ローヤルゼリーに含まれるインスリン様およびアンジオテンシン転換酵素阻害物質について

ローヤルゼ リーに含 まれ るイ ンス リン様

お よび ア ンジオテ ンシ ン転 換酵素 阻害物質 につ いて

奥 田 拓 道 , 亀 田 健 治 , 森 本 千 恵 , 松 浦 幸 永 , 近 木 麻 理 子 , 薄 明 ローヤルゼ リー (以下

R

Jと略す)は, ミツ バチの働 き蜂の下咽頭腺か ら分泌 される乳白色 のクリーム様物質であり,女王蜂の幼虫のため の餌であ る.

R

Jを餌 として成長 した女王蜂 は,同 じ雌である働 き蜂 に比べて数十倍 も寿命 は長 く,体 は

3

倍 も大 きく,最盛期には

1

日に 2000個以上 も産卵 し,その産卵期間 も一年 の うち2月か ら 11月まで という精力的な活動を 続 ける. このような事実 に基づ き, RJの中に ヒトの健康増進や病気の治療に役立っ機能物質 が存在する可能性を求めて多 くの研究が行われ てきた.すでに, RJにはタンパ ク質,炭水化 物,脂質, ミネラル, ビタミン等が含 まれてい ることが知 られている. 私たちは薬用人参をは じめ,種々の天然物か ら生理活性 を目安 に機能物質 を単離 している (Takakueta1.,1990).まず試験管内で測定 で きる生理作用を用 いて,天然物中の機能物質 の構造を明 らかに し,次 に動物実験を行い,最 後 にヒトでの意義を明 らかにするという順序で ある.

R

Jに関 し,私が採用 した試験管内の生理作 用は,イ ンス リン様作用 とアンジオテンシン転 換酵素

(

ACE

と略す)の阻害作用である.イ ンス リンは,その標的細胞の一つである脂肪細 胞で, グルコースか らの脂肪合成を促進す ると 共に,カテコールア ミンによる脂肪分解を抑制 する (Rahneta1.,1994). したがって,試験 管内でのイ ンス リン様作用 とは,脂肪細胞での 脂肪の合成促進 と分解抑制である.ACEは血 管を収縮 し,血圧を上昇 させるアンジオテ ンシ ンⅠⅠを生成 し,血管を拡張 し,血圧を下げるキ ニンを分解する酵素であ り,その阻害は血圧低 下 に連なることが知 られている. インス リン様作用 とACE阻害を取 り上げた 理由は,糖尿病や高血圧の患者の臨床症状がR Jによって改善 したという報告 に注 目したか ら である (水野,1975;高須 ･太田,1975).

Ⅰ

.

実験材料および方法

1

. ローヤルゼ リー (RJ)

R

Jは,全国 ローヤルゼ リー公正取引協議会 より提供を受けた.

R

Jを水に溶解 した後,水 に対 して一昼夜透析 し,透析外液を以後の実験 に供 した.

2.

脂肪細胞 の調製 WistarKing系雄性 ラット (体重150-200 g) を用 い, その副費丸脂肪組織か らRodbell (1964)の方法で脂肪細胞を調製 した.

3.

脂 肪分解 の測定 2.5%牛血清アルブ ミン (活性炭で処理 し,脂 肪 酸 を除 い た もの)を含 む緩 衝 液 (25mM TES,pH7.4, 135mM NaCl,5mM KCl, 1 mM MgC12)200FLlに検体溶液 25FLl,エピネ フリン溶液25/上1(最終濃度0.5/上g/ml) に脂 肪細胞50〟1(packedvolume)を加え

3

7

℃, 1時間 incubateL,遊離す る脂肪酸 を定量す

る (Okudaeta1.,1986).

4.

脂 肪合成 の測 定

6%牛血清 アルブ ミンと 3mM グルコースを 含むHanksbuffer(pH7.4)175〃1に脂肪細胞 40〟1(packedvolume)を加え 37℃,20分放 置する.次に,検体溶液25〟1を加え

3

7

℃,5 分irlCubateする.インス リン溶液 25〟1(最終 濃度1nM)を加え, さらに

3

7

℃,5分

10 (210nm) 蔓柚 過 脂 肪 分 解

阻

害

活 性 仲 0 5 5 2 nU FH)F(ZI Tlme(min) 図1 ローヤルゼ リーの HPLC分画の脂肪分解阻害活性

カ ラム :AM-312S-5120A ODS (YMC)溶離液

A:0.1%TFA in30%CH3CN B:0.1%TFA in70%CH3CN

グラジュェント･A (0-5min) A-B(5-35min)

流速 1ml/mln 検出 :210nm

放 置す る.最後 に14C-グル コース 25〟1(0.25

〟Ci)を加 え 37℃,30分 incubateL,EM 液

(イ ソプ ロ ピル アル コー ル2400m1,ヘ プ タ ン 600m1,1N H2SO460mlの混液)0.83m1,ヘ プ タ ン0.5ml,水0.25mlを加 え反 応 を止 め る. 遠心分離後上清 を取 り, トル エ ンシ ンチ レー タ ーを加 えて放射能 を測定 す る.活性 は,脂肪 に 取 り込 まれた放射能 (cpm)で表す.

