第1章 微生物バイオテクノロジーの発展状況 遺伝子組換え
技術
誌名
食品微生物バイオテクノロジー
巻/号
19号
掲載ページ
p. 2-73
発行年月
1993年3月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波事務所1.遺伝子組換え技術
(1)細菌1
)大腸菌 遺伝子組換え技術とは特定の遺伝子の構造と機能の関係を分子レベルで理 解し，これを人為的に改変することにより基礎と各種の応用的発展を探求する学 問Jと定義できるのではあるまドか。この技術は1973年のCohenとBoyerによ る組換えプラスミドの増殖実験の成功にその端を発しているが，その後生命科学 の各方面に爆発的に利用応用され，様々な革新的成果を生み出してきた。これは， それまでの長い生化学，徴生物学，遺伝学の分野の研究蓄積と急速に発展した分 子生物学の華々しい成果とに深く依存している。遺伝子組換え技術は，生物の 「種」の壁を越えて遺伝子を容易にかっ任意に組換えることができる点がその特 色の一つであり，またこれだけの発展をとげた理由の一つにもなっている。 今日，最も基本的でかっ高度に洗練された実験系として大腸菌K-12株を用 いた系が挙げられる。この菌株は，その使用目的に応じて様々な変異を持つ株に 改変されているが，ここで、はこれら宿主の特徴については述べない。目的とす る遺伝子のクローニング，発現並びに構造解析など，その用途に応じて自由に宿 主ベクタ一系を選択することが大切なポイントのーっとなる。ベクターに要求さ れる基本的な性質として，(1)目的とする外来性遺伝子と試験管内で組換え体 (recombinant DNA)を作ることができる， (2痛主細胞内で増殖できる能力を 持ち，宿主から脱落しない， (3)宿卦田胞へのベクターまたlま組換え体の導入が効 率的にできるへ(
4
粗換え体DNA
を持つ細胞を培養条件を変える事により第一 次的にスクリーニングができる，などが挙げられる。これらの条件に合致する使 い易いベクターが多数開発されている。大腸菌ベクターは，大きく 3つに分類で きる。一つは，プラスミド系ベクターの複製に利用されているコリシンE1因子 である。ファージベクターとしてAファージの誘導体が利用され，ファージの コートタンパク質からファージ粒子を効率良く形成できる系10)(in uitroパッ ケージング)のため，すぐれたクローニング効率を持っている。さらにプラスミ ドとして扱えながら，クローニングの効率はファージベクター並みであるコスミ ド系ベクターもあり，目的に応じて使う必要がある。また，ベクターの使用目的-2-により，プロモーター検索用ベクター2・3. 4・6. 11・18)，c DNAクローニング用ベ
クターし此山，発現ベクター5・7・8・比 15・16. 17)など枚挙にいとまのない程の各
種ベクターが開発されている。
(食品総合研究所深津親房)
文 献
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-4-2)枯草菌 枯草菌は，もともとアミラーゼを始めとして，食品産業において重要な酵素を 菌体外に分泌する菌として知られている。更に，枯草菌と同じ属の好熱性細菌 Bacillus stearothermophilusや好アルカリ性ノfチルス属細菌が，耐熱性酵素 や耐アルカリ性酵素など産業上重要な酵素を生産することが明らかとなり，これ ら酵素をできるだけ多く生産する技術として遺伝子組換え技術は注目されている。 また，枯草菌の優れた分担、能力と遺伝子組換え技術を組み合わせて，別の生物由 来の酵素を多量に菌体外に分泌させる手法も開発された。 枯草菌とは，B. subtilisのことであるが，ここでは，それ以外のBacillus属 細菌にも言及する。 なお，枯草菌の遺伝子組換え実験の詳細については，実験書などを参照して戴 きfこし、17.34.37.51.64. 95. 99)
。
(a)宿主 宿主としては，B. subtilisの中でも， M訂 burg168株が主に用いられる。この 菌株は形質転換能叩を有しており，それを利用することにより枯草菌の遺伝子 の解析が容易になった。現在，この株は枯草菌遺伝学の標準株となっている。ま た，この菌株の染色体の物理地図も作製されている29)。 枯草菌を宿主として用いる場合に問題となるのは，枯草菌が分泌するプロテ アーゼにより，発現され菌体外に分泌された産物が分解を受けることである。分 泌される主なプロテアーゼは，中性プロテアーゼと，アルカリプロテアーゼであ るズブチリシンである。