アステラス製薬株式会社研究本部薬物動態研究所

(1)

平成 28 年度博士学位論文

PXB マウスおよび Cyp3a KO ヒト肝キメラマウスを用いたヒト代謝予測の効率化に関する研究

アステラス製薬株式会社研究本部薬物動態研究所

中田直之

(2)

略語表

本論文において以下の略語を用いた

APCI atmospheric pressure

chemical ionization AUC 血漿中濃度曲線下面積

CL クリアランス CL/F 経口クリアランス CLH 肝クリアランス Cmax 最高血漿中濃度

Cyp マウスチトクロームP450 CYP ヒトチトクロームP450

ESI electrospray ionization F バイオアベイラビリティ

fB タンパク非結合型分率 FDA 米国食品医薬品局

FRG

fumarylacetoacetate hydrolase/recombination activating gene

2/interleukin common gamma chain triple knockout

HMBC 異種核多結合相関法

HPLC 高速液体クロマトグラフィ ICH 日米欧医薬品規制調和国際会議

ID internal diameter KO ノックアウト

LC 液体クロマトグラフィ mCPP メタクロロフェニルピペラジン

MRP2 multidrug

resistance-associated

protein 2 MS 質量分析法、質量分析計

MS/MS タンデム質量分析法、タンデ

ム質量分析計 NADPH ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸

NEF ネファゾドン NMR 核磁気共鳴分光法、核磁気共鳴分光計

OATP1B1 organic anion transporting polypeptide 1B1 OH-NEF ネファゾドン水酸化体

p-OH-NEF ネファゾドン-p-水酸化体 QH 肝血流量

R ヒト肝置換率 RAD 放射線検出器

ROESY 回転フレーム核オーバーハ

ウザー効果分光法 SCID 重度複合免疫不全

(3)

SDラット Sprague Dawleyラット TD ネファゾドントリアゾールジオン体

TK-NOG

non-obese diabetic/Shi-scid IL2 receptor gamma–null mice expressing a herpes simplex virus type-1 thymidine kinase transgene

t1/2 半減期

tmax 最高血漿中濃度到達時間 uPA ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子

UV 紫外線、紫外検出器

(4)

第1章諸言 ... 1

第2章 YM758のマウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサル代謝プロファイル ... 8

第1節ラット血漿、尿および胆汁中代謝物検索 ... 9

第2節マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルにおける血漿中代謝物の同定 ...12

第3節ラット代謝物の構造解析 ...14

第4節小括 ...18

第3章 PXBマウスを用いたヒト代謝物の予測...19

第1節 ICRマウス、PXBマウスおよびヒトにおける化合物Aの代謝に関する検討 .20 第2節 uPA/SCIDマウスおよびPXBマウスにおけるアモスラロール代謝物の定量 ..21

第3節小括 ...23

第4章 uPA/SCID マウス、SD ラット、PXBマウスおよびヒトにおける ASP015K の代謝に関する研究 ...25

第1節 SDラットおよびヒトにおけるASP015K代謝物の構造解析 ...26

第2節 uPA/SCID マウス、SD ラット、PXB マウスおよびヒトにおける ASP015Kの代謝物比較 ...29

第3節小括 ...32

第5章 Cyp3a KOヒト肝キメラマウスにおけるNEFの代謝に関する研究 ...34

第1節 SCIDマウス、Cyp3a KOマウス、PXBマウスおよびCyp3a KOヒト肝キメラマウスにおけるNEFの代謝物検索 ...35

第2節 NEFのSCIDマウス、Cyp3a KOマウス、PXBマウスおよびCyp3a KOヒト肝キメラマウスにおけるIn vivo薬物動態解析 ...39

第3節 NEFのICRマウス、Cyp3a KOマウスおよびヒトにおけるIn vitro薬物動態解析 ...42

(5)

第4節小括 ...44

第6章総括 ...45

第7章方法 ...49

第1節被験物質および試薬 ...49

第2節使用機器 ...49

第3節使用動物 ...50

第4節動物実験およびin vitro代謝実験...50

第5節分析および解析条件 ...54

参考文献 ...63

(6)

1 第1章諸言

創薬化学の進歩による合成技術向上や、コンビナトリアルケミストリーの導入、一連の合成化合物をライブラリーとして購入できるようになったことから、数多くの化合物が医薬候補化合物として薬理作用のスクリーニングに供されるようになった。創薬の過程においては、実に1万種類以上の化合物が検討され、実際に数百から数千種類の化合物が合成される。

さらに、スクリーニングおよび動物実験などで十数種類にまで絞り込み、臨床試験などを経て、ようやく1つ新薬が世に出ると言われる。1990年代前半頃までは、臨床試験の途中で開発中止となる最大の理由として、候補化合物の薬物動態特性の悪さが挙げられていた (Figure 1)¹。

Figure 1. 医薬品の開発中止に占める理由の割合¹

(7)

