原 著
EBV 核酸増幅検査用第一次国際標準品（1st WHO International Standard）に基づく二次標準物質を用 いた末梢血中 Epstein-Barr virus（EBV）DNA 量の 評価
岩下千奈美
1)末木 茜
2)松田 和之
2)井出裕一郎
2)菅野 光俊
2)石田 文宏
3)本田 孝行
4)1) 信州大学大学院医学系研究科保健学専攻（〒390-8621 長野県松本市旭3-1-1） 2) 信州大学医学部付属病院臨床検査部
3) 信州大学医学部保健学科病因・病態検査学講座 4) 信州大学医学部病態解析診断学教室
要 旨
Epstein-Barr virus（EBV）DNA定量検査は，EBV感染症および関連疾患において疾患の発見や予防のために重要な検査
である。EBV DNA量の定量には，標準物質を用いたReal-time PCR法が用いられているが，使用される標準物質は各施設 さまざまであり，施設間で定量値を比較できないという問題がある。本研究では，EBV DNA定量検査の第一次国際標準 品1st WHO International Standardを用いて，二次標準物質を作製した。また，過去に測定したEBV DNA定量値を，二次 標準物質に基づく定量値に換算するための変換係数を求めた。EBV関連造血幹細胞移植後リンパ球増殖性疾患（post- transplant lymphoproliferative disorder: PTLD） 疑 い 症 例 及 びEBV 関 連 血 球 貪 食 性 リ ン パ 組 織 球 症 （EBV-related hemophagocytic lymphohistiocytosis: EBV-HLH）症例について，新規検体は二次標準物質を，過去測定済み検体は換算係数 を用いて末梢血中EBV DNA定量値を求めた。それぞれ8.74 × 102～1.51 × 104 IU/μg DNA，1.58 × 104～1.33 × 106 IU/μg DNA であった。多施設で利用可能な二次標準物質が普及することで，EBV関連疾患毎の診断基準となるEBV DNA定量値が設 定できると考えられる。
キーワード
EBウイルス，リアルタイムPCR，第一次国際標準品，移植後リンパ球増殖性疾患，EBV関連血球貪食性リンパ組織球症
Epstein-Barr virus（EBV）は γ
ヘルペス亜科に属す るヒトヘルペスウイルスであり，世界人口の大多数 が幼少期に唾液を介して感染するが，多様な疾患へ の関与が問題となっている1)。EBVはB
細胞の表面 抗原であるCD21
蛋白を受容体として感染するが，細胞傷害性
T
細胞が感染B
細胞の増殖を抑制して いる2),3)。初感染後体内に局在し生涯に渡って持続感 染するため，EBV
関連疾患の診断や治療効果の判定 にはEBV
を検出するだけではなく定量的に評価する 必要がある2)。造血幹細胞移植（移植）や固形臓器移植を行った患者では細胞傷害性
T
細胞の働きが抑 制され4)，EBV感染B
細胞が増加してEBV
関連PTLD（EBV-PTLD）を発症する場合があるため，移
植後に
EBV DNA
量をモニタリングすることは重要である。また，EBVが
CD8
陽性T
細胞に感染し，全身炎症と血球貪食が誘導される
EBV-HLH
では，EBV DNA
量をモニタリングすることが病状の把握と治療効果の評価に有用とされている2),5)。
EBV DNA
定量検査は，主にReal-time PCR
法を用 いて行われている。EBV DNA
量を測定するReal-time
（平成26年10月23日受付・平成26年11月4日受理）
PCR
法では，標準物質の調製が必要であるが，各施 設で独自の標準物質を用いて測定している。そのた め明確な診断基準となる定量値がなく1)，施設間でEBV DNA
の定量値を比較することは困難である。近年，世界保健機関（
World health organization:
WHO）から EBV
核酸増幅検査の第一次国際標準品1st WHO International Standard
が発表された6),7)。本 研究では1st WHO International Standard
を用いてEBV BNRF 1
領域の133 bp
をサブクローニングした プラスミド溶液濃度の補正を行い，EBV DNA定量 検査における二次標準物質を作製した。さらに，二 次標準物質と自施設で作製したEBV
プラスミド標 準物質の相関から変換係数を求め，その変換係数を 用いて自施設で過去に測定した定量値から二次標準 物質に基づく換算値を求め，PTLD疑い症例およびEBV-HLH