発現された蛋白質を分解されないようにするために，そ れらプロテアーゼ、を欠損した株が作製されIι机 36) 宿主ーベクター系の構築 に利用されたm。それでも，分泌された蛋白質は時間と共に分解を受けること が示され，更には，菌体内セリンプロテアーゼ欠損をも導入した株，即ちプロテ アーゼの3重欠損株が作られた5引。 プロテアーゼ遺伝子の欠損変異株を作製することにより，より良い宿主を構築 するというアプローチとは別に，自然界から蛋白質分泌量は多いが，プロテアー ゼ、は分泌しない株をスクリーニングし，それを宿主として利用することが検討さ れた。この条件に適合する菌株として，B. brevis HPD31が発見された30・76)。-5-この菌株をB.stearothermophilus由来の αーアミラーゼ遺伝子が挿入された プラスミドで形質転換したところ，多量のアミラーゼが分泌され， しかも長期間 の培養でも分解を受けなかった7引。他にも，この菌を用いて豚ペプシノーゲ ン79)やヒトの成長因子g引の生産が行われた。これらのことから，B. breuis HPD 31は，蛋白質分泌系において，優れた宿主になりうることが明らかとなった。 枯草菌は制限系を持っている杭その欠損変異株も分離された。この変異株と， 野生株を用いてショットガンクローニングの効率が比較検討された。欠損株を用 いた場合には，クローニンク守は安定に行われるが，野生株では，ほとんどクロー ニングは不可能であった21>。更に修飾系をも欠損した株としては， R M 12584) がよく知られている。そのRMl2 5に胞子欠損やDーアラニン要求性を導入す ることにより，自然界での死滅速度の早い，より安全な宿主が作られた9
ヘ
(b)ベクター 枯草菌Marburg株にはプラスミドは存在しないが，枯草菌と同じグラム陽性 菌である庇α:phylococcusαureusに存在している薬剤耐性プラスミドが枯草菌 に導入可能であることが見いだされて，これが枯草菌ベクターとして利用されて きた。特に，カナマイシン耐性遺伝子を持つpU B 1 1 020)がクローニングに よく用いられている。その後，枯草菌のMarburg株以外の株や納豆菌22・82.86) でプラスミドの存在が報告閲されてきており，それらはベクター構築に利用す ることができる81>。そのうちの一つ， p T A 1 0 6 07)は安定性に優れ，ベク ターとして利用できる。 現在，遺伝子操作全てを枯草菌だけで行うことはできず，大腸菌で築き上げられ た技術に依存せざるを得ない状況にある。そこで，大腸菌と枯草菌いずれでも複製 可能なベクター即ちシャトルベクターが開発された19・8 3 ) O p H Y 300PLK28) は，市販品が入手できるので便利である。他にもB.megαteriumでも安定な p A C 353に遺伝子発現の誘導が可能なベクター 48) ルシフエラーゼ遺伝子を 持つもの33)好熱性レプリコンを有し，宿主域の広いもの12)などが作られた。 大腸菌以外とのシャトルベクターとしては，ラン色細菌Anaりstisnidulansと のシャトルベクターpMG20216 )が，枯草菌ベクターとA.nidulansの内在 性プラスミドから構築された。-6-産業的に重要なものは，分泌ベクターと呼ばれるベクター叩である。これは枯 草菌の分泌蛋白質遺伝子のシグナルOIJの下流に適当なクローニングサイトを持 つものである。分泌ベクターを用いて，耐熱性アミラーゼ刊， ヒトすい臓エラ スターゼ叩やヒト心房性ナトリウム利尿因子88)などの発現が行われた。 他にも，シグナル配列検索用のベクター71)融合蛋白質作製用ベクターシリー ズへ枯草菌ファージを利用したベクター系36，51)などが開発されている。 (c)ベクター・プラスミドの安定性 ベクターを利用して蛋白質を発現させる時，その構築されたプラスミドの菌体 内での安定性が問題となる。プラスミドは培養の過程で脱落し，またプラスミド 上の多くの部位で欠損が生じる68)。これら不安定性のメカニズムの解明とその 防止策は以前より研究が進められてきた。 プラスミドの脱落の動力学的解析により，例えば
pYS137
の脱落速度は細 胞・世代当り， 1 0-9程度と見積られている7ヘ最近，このような菌体からの プラスミドの脱落の直接の原因は，線状プラスミドが多量生成するためではない かと推測されている47)。 プラスミド、の欠損についてpUB 1 1 0を用いた実験では，挿入DNAの大き さと位置によって安定性が変化することから，プラスミドの安定性に関わる領域 の存在が明かとなったU。一方他のプラスミドを用いた実験では，プラスミドの 欠失にDNAトポイソメラーゼが関与することが示唆された61l。欠失は，培養 条件によっても影響を受ける。例えば， αーアミラーゼプラスミドの場合，抗生 物質非存在下での培養でプラスミドに欠失変異が見いだされた28)。また，組換 えプラスミドpCED3