2

現在、医薬候補品の薬物動態特性を明らかにするため、多くの動物実験が行われている。

しかしながら、ヒトと動物の体内動態には相違があり、単純に実験動物の結果をヒトに反映できない。その相違点の一つとして、主な消失過程である代謝のプロファイルが、実験動物とヒトで異なることが指摘された^2,3。1990年代後半以降、ヒト生体組織を利用した薬物動態研究が可能となり、国内外の製薬企業は開発の初期段階における代謝プロファイル評価に注力した研究開発体制を構築した。そのため、2000年の調査では医薬品の開発中止が薬物動態に起因する割合は大幅に減少した (Figure 1)¹。しかしながら、薬効不足および副作用が原因で開発中止となったものについても、薬物動態が問題となっている例が未だに多いことが指摘されており¹、ヒトにおける開発候補医薬品の代謝プロファイル予測には多くの課題が残されている。

一般的には、ヒトの代謝プロファイルを予測するために、ヒト凍結肝細胞を利用したIn

vitro研究が実施される^3-5。しかし、Dalvieらの報告によると、この手法による第1相反応

による代謝物の予測成功率は50-69%、その後の第2相反応による代謝物の予測成功率については47%未満であり⁶、未だ正確な予測は難しい。特に、チトクロームP450を代表とする薬物代謝酵素の第1相反応により生成される代謝物は、未変化体と化学構造や物性が類似していることから、しばしば薬効や毒性を発現することがある^7,8。さらに、反応性代謝物が生成され、重大な副作用につながる例も多く報告されている^9-13。近年、米国食品医薬品局

（FDA）および日米欧医薬品規制調和国際会議（ICH）により、薬物代謝物の安全性試験に関するガイドラインが作成され^14,15、開発早期から、医薬品のヒト代謝プロファイルを明らかにすることが求められている。

ヒト肝キメラマウスとは、マウスの生体内においてヒト肝細胞を生着させたマウスのことである。現在、ヒト肝キメラマウスは、その作製法により、Oregon Health and Science UniversityのMarkus教授により開発されたfumarylacetoacetate hydrolase/recombination

(8)

3

activating gene 2/interleukin common gamma chain triple knockout (FRG) マウス¹⁶、公益財団法人実験動物中央研究所において開発されたnon-obese diabetic/Shi-scid IL2 receptor gamma–

null mice expressing a herpes simplex virus type-1 thymidine kinase transgene (TK-NOG) マウス¹⁷、そして、広島大学・吉里勝利名誉教授らの研究グループによって開発され、本研究の開始当時には既に利用が可能であったPXBマウス¹⁸に分類される。PXBマウスは、肝臓に障害を持つウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子トランスジェニックマウス（uPAマウス）と T細胞およびB細胞を持たない重度複合免疫不全マウス（SCIDマウス）の掛け合わせにより、どちらの形質もホモ接合体であるuPA/SCIDマウスを作製し、このマウスに約100万個のヒト肝細胞を脾臓経由で移植して作製されたヒト肝キメラマウスである¹⁸。移植後は、約 2ヶ月で肝臓がヒト肝細胞に置換される¹⁸。PXBマウスは、B型並びにC型肝炎ウイルスにも感染することが確認されており、ウイルス増殖メカニズムの解明や抗ウイルス薬の研究に利用されている^19,20。また、このマウスの肝臓は正常な組織構造を示し、ヒトアルブミンの産生、ヒト代謝酵素並びにトランスポーターの発現および活性、ヒト型の胆汁酸組成などが確認されている^21-24。実際にPXBマウスの肝組織像を観察すると、ヒト血管内皮細胞および毛細胆管のマーカーであるCD31およびZO-1、並びにヒト薬物輸送担体であるorganic anion transporting polypeptide 1B1 (OATP1B1) およびmultidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) の発現が認められる(Figure 2)²⁵。

(9)

4

Figure 2. PXBマウスにおける肝切片の組織像²⁵

(A) ヘマトキシリン・エオジンによる染色画像 (100×). (B) 免疫染色法によるCD31の染色画像 (200×). (C) 蛍光免疫染色法によるZO-1の染色画像 (300×) および矢印部分の拡大画像 (600×). (D) 免疫染色法によるOATP1B1 (紫色) およびMRP2 (茶色) の染色画像 (200×).

PXBマウスはヒト代謝予測にも利用できると考えられる。実際にPXBマウスを用いた薬物動態研究は行われており、ヒト代謝プロファイルの予測ツールとしての有用性が報告さ

れている^26-30。しかしながら、これらの研究はヒト代謝物が既知の化合物のみで実施されて

おり、ヒト代謝物が未知である開発段階での利用に関する研究報告はない。また、PXBマウスがヒト代謝プロファイルを予測できない例もあり^26,28、その低い予測性に関係する因子

(10)

5 は明らかではない。

一方で、化合物の中には、PXBマウス肝臓中に数%残存するマウス肝細胞由来のマウス代謝酵素により、大部分が代謝されるものがある。このような化合物はマウスと同様の代謝プロファイルになってしまい、ヒト代謝を正確に予測できない^25,28。最近、このマウス薬物代謝酵素の影響を最小化するため、uPA/SCID マウスのマウスチトクロームP450 3aをコードする遺伝子 (Cyp3a) をノックアウトし、ヒト肝細胞を移植した新しいヒト肝キメラマウスが作製された³¹。このマウスはCyp3a KOヒト肝キメラマウスであり、本マウスの肝臓および小腸におけるマウス Cyp3aの発現は認められず、ヒトチトクローム P450 (CYPs) の発現レベルはPXBマウスと同等（約70% から117%）であることが確認されている (Figure 3)³¹。