患者について，新規検体は二次標準物質を，過去測定済み検体は変換係数を用いて末梢血中
EBV DNA
定量値を測定・換算し検証した。I
対象と方法1．対象
当院を受診し，移植後に
EBV DNA
定量検査の依 頼があったPTLD
疑い患者12
例とEBV-HLH
患者9
例を対象とした。比較対象として，健常人17
例を測 定した。材料はEBV
感染症診断時に提出された末梢 血DNA
抽出液を用いた。2．二次標準物質の作製
EBV BNRF1
遺伝子内に設計した特異的プライマー（Table 1）を用いて得られた
133 bp
のPCR
産 物をpCR2.1vector
にサブクローニングしてEBV
プ ラスミド溶液を作製した。プラスミド塩基数，分子 量，DNA濃度からプラスミドコピー数を算出した。EBV
プラスミド溶液を2 × 10
4，2 × 10
5，2 × 10
6，2 ×10
7，2 × 108copies/mL
となるように希釈系列（未補 正自製プラスミド溶液）を作製して，5 × 106IU/mL
の
1st WHO International Standard
とともに測定した。2 × 10
4～2 × 108copies/mL
の検量線上で1st WHO International Standard
のthreshold cycle
（CT）値が5 × 10
6IU/mL
となるように希釈系列を補正し，二次標 準物質とした。補正後の二次標準物質の単位は以下，IU/mL
で示す。3．Real-time PCR
法特異的プライマーおよび
FAM
標識のTaqMan
プ ローブを用いた（Table 1）。DNA溶液5 μL
をPCR
反応液45 μL
（1 × Taq Man Master Mix，800 nMforward primer， 800 nM reverse primer， 160 nM TaqMan probe
） に 加 え ，ABI PRISM 7900HT
（Life Technologies）を使用し，50℃2
分間，95℃10分間の 後，95℃15秒間，60℃1分間のPCR
反応を50
サイ クル繰り返し，測定を行った。EBV DNA定量値に ついては，標準物質から求めたコピー数（IU/mL）を検体の
DNA
濃度で除したコピー数（IU/μg DNA）で表記した。
4．
二次標準物質の評価（同時再現性，日差再現性お よび検量線の直線性）同時再現性および日差再現性は，2 × 104～2 × 108
IU/mL
に補正した二次標準物質を用いてReal-time PCR
を5
回連続，5日連続で測定を行い，CT値のCV
値を求めた。検量線の直線性については，2 ×10
4～2 × 108IU/mL
の濃度をx
軸に，CT値をy
軸に プロットして，回帰直線を求めて評価した。5．変換係数の算出
x
軸に未補正自製プラスミド溶液のDNA
濃度，y 軸に，上記検討4
から求めた二次標準物質検量線（Figure 1）を用いて未補正の自製プラスミド溶液の
CT
値から求めた濃度をプロットし，相関を求めた。回帰直線の傾きを，変換係数（conversion factor: CF）
とした。過去に
EBV DNA
定量を行っている移植後PTLD
疑い症例患者5
例，EBV-HLH
患者2
例につい て，上記方法に従い，EBV DNA定量時の未補正プ ラスミド溶液のCT
値より，それぞれCF
を算出した。EBV定量PCRに用いたプライマーおよびプローブ配列 プライマーと検出プローブ Sequences（5'→3'）
BNRF 1 forward primer TTCTGTCTCACCTACCGGATGA
BNRF 1 reverse primer GTAATGAAGACGTTGGAACAGGC
BNRF 1 detection probe FAM-ACCTGGAATGCAGCAGTTTGTCAGCA-MGB
FAM, 6-carboxyfluorescein; MGB, dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder Table 1
II 結
果1．二次標準物質の評価（Figure 1）
同時再現性は
0.36～0.62%，日差再現性は 0.58～
1.2%であった（Table 2）。検量線は y = 1.473 ln (x) + 39.155
であった。2 × 104～2 × 108IU/mL
までの範囲 に直線性が確認された（r = –0.999，Figure 1）。2．CF
による換算値の評価新規患者および健常人を含めた
11
検体について，上記方法に従い，CFを求めた（Figure 2）。