の欠失は，増殖の悪い培地を用いることで防止が可能で あった69)。 培養条件によって，ある程度まで欠失を防ぐことができるが，更に安定性に関 わる変異を分離することにより，プラスミドの安定化を図ることが試みられてい る。プラスミドを安定に保持する菌株については，選択的ケモスタット培養法を 用いて分離された問。また，安定に保持されるプラスミドの変異に関しては， pUBIIOの低コピー数変異がプラスミドの安定性を高めることが明らかとなっ た4ヘこれらの知見を統合して，安定な宿主ーベクター系の開発が待たれる。-7-(d)プラスミドの導入方法 B. subtilis
M
a
r
b
u
r
g
株は，ある培養条件下で増殖すると，菌体外のDNA
を 取り込む能力が発現され，形質転換が可能となる4・5.叩。この性質を利用して， プラスミドを菌体内に取り込ませることが可能である。但しこの方法は，M
a
r
b
u
r
g
株だけにしか適用で、きない。他の菌株については，取り込みの効率が 悪いか，または全く起こらない。ほとんどの菌株に適用できるプラスミドDNA
の導入方法は，プロトプラスト形質転換法9)である。この方法では，菌体を一度 プロトプラスト化した後に，ポリエチレングリコールと，プラスミドDNA
を混 合することにより，プラスミドを菌体内に取り込ませる。しばらく培養して，プ ラスミド上の薬剤耐性マーカーを発現させた後に，薬剤を含む再生培地で培養す る。 また，枯草菌以外で，よく遺伝子組換え実験に用いられているB.breuisの形 質転換には， Tr i s-PEG法78)が開発されている。 他には，電気パルスにより，DNA
を細胞内に取り込ませる技術(エレクトロ ポレーション)が確立印しており，枯草菌にも適用された6.43・77. 86)。この方 法は，プロトプラストのみならず，生細胞に対しても利用できる43)。形質転換 効率はプロトプラストを用いた方が良いが，生細胞を用いた場合には操作が非常 に簡便になり，結果を得るまでの時間も短縮できるという利点がある。エレクト ロポレーションは専用の機械(市販品が入手できる〉が必要であるが，操作が簡 単であり，また応用の範囲も広いことから，ますます利用されていくものと思わ れる。 (e)クローニングと発現 Bαcillus属細菌は多くの有用な酵素を菌体外に分泌しており，それらの酵素の 遺伝子はクローニングされ，そして塩基配列が決定された。さらに，いくつかの ものについては応用研究も進められており，特に， α アミラーゼについては， 産業樹莫での生産の研究が行われている87>。 食品に関係のある酵素遺伝子のクローニングは， αーアミラーゼ (B.subtilis 13.80) B. natto96) ， B. licheniformis4 D， B. stearothermophilusl.72・97) B.coαgulansll) ， B. meg，αterium52))，マル卜ヘキサオース生成アミラーゼ(好-8-アルカリ性BαcilluS39 ))，プロテアーゼ(好アルカリ性BαcilluS32))，サイクロ デキストリン合成酵素(好アルカリ性Bacillus38 ))，サイクロデキストリングルカ ノトランスフエラーゼ(B.steαrothermophilus65 ) ， B. mαcerα，ns阿 ))，レパ ナーゼ、 (B.subtilis50・66)，) βーガラクトシダーゼ (B.steαrothermophilus 25))，グルカナーゼ(B.subtilis44• 63)， B.αmyloliquefiαciens26) ，B. circulαns 92))，セルラーゼ(B.subtilis55) )，グルコシダーゼ(好アルカリ性BαcilluS94)，) マンナナーゼ (Bαcillus属細菌2))など、について報告されている。 食品に関する酵素そのものではないが，枯草菌中にはプロテアーゼ、とレバンス クラーゼの分泌を促進する蛋白質が見いfごされており，その遺伝子はクローニン グされ，塩基配列が決定されている刷。 B.licheniformisでも，菌体外プロテ アーゼの分泌を促進する遺伝子の構造解析が行われた90。これらの遺伝子を宿 主ーベクター系と組み合わせると，パワフルな蛋白質発現系を構築できる可能性 がある。 また，外来遺伝子を相同組換えを利用して染色体上に組込むことも可能である。 B.αmyloliquefaciensのαーアミラーゼ遺伝子を，枯草菌ゲノムに多重に組込 むことにより，アミラーゼ、の生産を8倍に増加させることができた30。 枯草菌への外来遺伝子の導入とその発現も行われており，多糖の脱分枝酵素