(11)

6

Figure 3. 免疫染色法によるPXBマウスおよびCyp3a KOヒト肝キメラマウスの肝および

小腸切片の染色画像³¹

PXBマウス肝 (A–C) および小腸 (G-I )、ならびにCyp3a KOヒト肝キメラマウス肝 (D–

F) および小腸 (J–L)

緑色: Cyp3a goat polyclonal antibody (A, D, GおよびJ)

赤色: anti-human cytokeratin 8および18 (CK8/18) mouse monoclonal antibody (BおよびE) 青色: Hoechst 33342 (HおよびK)

以上より、このCyp3a KOヒト肝キメラマウスは、残存するマウス肝細胞の影響を抑えたヒト肝キメラマウスであり、ヒト代謝の予測性をより向上させることができると考えられ

(12)

7 る。

本論文では、先ず第2章でヒトと実験動物での医薬候補化合物の体内動態の差異を評価した例として、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルにおけるYM758の代謝プロファイルを検討およびヒト代謝プロファイルとの比較について述べた。次に、第3章でPXBマウスにおけるヒト血漿中代謝物の予測成功例および失敗例を比較し、予測性に寄与する因子の検討を行い、第4章ではuPA/SCIDマウス、Sprague Dawleyラット (SDラット)、PXBマウスおよびヒトにおいて、医薬候補化合物ASP015Kの代謝について検討した。さらに、第

5章で、SCIDマウス、Cyp3a KOマウス、PXBマウスおよびCyp3a KOヒト肝キメラマウス

におけるネファゾドン (NEF) の代謝プロファイルを比較し、同時にCyp3a KOヒト肝キメラマウスのヒト代謝予測における有用性を検討し、創薬および医薬品開発における上記ヒト化モデル動物の利用価値について考察した。

(13)

8

第2章 YM758のマウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサル代謝プロファイル

YM758は新しいIf channel受容体の阻害剤であり、安定型狭心症および心房細動の治療

薬として開発が進められていた³²。本化合物をヒトに投与したとき、N-脱アルキル体およびグルクロン酸抱合などの代謝を受け、代謝物のうちYM-385459, YM-252124, YM-385461お

よびAS2036329がヒト血漿中に存在することが知られている (Figure 4)³³。しかしながら、

毒性試験動物種であるマウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルにおける本化合物の代謝プロファイルは明らかではない。薬物の代謝過程は、動物種により質的および速度的な違いが認められる場合がある。代謝物の安全性ならびに代謝の過程における毒性発現の可能性を親化合物の毒性試験において評価するためには、試験動物における代謝プロファイルを明らかにする必要がある。このように代謝プロファイルに関する情報を得ることは、薬物および代謝物の毒性予測に重要な知見を与えることが期待される。本章では、マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルにおけるYM758の代謝プロファイルを明らかにすることを目的として、

代謝物検索を行った。

7 YM-385459

1

AS2036329 YM-394111

YM-234903

YM-385461 YM-252124

YM758 19 * 31

29 25 24232221

262718 17

14 15

16

1312 10

9 7 4

3 2 1 6 5 20

Figure 4. Postulated metabolic pathway of YM758 in humans

* represents the position of the ¹⁴C label on YM758.

(梅原らの報告³³を元に作成)

(14)

9 第1節ラット血漿、尿および胆汁中代謝物検索

YM758を経口投与後0.5および1時間のラット血漿を用いて、HPLCラジオクロマトグ

ラムにより代謝物を測定したところ、YM758ならびにR1-R4、R9-R10およびR19が検出され、放射能ピークの結果から血漿中の主代謝物はR4およびR10であると考えられた (Figure 5)。

Time (min)

0 100 200 300 400 500

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

(b) 1 h YM758

R9 R4 R3 R1, R2

R10 R19

0 100 200 300 400 500 600 700

dpm

(a) 0.5 h YM758

R9 R4 R3 R1, R2

R10 R19

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

dpm

Figure 5. Radiochromatograms of rat plasma samples collected at 0.5 (a) and 1 h (b) after an oral administration of ¹⁴C-YM758 at a dose of 1 mg/kg

14C-YM758を経口投与後、0-6時間後、6-24時間後のラット尿及び胆汁を採取し、HPLC

ラジオクロマトグラムにより代謝物測定を行ったところ、ラット尿中に未変化体および7 種の代謝物 (R1-R4、R9-R10およびR19) (Figure 6)、胆汁中に10種の代謝物を検出した

(15)