x
軸に二 次標準物質を用いて測定した検体の定量値をプロットし，y軸に
CF（0.3032）を用いて求めた換算値を
プロットした。相関は，回帰式
y = 1.0362x，相関係
数r = 0.999
であった（Figure 3）。二次標準物質の同時再現性および日差再現性（n = 5）
同時再現性
IU/mL 2 × 104 2 × 105 2 × 106 2 × 107 2 × 108
CT mean 32.3 28.9 25.3 21.8 18.5
SD 0.20 0.17 0.11 0.08 0.10
CV（%） 0.62 0.58 0.44 0.36 0.52
日差再現性（n = 5）
IU/mL 2 × 104 2 × 105 2 × 106 2 × 107 2 × 108
CT mean 32.4 28.8 25.4 22.2 18.8
SD 0.21 0.23 0.17 0.13 0.23
CV（%） 0.65 0.81 0.67 0.58 1.20
CT; Threshold cycle Table 2
3． PTLD
疑い症例患者及びEBV-HLH
患者の末梢血 中EBV DNA
定量値の評価12
例の移植後PTLD
疑い症例患者（二次標準物質 を用いて測定した7
例，上記方法に従って，過去測 定時の未補正プラスミド溶液のCT
値より求めた各CF
を用いて換算した5
例）では，8.74 × 102～1.51 ×10
4IU/μg DNA
であった。9例のEBV-HLH
患者（二 次標準物質を用いて測定した7
例，上記と同様にCF
で換算した2
例）では1.58 × 10
4～1.33 × 106IU/μg DNA
であった。（Figure 4）。一方，17例の健常人で は全て10 IU/μg DNA
以下であった。未補正EBVプラスミドDNA
（copies/mL）
二次標準物質検量線より補正した EBVプラスミドDNA（IU/mL）
y = 0.3032x r = 0.993
2×1042×1052×106 2×1072×108 2×103
2×104 2×105 2×106 2×107 2×108
2×103
Conversion factor（CF）の算出 Figure 2
IU/mL 102 32.4 103 28.8 104 25.4 105 22.2 106 18.8
y = ‑1.473 ln(x) + 39.155 r = ‑0.999
0 5 10 15 20 25 30 35
2×104
EBVプラスミドDNA IU/mL Threshold cycles（CT） （cycles）
2×105 2×106 2×107 2×108 CT
Real-time PCR法における二次標準物質の検量線 Threshold cycle（CT）はThresholdを0.102として決定した。
Figure 1
III 考
察今回，EBV核酸増幅検査用の第一次国際標準品
（1st WHO International Standard）を用いて
Real-time PCR
法におけるEBV DNA
定量の二次標準物質を作 製した。二次標準物質の同時再現性および日差再現 性は良好であり，希釈直線性も認められた（Table 2,Figure 1）。
これまで，統一した標準物質がなかったため，自 施設では，プラスミド溶液を用いた標準物質を作製 し，EBV DNA量の定量を行っていた。従来の標準
二次標準物質を用いて測定した 患者末梢血中EBV DNA定量値 14
12 10 8 6 4 2
00 2 4 6 8 10 12 14
CFで変換した患者末梢血中EBV DNA換算値
y = 1.0362x r = 0.999
（×104IU/mg）
（×104IU/mg）
二次標準物質を用いた定量値とCFを用いた換算 値の相関性
Figure 3
健常人
n = 17 EBV-PTLD 疑い症例
n = 12
EBV-HLH 患者 n = 9 EBV DNA （IU/μg）
107 106 105 104 103 102 101 1
EBV-PTLD疑い症例とEBV関連HLH患者，健常 人との定量値の比較
点線は検出限界を示す。
Figure 4
物質を用いて定量され，蓄積されている過去症例に
おける
EBV DNA
定量値を一次標準物質に基づく定量値として換算する必要性があった。本研究で作製 した一次標準物質により補正した二次標準物質に基 づく定量値と未補正の標準物質に基づく定量値を
CF
で 換 算 し た 値 に 良 好 な 相 関 が 認 め ら れ た（Figure 3）。そのため，私たちは既に結果が得られ