(
ο
Th恥e伊rmo叩αn叩αerめobiω
um斤mηlbケro伺c版kii10つ)，エンドセルラーゼ(The) rmomono甲orafusca18) )，耐熱性セルラーゼ(Clostridiumthermocellum 73))，αーガラクトシダ ーゼ、(マメ科植物Cyαmopsistetragonolo何 回 ))，ヒトすい臓エラスターゼill58) などが導入された。 逆に，Bα，cillus属細菌の遺伝子を他の菌種で発現させることも行われている。 遺伝子クローニンク、、の過程において，大腸菌での発現を調べている例がほとんどで， β-1，4，ーエンドグルカナーゼ45. 49) グルカナーゼCB.αmyloliquefiαciens24)，) 中性プロテアーゼ89) レパナーゼ、66・67にマルサヘキサオース生成アミラー ゼ船， αーアミラーゼ75) マンナナーゼ (Bαcillus属細菌2))，グルコシダー ゼ山，サイクロデキストリングルカノトランスフエラーゼ(好アルカリ性Bαcil lus40) )，サイクロデキストリン合成酵素(好アルカリ性Bacillus38 ))などが検 討された。大腸菌以外では，キシラナーゼ (B.pumilus60 )) とαーアミラーゼ (B.αmyゐliquefiαciens42つを酵母に， β-1，4，-エンドグルカナーゼ98)を
-9-Zymomonasαnaerobiαに導入し，その発現が調べられた。
(食品総合研究所永井利郎)
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使用し大腸菌や枯草菌などの技術の進んだ宿主でのDNA複製開始領域を含む フラグメントを連結したシャトルベクターが一般的である。また，食品微生物用 のベクターに改良する目的で，薬剤耐性遺伝子を用いず，代わりにラクトースや キシロース資化能，チミン要求性，Lαctococcus属細菌の生産するペプチド性 抗菌物質ナイシンの耐性なと、を選択マーカーとして利用することも考えられてい る80・84・85)
。
接合伝達能を持つプラスミド、pAMβ1は， Enterococcus faecalis由来のエ リスロマイシン耐性遺伝子をもっ広宿主域伝達プラスミドで，自身の接合伝達の 他伝達能のない他のプラスミドや染色体の遺伝子の伝達も行うことが知られて いるが ，Streptococcus， Lαctococcus， Leuconostoc， Staphylococcus， Bαcillus， Lαctobαcillus， Clostridium属の細菌に接合により導入され109) エ リスロマイシン耐性遺伝子を発現することから， pAMβ1の複製開始領域を持 つベクターとしてpIL252，pIL253が開発されている叫。 Streptococcus属の中では，S. mutαns， S. pneumoniae， S. sanguis等の菌株でコンピテント細胞 による形質転換が知られているが，これらの菌株と大腸菌の閣のシャトルベク ターとして開発されたpSA3は21にやはりS.agαlactiae由来の広宿主域伝達プ ラスミド、pIP50lから接合能力を欠失させたpGB30lと大腸菌用クローニングベ クターpACYC184の組換えプラスミドでpVA838と同じく7目 附，Lαctococcus 属やLαctobαcillus属の菌株の一部で、複製可能で薬剤耐性遺伝子を発現できる。 しかしベクターによっては同じ種属に分類される菌株でも使用不可能な場合が あるので注意しなければならない。 一方，Staphylococcus属やBacillus属由来の薬剤耐性遺伝子がL.lαctisで発 現し，L. lactisの遺伝子は大腸菌や枯草菌で、発現可能である5.札114)。これは， L. lactisにおける遺伝子発現機構が他のグラム陽性細菌や大腸菌と類似した点 もあることを示唆し，外来遺伝子の発現も行われている札 88・札 102・103)0 L αc-tococcus属のクリプチックプラスミドの複製開始領域にStα.phylococcusα u-reus由来の薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドpC194，pE194，pUBll0を連結して 開発されたベクターとしてpGKV21，pNZ12，pCKl等があげられる24・26. 36. 52・117)。 これらは大腸菌，枯草菌，L.lαctisで使用可能なシャトルベクターである。最近 では，これらを改良してプロモーター・ターミネータ一一スクリーニングベク 1 i n 4