10

(Figure 7)。ラット血漿および尿のラジオクロマトは非常に類似していた(Figure 5および6)。

YM758

R9 R4 R3 R1, R2

cpm

Time (min) cpm

R10 R19

YM758

R9 R4 R3 R1, R2

R10 R19

(a) 0-6 h

(b) 6-24 h

Figure 6. Radiochromatograms of rat urine samples collected for 0-6 (a) and 6-24 h (b) after an oral administration of ¹⁴C-YM758 at a dose of 1 mg/kg

(16)

11

R10 R1, R2R14, R16 R17, R18, R19 R20 R21

cpm

Time (min)

cpm R10 R14, R16 R17, R18, R19

(a) 0-6 h

(b) 6-24 h

R1, R2

Figure 7. Radiochromatograms of rat bile samples collected for 0-6 (a) and 6-24 h (b) after an oral administration of ¹⁴C-YM758 at a dose of 1 mg/kg

尿および胆汁中の代謝物排泄率を算出したところ、最も排泄率が高かったのはR10

(22.14% of dose)であったことから、ラットにおけるYM758の主代謝物はR10であると考え

られた (Table 1)。しかしながら、他にも様々な代謝物が検出されており、ラットにおける

YM758の代謝は多様であると考えられた。

(17)

12

Table 1. Excretion rate of YM758 and its metabolites in rat urine and bile

Metabolite number/YM758

Excretion rates of metabolites (% of dose)

Urine

0-24 h Bile

0-24 h

Mixture of R1 and R2 NC 9.07

R3 1.39 NC

R4 1.98 NC

R9 0.90 NC

R10 2.15 19.99

Mixture of R14 and R16 NC 11.41

Mixture of R17, R18 and R19 N/A 13.67

Sole R19 1.24 N/A

YM758 1.52 NC

NC: not calculated because of the trace amount or undetectable metabolite N/A: not aplicable

第2節マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルにおける血漿中代謝物の同定

マウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルにおいて、YM758を経口投与後の血漿中代謝物を選択的反応モニタリング法 (SRM) によって測定したところ、ヒトでの結果と同様に4 種の代謝物 [R3 (YM-385459)、R4 (YM-252124)、R8 (YM-385461)および R16

(AS2036329)] が検出された (Figure 8)。以上より、ヒト血漿中代謝物は全て毒性試験動物

種においても暴露されていると考えられた。

(18)

13

Mouse

Rat

Rabbit

Dog

Monkey

Authentic sample (YM-385459)

(a) SRM chromatogram of R3

Mouse

Rat

Rabbit

Dog

Monkey

Authentic sample (YM-252124) (b) SRM chromatogram of R4

Mouse

Rat

Rabbit

Dog

Monkey

Authentic sample (YM-385461) (c) SRM chromatogram of R8

Mouse

Rat

Rabbit

Dog

Monkey

Authentic sample (AS2036329)

(d) SRM chromatogram of R16

Figure 8. SRM chromatograms of R3 (a), R4 (b), R8 (c) and R16 (d) in plasma samples collected from mice, rats, rabbits, dogs and monkeys after a single dosing of YM758, and authentic samples of those metabolites

(19)

14 第3節ラット代謝物の構造解析

ラット尿および胆汁から精製された13種の代謝物の構造を核磁気共鳴分光計 (NMR) により明らかにした (Table 2). 代謝物の分子量および構造をTable 3に示す。

Table 2. ¹H and ¹³C-NMR assignment for YM758 monophosphate and its metabolites isolated from rat urine and bile samples