5.

ア ンジオテ ンシ ン転換酵素 の測定

2.5mM Hippury卜 His-Leuを基質 と して用

い,Takadaetal.(1982)の方 法で測定 した. 阻害活性 はパ ーセ ン トで表示 した.

6.

統計処理 Student's t-testを用 い, 有意差検定 を行 っ た.

Ⅱ.

実験結果

RJ

の水 溶 液 を水 に対 して透 析 した外 液 を Sep-Pak(C18前処理用逆相 カ ラム,ウォー ター ズ製)で処理 し,その吸着画分 を30%アセ トニ トリルに溶解 し,図 1に示す よ うな条件 で分画 した.210nm の吸光度 で検 出 し, 溶 出画分 を 凍結乾燥 した後,脂肪分 解測定用緩衝液 に溶解 して エ ピネ フ リンの脂肪分解 に対す る阻害活性

0

10 20 30 40 Tlm e(m ln) 図 2 ローヤルゼ リーに含まれる脂肪分解阻害活性物質の精製

カ ラ ム:AM-312 S-5 120A ODS (YMC)

溶離液:0,1% TFA ln30% CH3CN

(1)とF (2)の画分 に認 め られ るが,F(2)の 方 がF(1)に比 べて はるかに高 い阻害活性 を示 している.そ こでF (2)につ いて,さ らに精製 を進 め ることに した. 図2は,F (2)を同 じカラムを用 い,0.1%

TFA

を含む30%

CH

3

CN

で溶出 したパ ター ン を示 して い る.脂 肪 分解 阻害 活 性 は,図 のF (A),F (B),F (C)の画分 に存在 し,他 の画 分 には認 め られなか ったので, まずF (A),F (B),F (C)の構造 を明 らか に した上 で,生理 活性 につ いて検討す ることに した. それぞれの 画分 を再 クロマ トした後,重水素化 メタノール に溶解 し,

IH-

NMR

お よび13

C-

NMR

で それぞ れの化学構造 を決定 した.

F(

A)

ぱ 3

C-

NMR

スペク トル (完全 デカ ッ プ リング) よ り10本 の炭素 が確認 された. ま た, カルボキ シル基 の炭素,一組 の二重結合の 炭素,水酸基 の付 け根 の炭素 が認 め られ ること か ら,水酸基 を持 っ炭素数10の不飽和脂肪髄 と考 え られ る. さ らに

l

H-

NMR

スペ ク トルに おいて,二重結合 の水素 のカ ップ リングパ ター ンは,二重結合が カルボキシル基 に隣接 し, ト ランス結合 していることを示 している. また, 水酸基 の付 け根 の水素 はメチル基 であ り,末端 の メチル基 とカ ップ リング している.以上 の結 果 か ら, こ の 物 質 は trans-9-hydroxy- 2-decenoicacidと推定 され る, また

,F(

B)

は13

C-

NMR

か ら

8

本 の炭素が 確認 された. カルボキ シル基 の炭素 と一組 の二 重結合 の炭素が認 め られ るが,F (A)とは異 な り,水酸基 の付 け根 の炭素 は認 め られない. し たが って,水酸基 を もたない炭素数8の不飽和 脂肪酸 と考 え られ る.さ らに,

1H-

NMR

スペ ク トルか ら二重結合の水素 のカ ップ リングパ ター ンがF(A)に類似 していることか ら,二重結合 はカルボキ シル基 に隣接 し, トラ ンス結合 して いるもの と考 え られた. 以上 の結果か ら,F (B)はtrans-2-0ctenoic acidと推定 された. F (C)につ いて は同様 の検索 を経 て,trans

-10-hydroxy-decenoicacidと推定 された.

l l

cN

'

,

C

へ cH; CHi｡H

,

2

C

H

i

｡

6

2

C

㌔ /cooH

_J

F(

A)

C

.o

H

.

P

3 H trans-9-hydroxy-2-decenoicacid

H l ｡H',C"i｡HlC"

(

｡Hic

㌔

/coon I H

F

(

B

)

C

8

H

.