ター10・105にシグナル・シーケンス選択ベクタ_90) 発現ベクター102) 染色 体組み込み用ベクター15. 19. 31. 51. 52. 88)等種々のベクターが開発されている。 Lαctobαcillus属でもLb.heweticusのクリプチックプラスミド、pLJ1から大腸 菌とのシャトルベクターpLHRや96)，Lb.pentosus MD353株のクリプチック プラスミドとpE194とからpLPE32379 )が開発されるなど次第に応用範囲が広ま りつつある。 L.lactisにおいては， DNAを直接細菌細胞に取り込めるコンピテント細胞が 得られないために，他の菌種に適用されている凍結・融解による方法，界面活性 剤を用いる方法， CaC12処理による方法などが試みられたがいずれも成功して いない。細胞融合の項で後述するように卵白リゾチーム処理やそれに加えた粗製 αーアミラーゼ，ムタノリシン処理によるプロトプラストの生成と再生方法が確 立されているので枯草菌で行われているプロトプラスト形質転換法16)が応用さ れている。高張液中で溶菌酵素により細胞をプロトプラスト化し，ポリエチレン グリコール(PEG)の存在下でDNAを無理やり細胞に押し込める方法で，基本 的には細胞融合法と類似のものであるが，操作の要点は，プロトプラスト化 PEG処理，細胞壁の再生にある。これらの条件を検討することにより当初8.5/ μgDNAであった形質転換頻度は約104/μgDNAにまで、向上した56.57.58.59)。 さらに形質転換緩衝液の2価イオンをMg2+からCa2+に置換したり，対数増殖 期の非常に早い段階でプロトプラストを形成することで形質転換頻度が上昇する ことが報告されている93・111>。また、プロトプラストの調製にキモトリプシン とムタノリシンを併用した場合に、一部の菌株で高い形質転換効率が示されてい る116)0 Lb. acidop hilusでもリゾチームとムタノリシン併用で成功例が報告さ れている67)0 Lαctobacillus属では梓菌であるためかプロトプラストの再生が 悪く，またDNA分解酵素活性が強いせいもあって，うまくいった場合でも形質 転換頻度は103/μgDNA程度にとどまっている 20)0 PEGによりDNAが取り 込まれる現象はファージDNAを用いた場合にも観察されるが， DNA感染 (Transf ection)の系では感染後に放出されるファージ粒子を溶菌班として計測 するので，形質転換法とは異なり，細胞壁の再生を必要としないため，プロ卜プラ スト化とDNA取り込みの実験条件の検討法としては優れている。 L.diαcet i-lactisのプロトプラストにP008ファージDNAを感染させ，104/μgDNAの感染 ワ -n 〆 旬
効率が報告され37) Lb. cαseiでは， DNA分解酵素から供与DNAを保護する 目的でリン脂質よりなる人工膜でくるんでリポソームを形成させる試みで， 1700PFU/μgDNAの感染効率で、Lb.cαseiの形質導入に成功している1・l山。 また，Lb. bulgα，ricus B004株では107PFU/μgDNAと高い感染効率を報告 している。いずれの場合にも，菌株間での至適条件が異なったり，再現性に乏し かったり，形質転換体を得るために多大の労力と時間，経験を要する場合が多 かった。また，L.lactis LM0230株ではプロトプラストを用いない形質転換法 も報告されている87)が一般的ではない。 こうした欠点を補う方法として，最近注目されてきているのは，動植物細胞の 形質転換法に取り入れられてきたエレクトロポレーション〈電気穿孔)法である。 細胞の懸濁液に高電圧パルスをかけることにより可逆的な膜破壊が起こることを 利用して，懸濁液中に加えたDNAを細胞質中に取り込ませる方法で，細胞が小 さいためにかなりの高電圧C10KV/cm以上)を必要とし，特殊な装置も必要で はあるが，簡便にできて再現性の高い結果が得られ，これまでプロトプラストが 得られなかった菌株でも形質転換体が得られ，プロトプラストから再生するより は早く形質転換体のコロニーが得られるなどの利点がある。 L.lαctisの場合には， インタクトな細胞28，72・札〉やりゾチーム処理した細胞82にあるいは、 DL-ト レオニン104)やグリシン44)により細胞壁を脆弱化した受容菌細胞を形質転換緩 衝液に懸濁し供与DNAを加えてパルス電圧を印加後，高張液培地中で導入遺 伝子を発現させて適当な選択圧を加えた再生培地で選択する。 