YM758 R1 R2 R3 R4 R8

Position δH δC δH δC δH δC δH δC δH δC δH δC

Basic structure of unchanged drug

1 - 166.5 - ND - ND - - - - - 167.0

2, 6 7.20 116.5 7.20 116.4 7.21 116.5 - - - - 7.19 116.0

3, 5 7.97 131.3 7.90 131.1 7.91 131.0 - - - - 7.91 131.0

4 - 131.4 - ND - ND - - - - - 132.0

7 - 169.8 - ND - ND - - - - - 169.0

9 3.80 36.0 3.65

3.70

36.8 3.60 37.0 - - - - 4.05 43.0

10 3.29 58.1 3.04 58.3 2.90 ND - - - - - ND

12 3.27

3.31

54.2 4.65 4.75

47.8 48.1

4.57 4.64

48.0 3.36 3.46

44.5 3.23 47.0 - -

13 3.52 37.5 2.90 ND ND ND 3.27 37.0 3.27 36.5 - -

14 1.72

2.01

26.3 1.72 1.93

27.0 1.77 1.97

ND 1.94

1.98 2.03

25.0 1.72 1.92

26.5 - -

15 1.93

2.06 22.7 1.86

1.91 23.5 1.85 ND 2.43 31.0 1.83 22.0 - -

16 3.16

3.42

55.5 55.6

3.17 3.31

54.7 3.10 3.18

55.0 56.0

- 174.5 3.08 3.18

45.0 - -

17 - 173.2 - ND - ND - 173.5 - 174.0 - -

18 4.52

4.62 4.67 4.72

45.2 48.2

4.17 5.11

45.0 4.29 4.96

45.0 4.59 4.63 4.71

45.5 48.2

4.56 4.65 4.64

45.0 48.0

- -

20 3.78

3.80 3.71 3.79

41.7 44.8

3.61 4.06

51.5 3.66 3.95

51.5 3.78 3.80

42.0 44.5

3.74 3.77

44.5 42.0

- -

21 2.75

2.87

28.7 30.1

4.70 67.0 4.70 67.0 2.77 2.87

29.0 30.0

2.76 2.86

29.0 30.0

- -

22 - 127.6

128.1

- ND - ND - 127.0

128.0

- 128.0 - -

23 6.73

6.74 113.1 113.2 6.96

7.01 113.5 112.7 6.98

7.01 113.0

112.5 6.75 113.0 6.74 113.0 - -

24 - 149.4

149.5 - ND - ND - 150.0 - 150.0 - -

25 - 149.5

149.7 - ND - ND - 150.0 - 150.0 - -

26 6.71

6.83

111.1 6.74 6.80

110.2 110.1

6.75 6.80

110.1 110.0

6.75 111.0 6.73 6.79

111.0 - -

27 - 126.0

126.1

- ND - ND - 126.0

127.0

- 126.0 - -

29 3.79 56.6 3.82 56.6 3.81 56.5 3.80 56.5 3.79 56.5 - -

31 3.79 56.6 3.83 56.6 3.82 56.5 3.80 56.5 3.79 56.5 - -

(20)

15 Table 2. (Continued)

ND: not detected, -: not applicable

R10 R11 R16 R17 R18 R19 R20 R21

Position δH δH δH δC δH δC δH δH δC δH δH

Basic structure of unchanged drug

1 - - - ND - ND - - 164.0 - -

2, 6 - - 7.19 116.0 7.15 116.0 7.23 7.27 115.7 7.22 7.22

3, 5 - - 7.89 131.0 7.89 131.0 7.90 7.95 130.5 7.94 7.91

4 - - - ND - ND - - 131.9 - -

7 - - - ND - ND - - 165.0 - -

9 - - 3.61

3.68

37.0 3.74 36.0 3.67 3.34 37.7 ND ND

10 - - 2.91 58.0 3.30 ND 3.0-3.4 2.40

2.45 57.8 ND ND

12 3.11

3.19 3.10 3.24 2.58

3.15 57.0 3.36 58.0 3.0-3.7 2.00

2.76 56.6 ND ND

13 3.24 3.15 3.15 39.0 3.10 ND ND 2.20 43.0 ND ND

14 1.72

1.97 1.75 1.92 1.61

1.81 ND 1.72

1.93 26.0 1.85 or 1.94 1.30

1.59 27.6 ND ND

15 1.82

1.88 1.86 1.81 ND 1.93 23.0 1.37

1.55 24.9 ND ND

16 3.02

3.11 3.25

3.04 3.10 3.16

2.58 3.15

57.0 3.36 58.0 3.0-3.7 1.93 2.69

54.0 ND ND

17 - - - ND - ND - - 181.5 - -

18 4.51

4.57

4.55 4.59 4.68

45.5 48.0

4.47 4.59

45.0 48.0

4.72 - 173.8 4.49

4.67 4.60

20 3.63

3.71 3.80

3.65 3.78 3.72

3.73 42.0 45.0 3.55

3.82 42.0 3.63

4.02 3.24 42.1 3.70

3.74 ND

21 2.78

2.85 2.76 2.81

2.73 2.83

29.0 2.78 28.0 ND 3.00 32.8 2.73

2.81 ND

22 - - - ND - ND - - ND - -

23 6.79

6.80 7.00 7.02

7.01 7.03

118.0 6.74 6.78

114.0 7.03 7.09

6.71 114.1 7.21 6.81

24 - - - ND - ND - - 150.0 - -

25 - - - ND - ND - - 146.8 - -

26 7.02

7.04 6.78 6.81 6.76

6.83 112.0 6.94

7.05 115.0 7.29

7.32 7.27 114.1 6.74 7.28

27 - - - ND - ND - - 130.0 - -

29 - 3.83 3.82 57.0 - - - 3.71 56.0 3.78 -

31 3.82

3.83

- - - 3.80 57.0 3.84 3.75 56.0 - 3.80

Glucuronic acid

1’ 4.93 4.92 4.84 103.0 4.99 103.0 - - - - -

2’, 3’,

4’, 5’ 3.51 3.54 3.80

3.52 3.73

3.50 3.50 3.50 3.70

74.0 78.0 77.0

3.55 3.55 3.55 3.74

75.0 75.0 77.0 77.0

- - - - -

6’ - - - ND - ND - - - - -

(21)

