卵黄Vitellinに関する研究 (第2報) : Vitellinよりホスホセリンの分離およびVitellin中のホスホセリン,セリン,プロリン,メチオニン含量について

一32一 _{食 物 学 会 誌 ・第26号}

卵 黄Vitellinに

関 す る 研 究(第2報)

Vitellinよ り ホ ス ホ セ リ ン の 分 離 お よ びVitellin中 の ホ ス ホ セ リ ン,セ リ ン,プ ロ リ ン,メ チ オ ニ ン 含 量 に つ い て

安

福

英

子

木

戸

詔

子

Studies

on the

Vitellin

of Yolk

(Part

2)

Separation

of Phosphoserine

and Contents

of Phosphoserine,

Serne, Prorine

and Methionine

in Vitellin

Hideko Yasufuku Syoko Kido

1.緒 言 1) 第1報 でVitellin中 の ア ミノ酸 含 量 の定 量 を行 な っ た 際,ア ミ ノ酸 自動 分 析 器 に よ り50㎝ カ ラ ム で 中 酸 性 ア ミノ酸 を 分 析 した 時,ア ス パ ラギ ン酸 の 前 部 に ニ ン ヒ ドリ ン反 応(+),リ ン反 応(+)の1つ の ピ ー クを 認 2」 め た 。Rapoportら も 卵 黄 か ら と り出 したVitellenic acidを2N-HCIで 処 理 して ・ミリウ ム塩 沈 殿 よ りセ リ ン と リンの 結 合 を 証 明 して お り,ま た カゼ イ ン中 の リ ン も,そ の%は セ リ ン と結 合 して い る と報 告 して い る が,セ リン と リン酸 が エ ス テ ル 結 合 した ホ ス ホ セ リン の 形 で は 分 離 ・定 量 され て い な い の で,そ の 分 離 を 試 み た 。 またVitellin中 の リンが す べ て セ リ ン と結 合 し て い る とす れ ば 理 論 上 の ホ ス ホ セ リ ン含 量 は2,89と な りわ れ わ れ の 得 た 結 果 よ りか な りの 差 を 生 じる。 し た が って,ホ ス ホ セ リン の定 量 に つ い て は6N-HCIで は 他 の ア ミノ酸 に 比 べ て 非 常 に 分 解 され や す い 性 質 の も の で あ る と考 え られ る の で,ホ ス ホ セ リン の定 量 法 に つ い て 検 索 し,理 論 値 に 近 い 値 を 得 た 。 そ の 他,外 そ う法 よ り含 量 を 算 出 して い た,セ リ ン,プ ロ リン, メチ オ ニ ンに つ い て も再 検 討 を 行 な つた の で 報 告 す る。 II.実 験 の 部 II-1実 験 方 法 II-1-I Vitellinよ り ボ ス ホ セ リ ン の 分 離 Vitellin 19に6N--HCI 100m1を 加 え,窒 素 ガ ス を 通 じな が ら4時 間 加 水 分 解 を 行 な っ た 後,減 圧 ア ル カ リデ シ ケ ー タ ー 中 でHCIを 除 去 し て,黒 褐 色 粉 末 を 得 た 。 これ を 蒸 留 水 で 溶 解 し,pH 1.5に 調 整 後20ml に 定 容 し 沖 過 す る 。 そ の2m1を 次 に 述 べ る カ ラ ム 展 開 の 試 料 と し た 。 精 製 し た ア ン バ ラ イ トIR-45(200∼ 400mesh)109をpH 3.0のHC1で 膨 潤 し た 後,カ ラ ム1(2×15㎝)に 充 て ん し,同HC 1で 充 分 洗 浄 後, 試 料 を 添 加,同HCIで 展 開 し,溶 出 液 が ニ ン ヒ ド リ ン 反 応(一)に な る ま で 溶 出 す る(樹 脂 上 部 に 褐 色 リ ン グ が 残 存)。 次 に0.1N-HCIで 展 開 を 行 な い,59つ つ フ ラ ク シ ョ ン コ レ ク タ 一で 分 取 し,ニ ン ヒ ド リ ンと リン の反 応 が(+)の 部 分,F. C. No.12∼15 (褐 色 リン グ溶 出)を 集 め 減 圧 濃 縮 を 行 な いHC1 を 除 去 した 。 この カ ラ ム 1処 理 後 の 分 画 試 料 を ア ミノ酸 自動 分 析 で 分 析 し てみ る と,図2一 ① の ご と く ホ ス ホ セ リ ン以 外 に 主 と して酸 性 ア ミノ酸 で あ る ア ス パ ラギ ン酸,グ ル タ ミン酸 の 小 さな ピ ー クが 混 在 す る のが 認 め ら れ た ので,さ らに カ ラ ム *本 学食 品学 研究室 IIを 使 用 して 精 製 を 行 な 図1ホ ス ホ セ リンの 分 離