.

02

trans-2-0ctenoICacid

H

I

"oiH芦 ｡H;Cや",2"<ct2C㌔

_l

/C… F(C)

C1

0

H

1

8

03

H

trans-10-hydroxy-2-decenoicacid (HDA)

図 3 ローヤルゼリ-に含まれる脂肪酸

図

3

は

,F(

A)

,F(

B)

,F(

C)

の化学構造 を

示 した ものである.

図4は trans-9-hydroxy-2-decenoic acid

が, 50/Jg/mlの濃度でエ ピネフ リンによる脂 肪分解 を阻害す ることを示 した成績である. こ の物質 につ いて,脂肪細胞 にお けるグル コース か らの脂肪合成 につ いて検討 したが,サ ンプル 量が少 な く,一定 の結論 を得 るには至 らなか っ た.trans-2-0ctenoicacidには脂肪分解 を阻害 す る作用 は認 め られなか ったが, グル コースか らの脂肪合成 を促進 す る効果がイ ンス リン存在

下,および非存在下でみ られた (図 5).trans

-10-hydroxy-2-decenoic acidは, 脂肪細胞 に おけるエ ピネフ リンによる脂肪分解 を阻害す る とともに, グルコースか らの脂肪合成 を促進す る (図6,7).ACEにつ いては,trams-2-oct -enoic acid と trans-10-hydroxy-2-decenoic

acidが共 に阻害作用 を示 したが (図 8),trans

-9-hydroxy-2-decenoicacidにつ いて はサ ン プル量 が少 な く,検索 す る ことはで きなか っ た.

12 00 50 1 lO

J

t

u

O

3 % (刀ntrOl 50 (Ug/ml) 図4 trans-9-hydroxy-2-decenoicacidの脂肪細胞 におけるア ドレナリンによる脂肪分解に対す る作用

Ⅲ.

考察

脂肪細胞 における脂肪 の分解阻害 と合成促進 とい うイ ンス リン作用 を指標 に して

,RJ

中の イ ンス リン様物質 を検索 した.その結果, イ ン ス リン様物質 の候補 として,tram s-9-hydr

oxy-2-decenoicacid,trams-2-0ctenoicacid,およ びtrans-10-hydroxy-2-decenoicacidの 3物 質が突 き止め られ, その化学構造が明 らかにさ れたのである.

trans-9-hydroxy-2-decenoic acidとtrans -10-hydroxy-2-decenoicacidは共 にエ ピネ フ

リンによる脂肪分解 を抑制す る点で,trams- 2-0ctenoicacidと trans-10-hydroxy-2-dece no-icacidはグル コースか らの脂肪合成 を促進 す

る点で, イ ンス リンと同 じ様 な作用を持 ってい る の で あ る.す で に,trams-10-hydroxy- 2-decenoicacidについて は抗菌作用 (Blum et a1.,1959)や抗腫癌作用 (Townsendeta1., 1960)が報告 されているが,今回イ ンス リン様 作用 も併せ持っ ことが明 らかにな ったわけであ る. イ ンス リンが脂肪細胞 におけるグルコースか らの脂肪合成 を促進す ることはよ く知 られてい るが, エ ピネフ リン等の脂肪分解 ホルモ ンの働 0 0

0

0 0 0 0

0

0 8 6 4 2 ( ∈ d p ･ o ) 唱 和 寒 空 : I

-

L

,

d

F

- - 一

一

一

一

′

1 0 25 50 75 100 125 (Llg/mI) 図5 trans-2-0ctenoicacidの脂肪細胞におけるグ ルコースからの脂肪合成に対する作用 (○)Insulin(-)(●)insulin

(

+)

+ P<0.01 さを阻害す るという作用 の生理的意義 について は余 り知 られていない. イ ンス リン作用の低下 した糖尿病では,相対的 にイ ンス リンに対抗す るホルモ ン (ノルエ ピネフ リン,エ ピネフ リン,

ACTH

等) の作用が強 くな り,脂肪細胞での 脂肪分解 が高 ま り,血液遊離脂肪酸 が増加 す る. この遊離脂肪酸が,筋肉等でのグル コース の利用を阻害 して,糖尿病 の病態をさらに悪化 させ る主 要 な原 因 に な って い る の で あ る (Ran°leeta1., 1963). さらに上昇 した血液 遊離脂肪酸 は肝臓で コレステロールや脂肪 にな り, リポタンパ ク (VLDL) として血液 に分泌 され,高脂血症を もた らし動脈硬化の誘因 とな る. このよ うに,脂肪細胞 における脂肪分解 を 抑制す ることは,糖尿病 の進展 を止め,毒脂血 症や動脈硬化の予防に連 なることになるのであ る. ア ンジオテ ンシン転換酵素 (ACE)は,血 管内皮細胞か ら血液中に分泌 され, ア ンジオテ ンシンⅠに作用 して,ア ンジオテンシンⅠⅠを生 成す る酵素である.アンジオテ ンシンⅠⅠは細動 脈を収縮 して,血圧 を上昇 させ る. さらに