16

Table 3. Nominal mass, mass shifts from YM758 and proposed chemical structures

N/A: not applicable Glu: glucuronic acid

Metabolite No. or YM758

Nominal mass

Mass shift

(unit) Estimated chemical structure

R1 and R2 485 +16 ^N _N

H F

O O

O N

O OH

N N

H F

O O

O N

O OH and

R3

(YM-385459) 318 -151 ^NH

O O

O N

O

R4

(YM-252124) 304 -165 ^NH

O

O N

O

R8

(YM-385461) 197 -272 ^N_H

F O O H

O

R9

(YM-234903) 294 -175 ^N ^N_H

F O O

O H

R10 466 -3 ^NH

O

GluO N

O

R11 466 -3 ^NH

GluO

O N

O

R16

(AS2036329) 631 +162 ^N ^N_H

F O O

Glu

O N

O

R17 631 +162 ^N ^N_H

F O O

GluO N

O

R18 551 +82 ^N _N

H F

O O N

O O

OH HO₃S

R19 501 +32 ^N_H

F O N O

O

O N O

H O

R20 535 +66 ^N _H^N

F O O

HO₃S

O N

O

R21 535 +66 ^N ^N_H

F O O

HO₃SO N O

YM758 469 N/A ^N ^N_H

F O O

O N

O

(22)

17

YM758はメチレンの酸化および加水分解を経てR4およびR8を生成し、R4はさらに酸

化、脱メチル化およびグルクロン酸抱合を受け、R3、R10およびR11を生成すると考えられた。また、YM758は脱メチル化後にグルクロン酸抱合および硫酸抱合を受けることも判明した（R16、R17、R20およびR21）。R1およびR2は21位の水酸化体であると考えられ、NMR分析の結果より水酸基の立体異性体（ジアステレオマー）であると推定された。

ラットにおけるYM758の代謝経路をFigure 9に示す。

R17 R10

R3 (YM-385459)

R1, R2 YM758

R11 R19

R9 (YM-234903)

HO₃S

R18 HO₃S

R20

R21 R16

(AS2036329)

R8 (YM-385461) R4

(YM-252124)

Glu: glucuronic acud O-demethylation

glucuronidation

Oxidation

Oxidation Oxidation

Oxidation Hydration

Hydration

Hydration O-demethylation

O-demethylation O-demethylation

glucuronidation

O-demethylation

sulfation

sulfation Oxidation

Figure 9. Metabolic pathways of YM758 in rats

(23)

18 第4節小括

本研究の結果より、ラットにおけるYM758の主な代謝経路は水酸化（R1およびR2の生成）、酸化および加水分解（R3、R4、R8およびR19の生成）、アミド結合の加水分解（R9 の生成）、脱メチル化ならびにグルクロン酸抱合および硫酸抱合（R10、R11、R16-R18、R20 およびR21の生成）であると考えられ、ヒトにおける主代謝物 [YM-385459 (R3)、YM-252124 (R4)、YM-385461 (R8)、YM-234903 (R9) およびAS2036329 (R16)]³³ は全て生成することが分かった。

また、ヒト血漿中に存在するYM758の代謝物 R3、R4、R8およびR16は、毒性試験動物であるマウス、ラット、ウサギ、イヌおよびサルの血漿において検出されることが判明し、

毒性試験動物における代謝物の安全性を担保するための重要な知見となった。今回の研究では定量的なデータは取得されておらず、この後、上記代謝物の暴露量に関するデータを取得する予定であったが開発中止に伴って研究を中止した。

YM758に限らず、創薬および医薬品開発における代謝物関連の研究データは膨大で、多

くのリソースが費やされている。また、前述したようにFDAおよびICHから代謝物の安全性に関するガイドラインが作成されており、早期における代謝物に関する研究データの取得はますます重要であり、今後の効率化が課題となっている。

(24)

19

第3章 PXBマウスを用いたヒト代謝物の予測

本項では、PXBマウスにおけるヒト血漿中代謝物の予測成功例および失敗例を比較し、

予測性に寄与する因子について検討した。本検討で使用した化合物Aおよびアモスラロールのヒトにおける代謝経路をFigure 10および11に示す。

Figure 10. ヒトにおける化合物Aの主代謝経路

Figure 11. ヒトおよびマウスにおけるアモスラロールの主代謝経路

化合物Aはアステラス製薬で開発中の医薬候補化合物 (フリー体分子量396) である。

この化合物はヒトにおいて主に代謝物H1からH4に代謝される (Figure 10)。そのうち、H1 はマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、サルでは生成されず、痕跡量のみマーモセットの血漿中に検出されるヒト特異的代謝物である²⁵。また、この代謝物はヒト肝細胞を用

(25)

20

いた代謝物検索において検出されていない。アモスラロールはαおよびβ受容体の拮抗薬であり、マウスとヒトで代謝経路が異なり、マウスではM-2 glucuronideが主代謝物として尿中に排泄されるが、ヒトではM-3 sulfateのみが尿中に排泄されることが知られている（Figure

10）^34,35。本検討では、これらの化合物を評価化合物としてPXBマウスにおける代謝プロフ

ァイルを検討した。

第1節 ICRマウス、PXBマウスおよびヒトにおける化合物Aの代謝に関する検討

ICRマウス、PXBマウスおよびヒトに化合物Aを経口投与した時のUVおよび抽出イオンクロマトグラムをFigure 12に示す。

Figure 12. ICRマウス (a)、PXBマウス (b) およびヒト (c) に化合物Aを投与したときの血漿のUVクロマトグラム (i) およびヒト特異的代謝物H1の抽出イオンクロマトグラム (ii, m/z 413 from 589)