ている
EBV DNA
定量値について，それぞれ回帰直線の傾きから
CF
を求め，CF
を乗じて二次標準物質 に基づく定量値を得た。過去の定量値についても換 算が可能となり，他施設においても，同様な換算を 行うことで，これまでに蓄積されたデータを活用で きると考えられる。PTLD
疑い症例患者とEBV-HLH
患者について二 次標準物質あるいは変換係数用いて末梢血中EBV DNA
定量値の評価を行った。移植後PTLD
疑い時お よびEBV-HLH
初感染患者の末梢血中EBV DNA
定 量値はそれぞれ8.74 × 10
2～1.51 × 104IU/μg DNA，
1.58 × 10
4～1.33 × 106IU/μg DNA
であり，健常人に 比し有意に高値であった。移植後PTLD
疑い症例患 者の中には高感染が知られているEBV-HLH
に相当 する症例もあった（Figure 4）。EBV
感染症迅速診断法（Real-time PCR法）は，厚生労働省により先進医療に位置付けられている。
特に移植においては免疫抑制剤の使用に伴う
PTLD
発症の可能性があり，予防や早期検出のためには，EBV DNA
量に基づく診断基準値や治療介入の判断基準値を明らかにする必要性もある。
PTLD
でのEBV DNA
量について用いた標準物質と検査材料につい て，これまでの報告によると，①EBV EBNA1領域 をサブクローニングして作製されたpCMEBNA
プラ スミド（Invitrogen, Carlsbad, Calif）で補正したEBV
産生細胞株由来のEBV DNA
を標準物質として使用 し，末梢血単核球を用いて定量した結果，1.76 × 104～
1.87 × 10
5copies/μg DNA
であった8)，②EBVBNRF1
遺伝子領域をpCR II
ベクターにサブクロー ニングして作製したEBV
プラスミド溶液のコピー数 を電子顕微鏡でカウントして調整した溶液を標準物 質として使用し，血漿を用いて定量した結果，7.4 ×10
4～3.2 × 106copies/mL
であった9)，③Artus EBV LCPCR kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いた報告で
は，付属のEBV LC/RG/TM Quantitation Standard
を標準物質として使用し，末梢血全血を用いて定量し た結果，
1.00 × 10
3～1.24 × 107μg/mL
であった10)，と それぞれ述べられている。PTLD患者のEBV DNA
定量を行う際に使用される検査材料および標準物質 は報告によってさまざまであった。本研究では，末 梢血全血からDNA
を抽出し，EBV DNA
定量を行っ ている。PTLDを評価する場合の最適な検査材料の 検討を行う前に，EBV DNA量そのものについて統 一した標準物質に基づいた値付けが必要である。EBV
は，PTLD，EBV-HLHをはじめとする多様な疾患に 関与しているが，統一した基準となるEBV DNA
量 は定められていない。EBV
関連疾患の疾患毎の診断 基準となるEBV DNA
定量値を設定する必要があり，1st WHO International Standard
で較正した二次標準 物質およびCF
を用いることで，施設間で比較可能 な値を求めることが可能になると考えられる。IV
結 語1st WHO International Standard
より補正した二次 標準物質を作製した。二次標準物質と自製の標準物 質とのCF
を求めることにより，二次標準物質に基 づく換算値として定量値を得ることも可能であった。多施設で利用可能な二次標準物質が普及すること で，
Real-time PCR
法によるEBV DNA
定量値の施設 間差是正とEBV
関連疾患の疾患毎の診断基準値や 治療介入の判断基準値を設定，治療効果の評価が可 能になると考えられる。■文献
1) Gartnera B, Preiksaitis JK: “EBV viral load detection in clinical virology,” Journal of Clinical Virology, 2010; 48: 82–90.
2) Kimura H et al.: “Measuring Epstein–Barr virus (EBV) load: the significance and application for each EBV-associated disease,”
Medical Virology, 2008; 18: 305–319.