L.cremorisでは， 107/μgDNA以上の効率が得られ，Lb.cαseiでも104/μgDNAの報告があ る17)。また，Lb.plantα rum4• 6・ 12) ，Lb.αcidophilus，Lb. curvαtus， Lb. hel -veticus， Lb. sake， Leu.pαramesenteridesで行われているが23・34・42. 68) 種属や各菌株により具体的条件と形質転換頻度は異なる。 Lactococciは栄養的にもうるさく複雑なアミノ酸要求性を持っている。牛乳中 にはフリーのアミノ酸は十分量存在しないので，これらの細菌が生育していくに は，牛乳中のタンパク質、主としてカゼインを，細胞壁に付着するプロテイナー ゼやぺプチ夕、ーゼでペプチドやアミノ酸に分解する必要がある師〉。このことは 発酵乳中で旺盛に生育し酸生成すると共にいわゆる熟成過程での独特な風味フ レーノ〈ーをかもしだす機構の主要な部分を占めるが，分子レベルでの理解も進ん n t u n L
できている。細胞壁付着性プロテイナーゼ、は生化学的な分析から分子量が約145 kDa至適pH5.5-6.5で安定化のためにCaイオンを必要とする29・38. 60・61・74・ 75)。カゼイン分解の特異生などからの分類が提唱されており，PIタイププロテ イナーゼは主にβーカゼインのみを分解するのに対し， PIIIタイプはβーカゼ インとともにαーやκーカゼインも同様に分解サる。 プロテイナーゼは遺伝的に不安定でプラスミドDNA上にコードされており，い くつかの株ではlac遺伝子と挙動を共にし，単一のラクトース/プロテイナーゼ (LacPrt)プラスミド上に存在することが知られている32・33・78)。特にL.cr e-moris W g252. 53 ・ 54~ L.lactis NCD076350) (P 1タイプ)， L.cremoris SKll 26) (PIIIタイプ)のプロテイナーゼ、遺伝子の物理的特性についてはよく研究さ れ，L.cremoris E8，ML1，H2，L.lαctis 712， UC317のプロテイナーゼ遺伝子も L.lactisやE.coliで、クローン化されている62・1l0)。これらの塩基配列の検討から， プロテイナーゼ遺伝子が両方向に転写されるprtPとprtMの2つの遺伝子から なり， prtPは200kDaのプレプロ構造を持ったセリンプロテアーゼをコードし， prtMはprtPの産物を活性型に変える30kDaのリボタンパク質をコードする遺 伝子であることが分かつている羽田 40. 41目 112】。遺伝子の安定化の試み65ヘ タ ン パク質工学による基質特異性の改変113)やプロモーター近傍の構造による宿主特 異性の可有出生も示唆されている問。 エンドペプチダーゼ、は大きなカゼインフラグメントをより小さいペプチドに加 水分解し，さらにいくつかのアミノペプチダーゼが分解する30. 77・札98・問。特 異性の高いX-prolyl-dipeptidylaminopeptidaseはプロリンリッチなペプチ ドを11. 14. 48. 71. 76.山にジペプチダーゼ・トリペプチダーゼ100・101)やプロリ ダーゼ47)が働いてフリーのアミノ酸にまで分解する。 Lαctococcus lactisのラクトース代謝系はPEP-PTS系によりラクトースに 特異的な膜タンパク質酵素11 (lacE)と可溶性タンパク質酵素11 1 (lacF)を
通して細胞内にlactose-6 -Pの形で取り込まれ， pho閃spho-β-gala即ctωos民i一 dase(οl卸acG)はこれをグlルレコ一スとgalactose一6ι-Pに分解し9. 2釘5. 2幻7，¥) クグ*ル
コ一スまlはEmbden-meyerhof -Parn古naspathwayをとおり.galactose -6ふ-PIはま
t
同aga叫tos回e-6ι-phosphate pathwayで
Lacプラスミド上に約8kbの一連のラクトースオペロンとして存在し、 la
a 4 ・
n L
cABCDFEGXの順に並び，その上流にこれらのプロモーターに対するリプ レッサー遺伝子lacRが存在する45・70.川 .107. 108)0 Lb. cαseLのラクトース代謝系も PEP-PTS系である1・2・81)0 Lb. bulgαricus，Leu.lactisやS.thermophillus の代謝系(β-galactosidase)もクローニングされている22. 43・49. 66)
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