ICRマウスおよびPXBマウスの血漿中から、代謝物H2-H4が検出された。しかしながら、ヒト特異的代謝物H1はPXBマウスでのみ検出された。以上より、化合物Aの代謝には、PXBマウスのヒト肝細胞が寄与していると考えられた。

(26)

21

第2節 uPA/SCIDマウスおよびPXBマウスにおけるアモスラロール代謝物の定量

アモスラロールを経口投与後のuPA/SCIDマウスおよびPXBマウスの尿中に、代謝物 M-2 glucuronideおよびM-3 sulfateを含む、代謝物M1からM6が検出された (Table 4)。マウスにおける代謝プロファイルと同様に、uPA/SCIDマウスにおいてはM-2 glucuronideが主代謝物であり、M-3 sulfateがマイナー代謝物であった。しかしながら、PXBマウスにおいても、

M-2 glucuronideが検出されており、M-3 sulfateの排泄率はuPA/SCIDマウスと同等であった。

また、各代謝物の排泄率には有意な差は認められなかった。以上より、アモスラロールの代謝プロファイルにおいては、PXBマウスとヒトで乖離すると考えられた。

(27)

22

Table 4. Excretion of amosulalol and its metabolites in urine after a single oral administration of amosulalol hydrochloride to uPA/SCID, and PXB mice

Mouse Metabolite

Concentration (μmol/L) % of dose

Unconjugated Glucuronide Sulfate Unconjugated Glucuronide Sulfate

uPA/SCID mice

Amosulalol 19.6 0.167 0.100 15.70 0.10 0.11

M1 1.20 0.505 0.151 0.91 0.41 0.14

M2 1.57 7.94 0.0533 1.23 6.55 0.05

M3 0.987 3.78 1.42 0.79 3.10 1.25

M4 0.351 4.81 0.0207 0.28 3.91 0.02

M6 0.159 1.21 0.000333 0.13 1.01 0.00

PXB mice

Amosulalol 11.9 0.00 0.400 10.06 0.00 0.38

M1 1.01 0.218 0.0740 0.85 0.20 0.07

M2 0.694 3.31 0.0507 0.58 2.78 0.05

M3 0.443 2.18 1.60 0.37 1.84 1.32

M4 0.212 2.85 0.0784 0.18 2.37 0.07

M6 0.0438 0.379 0.00347 0.04 0.31 0.00

(28)

23 第3節小括

化合物Aにおいて、PXBマウスがヒト代謝予測のツールとして有用であることを示唆する結果が得られた。特に代謝物H1はヒト肝細胞では生成が認められていないヒト特異的代謝物であり、PXBマウスによりヒト特異的代謝物を正確に予測できることは医薬候補品の開発上大きな利益になると考えられた。また、これまでにPXBマウスによりデブリソキン、

(S)-ワルファリンでもヒト代謝予測が可能であったという報告がある^27,36。一方で、プロプ

ラノロールやアモスラロールのような化合物では、PXBマウスとヒトで代謝プロファイルに乖離が認められている²⁸。乖離の原因をPXBマウスに薬物を経口投与した時の生理学的薬物速度論モデル (Figure 13) で考察した。

Figure 13. PXBマウスにおける生理学的薬物速度論モデル

ここで、PXBマウスにおける肝クリアランス (CLH, PXB) は次式で示される。

CLH,PXB = R∙CLH,human + (1-R)∙CLH,mouse

=

^R∙Q_Q ^PXB^∙f^B^∙CL^Hint,human

PXB + f_B∙CL_Hint,human

+

^(1-R)∙Q_Q ^PXB^∙f^B^∙CL^Hint,mouse

PXB + f_B∙CL_Hint,mouse

この式において、アモスラロールのようにIn vivoクリアランスがマウスでヒトよりも高値を示すもの（ICRマウス: 10.7 L/h/kg、ヒト: 0.1 L/h/kg）においては、次式に簡略化される。

CLH,PXB = R∙fB

∙

^CLHint,human + (1-R)∙QPXB

(QPXB ≫ fB

∙

CLHint, human, QPXB ≪ fB

∙

CLHint, mouse)

(29)

24

このような式で表される化合物においては、残存マウス肝による代謝が支配的に働き、

ヒト代謝予測が困難となると考えられた。さらに、マウス小腸での代謝の寄与も考慮すべきと考えられた。

PXBマウスを用いることで、ヒト代謝プロファイルならびにヒト特異的代謝物の存在を早期に予測できれば、開発候補品の選出や開発戦略において大きな利益をもたらすことができる。化合物Aのように、in vitro代謝実験では認められないヒト代謝経路についても、PXB マウスを用いることで早期に知ることができるようになり、より高質なヒト代謝プロファイルの予測ができるようになると考えられた。一方で、アモスラロールのような化合物例もあることから、残存するマウス小腸および肝臓に由来する代謝酵素の影響は常に念頭におき、

マウスおよびヒトにおける薬物動態パラメータを考慮しながら総合的に判断する必要がある。

(30)

