ ァ ミ リー.代 謝(1992) 29, 731-734.
14) Schlesinger MJ: Heat shock proteins.
J Biol Chem (1990) 265, 12111-12114.
15) 天 神 美 夫,杉 田 道 夫:癌 化 学 療 法 に 対 す る レ ー ザ ー 顕 微 鏡(Laser Scanning Microscopy, LSM)に よ る 細 胞 動 態. Oncology & Chemotherapy(1992) 8, 72-76.
16) Ciocca DR, Fuqua SA, Lock-Lim S, Toft DO, Welch WJ and McGuire WL: Response of human
breast cancer cells to heat shock and chemotherapeutic
drugs. Cancer Res (1992) 52, 3648-3654.
17) Velazquez
JM and Lindquist
S: hsp 70: Nuclear concentration
during environmental
stress and
cytoplasmic
storage during recovery.
Cell (1984) 36, 655-662.
18) Li GC and Werb Z: Correlation
between
synthesis of heat shock proteins
and development
of
thermotolerance
in Chinese hamster fibroblasts.
Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79, 3218-3222.
19) 渡 辺 正 己,鈴 木 啓 司:ヒ ト細 胞 の 温 熱 感 受 性 とHSP70の 誘 導.癌 の 臨 床(1989) 35, 1512-1516.
20) Ohtsuka K, Nakamura
H and Sato C: Intracellular
distribution
of 73,000 and 72,000 dalton heat
shock proteins in HeLa cells.
Int J Hyperthermia
(1986) 2, 267-275.
21) 松 田忠 義:わ が 国 のハ イパ ー サ ー ミア の現 況-臨 床 応 用 を中 心 に-.癌 と化 学 療 法(1993) 20, 567-573.
22) 関 場 香,小 橋 勇二,澤 井 秀 秋: QOLを 考 慮 し た婦 人 科 領 域 に お け る癌 温 熱 化 学 療 法.癌 治療 と宿 主(1992)
4, 59-63.
23) Sawai H, Hasegawa T and Kobashi Y: Clinical studies on combined hyperthermo-,
chemo- and
radiotherapy
for advanced uterine cervical cancer;
in Hyperthermic
Oncology in Japan '90, Sekiba
K eds, Asahi Print.
& Publ., Okayama
(1991) pp 149-150.
24) 関 場 香,小 橋 勇 二,長 谷 川 俊 水:婦 人 科 癌 の 温 熱 療 法-特 に 化 学 療 法 と の 併 用 効 果 に つ い て-. Oncology & Chemotherapy(1990) 6, 273-281.
レ ー ザ ー サ イ トメ ー ター に よ るhsp72の 動 態 検 討 411
図1 ACASで のhsp72の 半 定 量 法; (A)レー ザー 照 射 に て得 られ た初 期 画像.左 側 はFITC標 識 に てhsp72
を,右 側 はPI標 識 に て核 内DNAを 観 察 して い る. (B)共通 のthresholdを 設 定 しbackgroundを きれ
い にす る. (C)細胞 をひ とつ ひ とつ分 離 す る.そ の 後ACAS内 蔵 の 解 析 ソ フ トに て,細 胞 の蛍 光 量,面 積, 周 囲 長,形 態等 を計 測,数 量化 した.同 様 の 操 作 を4回 繰 り返 し,得 られ た デ ー ター よ り細 胞1個 あ た り の 平 均 蛍 光 量 を計 算 した. (D)これ を棒 グ ラ フ化 す る とほ ぼ正 規 分布 を示 し た. 図4 通 常 の 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 した, 43℃ 2時 間加 温 に よ るhsp72の 局 在 の 経 時 的 変 化; (A)加温 前,細 胞 質 の み 構 成 的 に 存在 す る. (B)加温 直 後,核 に集 束 し,一 部 顆 粒 状 に み え る. (C)加温 終 了4時 間後,徐 々 に 細 胞 質 へ 戻 る. (D)加温 終 了8時 間後,ほ ぼ完 全 に細 胞 質へ 戻 っ て い る.
図5 ACASで 観 察 した 加 温 前 のhsp72;左 側 は FITC標 識 に てhsp72を,右 側 はPI標 識 に て核 内DNAを 観 察 して い る.中 央 の カ ラー テー ブ ル の 下方 よ り上 方,つ ま り青 か ら赤 に 変 わ る程 蛍 光 強 度 が 高 い こ とを示 す. hsp72は 細 胞質 に の み構 成 的 に 存 在 す る. 図7 ACASで 観 察 したhsp72の 経 時 的変 化(43℃ 2時 間加 温 終 了8時 間 後); hsp72は ほぼ 完全 に細 胞 質へ 戻 っ て い る.し か も明 らか に 蛍 光 量 の増 加 が 認 め られ, hsp72の 増加 が うか が え る. 図6 ACASで 観 察 し たhsp72の 経 時 的 変 化(43℃ 2時 間 加 温 直 後); hsp72は 核 に 集 束 して い る. 図12 ACASで 観 察 し たCDDP(10μg/ml 48時 間) 添 加 後 のhsp72.
レー ザ ー サ イ ト メ ー タ ー に よ るhsp 72の 動 態 検 討 413
Kinetics of heat shock protein 72 in HeLa cells
after treatment
with heating and/or
anticancer
agents analyzed by a laser cytometer
Hideaki SAWAI
Department of Obstetrics and Gynecology,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. T. Kudoh)
Heat shock proteins (HSPs) are regarded as the proteins most related to the development of thermotolerance. Recently, not only their role in thermotolerance, but also their role in resistance to anticancer agents is gathering concern. In this study, the kinetics of hsp 72 in HeLa cells treated with heating and/or anticancer agents were studied. Hsp 72 was immuno stained by the indirect fluorescent technique using a monoclonal anti-hsp 72 antibody (Amer sham). The staining pattern was observed and analyzed using a laser cytometer, ACAS 570 (Meridian). Hsp 72 was normally found in the cytoplasm at 37•Ž and moved rapidly into the nucleus with heating at 43•Ž for 2 hours. It then returned to the cytoplasm 4 to 6 hours after heating. The hsp 72 content reached a peak at 8 hours after heating. Hsp 72 was induced in all cells treated with cisplatin, adriamycin, peplomycin, or etoposide for 48 hours. In the cells treated with both heating at 43•Ž for 2 hours and these anticancer agents, hsp 72 induction was most suppressed by adriamycin. However, translocation of hsp 72 to the nucleus was specific for heating and was not affected by the anticancer agents. By laser cytometry the intracellular localization of hsp 72 and the changes of its content were simultaneously detected. Moreover, the change pattern of hsp 72 content measured by laser cytometry coincided with that measured by the Western blotting procedure.