3) Gulley ML, Tang W: “Using Epstein-Barr viral load assays to diagnose, monitor, and prevent posttransplant lymphoproliferative disorder,” Clinical Microbiology, 2010; 23(2): 350–366.
4) Thorley-Lawson DA et al.: “Persistence of the Epstein–Barr virus and the origins of associated lymphomas,” N Engl J Med, 2004;
350: 1328–1337.
5) 谷内江 昭宏：「EBV-HLHの病態；早期診断・早期治療介入 のためのサイトカインプロファイリングと細胞解析」，小児 感染免疫，2011; 23(1): 43–50.
6) Fryer J：“Collaborative study to evaluate the 1st WHO international standard for human cytomegalovirus (HCMV) for nucleic acid amplification (NAT)-based assays, division of virology,” NIBSC. http://www.nibsc.org/pdf/Jacqueline_Fryer_
1.pdf
7) Kwong Y-L et al.: “Quantification of circulating Epstein-Barr virus DNA in NK/T-cell lymphoma treated with the SMILE protocol: diagnostic and prognostic significance,” Leukemia, 2014; 28: 865–870.
8) Jabs WJ et al.: “Normalized quantification by real-time PCR of Epstein-Barr Virus load in patients at risk for posttransplant lymphoproliferative disorders,” Journal of Clinical Microbiology, 2001; 39(2): 564–569.
9) Niesters HG et al.: “Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein-Barr Virus,” Journal of Clinical Microbiology, 2000; 38: 712–715.
10) Cho Y-U et al.: “Pattern analysis of Epstein-Barr virus viremia and its significance in the evaluation of organ transplant patients suspected of having posttransplant lymphoproliferative disorders,”
Am J Clin Pathol, 2014; 141: 268–274.
Original Article
Evaluation of Epstein-Barr virus DNA loads in peripheral blood using a plasmid solution calibrated with the 1st WHO International Standard
Chinami IWASHITA
1)Akane SUEKI
2)Kazuyuki MATSUDA
2)Yuichiro IDE
2)Mitsutoshi SUGANO
2)Fumihiro ISHIDA
3)Takayuki HONDA
4)1)Department of Health and Medical Sciences, Graduate School of Medicine, Shinshu University of Medicine(3-1-1, Asahi, Matsumoto, Nagano 390-8621, Japan)
2)Department of Laboratory Medicine, Shinshu University Hospital
3)Department of Biomedical Laboratory Sciences, Shinshu University School of Medicine 4)Department of Laboratory Medicine, Shinshu University School of Medicine
Summary
The monitoring of Epstein-Barr virus (EBV) DNA loads is important for the detection and prevention of EBV-related disorders. EBV loads have been evaluated by quantitative real-time PCR analysis requiring the preparation of standards. The standard materials for the quantification of EBV loads vary among clinical laboratories. Therefore, it is difficult to obtain comparable EBV DNA quantitative values among laboratories. In this study, the copy number of plasmids containing a fragment corresponding to the EBV BNRF1 gene was calibrated with the 1st WHO International Standard for EBV quantification tests, and then the calibrated plasmids were used as secondary standards to quantitate the EBV DNA loads of subsequent samples from patients. Additionally, the theoretical conversion factor was calculated to convert the EBV DNA loads obtained using noncalibrated standards into those obtained using the present secondary standards. The EBV DNA loads in hematopoietic-stem-cell-transplanted patients suspected of having post-transplant lymphoproliferative disorder (PTLD) and patients with EBV-related hemophagocytic lymphohistiocytosis (EBV-HLH) were 8.74 × 102−1.51 × 104 and 1.58 × 104−1.33 × 106 IU/μg DNA, respectively, as determined by these methods. The utilization of secondary unified standards for the quantification of EBV DNA loads available for many clinical laboratories would contribute to the establishment of a diagnostic reference and therapeutic intervention criteria based on the quantitative values of EBV DNA, not only in PTLD patients but also in those with various disorders related to EBV infection.
Key words: Epstein-Barr virus, real-time PCR, 1st WHO International Standard, post-transplant lymphoproliferative disorder, EBV-related hemophagocytic lymphohistiocytosis
(Received: October 23, 2014; Accepted: November 4, 2014)