25

第4章 uPA/SCID マウス、SD ラット、PXB マウスおよびヒトにおける ASP015K の代謝に関する研究

ASP015K (Figure 14) は非受容体型チロシンキナーゼの一つであるヤヌスキナーゼ

(JAK) の阻害剤であり、アステラス製薬が開発を進めている医薬候補品である。本化合物の

ラットおよびヒトにおける薬物動態プロファイルは既に知られているが^37-40。その代謝物の構造は未だ不明であった。本項では、ASP015K代謝物の構造解析およびuPA/SCIDマウス、

SDラット、PXBマウスおよびヒトにおけるASP015Kの代謝の種差について検討した。

Figure 14. ASP015Kの化学構造 (*: ¹⁴C標識体における標識位置) 1

2

3 3a4 5 6 7 7a

8 9

10 1′

2′

5′

4′ 3′

6′ 7′ 8′

9′

10′

*

*¹⁴C-labeled position

(31)

26

第1節 SDラットおよびヒトにおけるASP015K代謝物の構造解析

SDラットの血漿、尿および胆汁ならびにヒトの血漿および尿をLC-MSにより分析したところ、13種の代謝物M1-M13が検出された（Table 5）。

Table 5. ASP015K代謝物の分子量および代謝様式

これらのうち、ラット胆汁およびヒト尿より単離した11種の代謝物 (M1およびM3-M12) の化学構造を、NMRにより明らかにした (Table 6)。代謝物M2については、ASP015K-5′

-O-sulfate合成標品との比較分析の結果、同一の化合物であると考えられた。M13について

は、生成量が少なく単離できなかったが、その分子量からジヒドロヒドロキシグルタチオン抱合体であると推定された。

以上より、M1-M13の構造はそれぞれ、M1: 7-N-methyl ASP015K-5′-O-sulfate、M2:

ASP015K-5′-O-sulfate, M3: 6′-hydroxy ASP015K、M4: 7-N-methyl ASP015K, M5:

ASP015K-7-N-oxide, M6: ASP015K-5′-O-glucuronide、M7:

(4′S)-4′-hydroxy-ASP015K-4′-O-glucuronide、M8: ASP015K-3-glutathione conjugate、M9:

7′-hydroxy ASP015K、M10: ASP015K-2-glutathione conjugate、M11: 7′-hydroxy ASP015K-7-N-glucuronide、M12: 6′-hydroxy ASP015K-5′-O-glucuronideおよびM13:

dihydrohydroxy ASP015K-glutathione conjugateであると考えられた。

ASP015K or Metabolite

Molecular weight

Mass shift from

ASP015K (da) Structure description

ASP015K 326 - unchanged form

M1 420 +94 7-N-methyl ASP015K-5′-O-sulfate

M2 406 +80 ASP015K-5′-O-sulfate

M3 342 +16 6′-hydroxy ASP015K

M4 340 +14 7-N-methyl ASP015K

M5 342 +16 ASP015K-7-N-oxide

M6 502 +176 ASP015K-5′-O-glucuronide

M7 518 +192 (4′S)-4′-hydroxy-ASP015K-4′-O-glucuronide

M8 631 +305 ASP015K-3-glutathione conjugate

M9 342 +16 7′-hydroxy ASP015K

M10 631 +305 ASP015K-2-glutathione conjugate

M11 518 +192 7′-hydroxy ASP015K-7-N-glucuronide

M12 518 +192 6′-hydroxy ASP015K-5′-O-glucuronide M13 649 +323 dihydrohydroxy ASP015K-glutathione conjugate

(32)

27

Table 6. ¹H and ¹³C-NMR assignment data in dimethylsulfoxide-d6 for ASP015K, and its metabolites

ND: not detected, -: not applicable

ASP015K Methyl conjugate Oxidized metabolites

M1 M4 M3 M5 M9

δ_H δ_C δ_H δ_C δ_H δ_C δ_H δ_H δ_C δ_H

pyrrolopyridine

1 12.48 - 1 - - - 11.44 10.13 - 11.44

2 7.39 125 2 7.18 137 7.48 ND 7.12 6.72 118 7.13 3 6.60 105 3 6.46 102 6.72 104 6.41 6.23 104 6.41

3a - 107 3a - 108 - 106 - - 97 -

4 - 153 4 - 149 - 150 - - 156 -

5 - 103 5 - 99 - 102 - - 88 -

6 8.52 137 6 8.33 135 8.61 140 8.36 8.48 ND 8.37

7a - 139 7a - 147 - 140 - - 138 -

CONH2 8 - 170 8 - 171 170 - - ND -

9 8.35

7.74 - 9 7.85

7.30 - 8.16

7.75 - 7.74

6.96 6.67 - 7.78 6.96 NH 10 11.15 - 10 10.25 - 10.99 - 10.11 12.22 - 10.45

adamantyl

1′ 2.20 34 1′ 2.23 ND 2.20 ND 2.06 2.13 35 2.24 2′ 4.28 57 2′ 4.21 ND 4.27 ND 4.10 4.10 56 3.97 3′ 2.20 54 3′ 2.23 ND 2.20 ND 2.02 2.13 35 2.24 4′ 1.91 1.72 44 4′ 2.06