AC

E

は,血管を拡張す るキニ ンを分解す る. した が って

,ACE

は血圧上昇物質 を生成 し,血圧 下降物質を分解す ることを通 じて,血圧 を上 げ る働 きをす る酵素 なのである.食塩 を取 り過 ぎ

5 () 工 ＼ S ニa U P a q U t! d 一 u J J b 山 77 V J ｣ ) 生 糸 毒 血 F

図6 trans-10-hydroxy-2-decenoicacid(HDA)の 脂肪細胞におけるア ドレナリンによる脂肪分 解に対する作用 ると血圧 が上昇 す ることはよ く知 られてい る が,最近私たちは,食塩 中の塩素がACEを活 性化す ることで血圧の上昇 を もた らす ことを明 らかに した (Kato, 1994).また, ACEの阻 害す るカプ トプ リルは,高血圧 の治療 に広 く用 い られている.

今 回 の 実 験 で,trams-2-0ctenoicacidと

trams-10-hydroxy-2-decenoic acidが ACEを 阻害す ることが明 らかにな ったが, この実験結 果を直ちに ヒ トの血圧低下 に結 びっけることは で きない. あ くまで試験管内での成績 なので, 今後, 動物 を用 いたin vivoの実験で確かめる 必要がある. イ ンス リン様物質 につ いて も同 じことがいえ るわけであり,今後,invivoへ と研究を進める 必要がある.イ ンス リン様物質の探索 には しば しば動物の血糖低下が指標 として用 い られてい るが, これを目安 に した場合,化学構造の決定 はほぼ不可能 ともいえるほど難 しくなる.理 由 は,生体 ホメオスターシスの中で種 々の因子 に よって厳重 に制御 されている血糖 を低下 させる には,大量 の試料が必要 な こと,および精製が 進むにつれ,生体内での分解が容易 に起 こるよ うにな り,活性が消失す る等 の現象が しば しば み られることである.そ こで,種々の問題 はあ るに して も, まず試験管内の指標 を用 いて機能 0 5 0 5 2 1 1 ( u J d

u

o o L X ) 唱 和 毒 些 J ノ

0

25 50 75 100 125 (LAg/ml)

図7 trans-10-hydroxy-2-decenoicacid(HDA)の 脂肪細胞におけるグルコースからの脂肪合成 に対する作用 (▲)insulin 1nM ' P<0.01. **P<0.05 ( % ) 埜 巾 仙仰 望 享o::

.

胤 (Ug/反応液) o 0 0 O ∩︺ 5 4 3 2 1 ( % ) 世 頒 伽 畠 trans-2-0ctenoic acid 500 250 125 (ug/反応液)

図8 trans-10-hydroxy-2-decenoIC acid(HDA) のアンジオテンシンⅠ転換酵素に対する阻害 作用

14 物質 の化学構造 を決定 し,それ に基 づ いて動 物, さらには, ヒ トへ と検索を進 めてい く手法 を とっている次第である. したが って,今回の実験 における

RJ

か らの イ ンス リン様物質 とA CE阻害物質の発見 は, 糖尿病や高血圧の予防や治療 に連 なる可能性を 持っ ものと考えるのが妥 当 と思われる. (〒79ト0295 温泉郡重信町志津川 愛媛大学 医学部医化学第二) 引用文献

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Ehime,791-0295Japan.

RoyalJelly wasfound to contaln insuli n-1ike substances wlth lnhiblt CateCholamine -1nducedllpOlysisandstimulatelipogenesisfrom glucosein ratadlpOCyteS.Theinsulln-likes ub-stanceswereidentifiedtobetrams-9-hydroxy- 2-decenoICaCld,trams-2-0ctenoicacid and trans -10-hydroxy-2-decenoicacidinroyaljelly.I nad-dition to insulin-like activity, traロs-2-0ctenoic acld and trams-10-hydroxy-2-decenoicacid pos -sessan inhibitoryactivity towardangiotensi n-convertingenzyme.

Theseexperimentalresultssuggestthatpaレ hologicalstatesofdiabetesmellitusandhyper -tension may be improved by fatty acids in royalJelly.