昭和46年11月 (1971) った。 カラム Iと同様，アンパライト IR-4510gを pH2.5 の HCl膨潤したものをカラム 11に 充 て ん し 蒸 留 水 で洗浄後，カラムI処理後の分画試料をpH1.5に調整 した後吸着させ， pH 2.5の HClで展開し，溶出液の ニンヒドリン反応が(ー〉になるまで溶出させる。カラ ム Iと同様褐色リングがカラム上部に残存する。次に O.2N-HClで展開を行なし、，フラクションコレクター で5gづっ分取して，ニンヒドリン反応(+)，リン反応 (+)の部分， F.C. No.5， 6を得，減圧濃縮して HCl を完全に除去して粘着褐色物質を得た。この分画物質 は図2一⑧のごとくアミノ酸自動分析器で分析した結 2.0 1 .0 ① カラム IS主主里 E 4 3 0 0 0 川 町 説 J 事 0.2 0.1 30 60 ~O 120 1

，

0 180 日当向(帆同J 2.0 1.0 ② カ ラ ム 宜 主 旦 王 聖 0.

，

制 0-4 ポ 0.3 割 日 0.2 60 90 120 尚南("""") 150 I~O

。

l 図2 カラム処理後のホスホセリン クロマトグラフィー 1.0 - 33-果ホスホセリン部に1つのピークを認めた。 なおアミノ酸自動分析器で、50cmカラムを使用した場 合，ホスホセリンもホスホスレオニンもほとんど同位 置にピークを認めたので，次に述べるようにホスホセ リン，ホスホスレオニンを対照として同定を行なった。 11-1-11ホスセリンの同定 1 )酸加水分解 標品のホスホセリン，ホスホスレオニンと分離した 試料の混合試験をアミノ酸自分析器で分析したが，い ずれも 1つのピークしか得られなかった。またアミノ 酸により570mμ と 440mμ の吸光度の比が異なるので ホスホセリンとホスホスレオニンの吸光度比を比較検 討したが，あまり差がなかった。 後述のごとく， 6N-HClでホスホセリンを24時間分 解すればセリンに分解されることから， Vitcllin より 分離精製した粘着褐色物の一定量を 6N-HClで減圧 封管し， 1100_{Cで24時間分解を行なった後， HClを除} 去しアミノ酸分析を行なった結果図3 ①のように， セリン部に1つのピークを認めた。この酸分解液に標 品のセリンおよびスレオニンを加え，混合試験を行な った結果図3一⑧⑧のようにセリンと一致した。 2)薄層クロマトグラフィー 一般のアミノ酸についての薄層クロマトグラフィー については多くの文献が見られるが， リン酸とエステ ル結合したものについては少なし、。標品のホスホセリ ン，ホスホスレオニンおよびセリン，スレオニンを対 照として，シリカゲルGを用い蒸留水で吸着プレート を作り，種種の溶媒で展開したが，ホスホセリン，ホ スホスレオニンは原点よりほとんど移動しない。そこ で， リン化合物ではアルカリ吸着プレートを使用して いる場合が多いので，炭酸ナトリウムなどのアルカリ を混入して試みたが移動率が小さく， Mamgold らの 料 10ト⑧試料+Ser. 1.0卜⑧試料+Thr. ① 試 0.5' ~ 0.4 -誠 0・3 丞 0.2 0.5 ~ 04 -説 。3 'll! ￨ 且Z I 0.1 。￨ 0.5' l !!<l 0.4

-*

0.3 内 向 (mi九) 戸I、ー一一一ーナ一白一 時間(甘い札.) 90

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9D 前向

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1

1

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図3 Vitellinの24日寺間目安分解のホスホセリンクロマトグラフィー

一 34ー 食物学会誌・第26号 表1 アミノ酸の薄層クロマトグラフィ (Rf x 100) リ カ ゲ ノ レ 吸着プレート溶媒 展 開 液 67

I

59

I

68

I

68 3o I 34 I 55 1 55 2 3 1 5

I

2

I

31

8

1

48 1 50 I 60 I 61 50 1 54 I 60 1 62 ノ

タ心

メ ・ ・ ・お ム ・ ・ レ 2 ， / p h U ホ ( ロ水 ロ : ク ル レ ， J F ノ 、 j ノ タ 1 メ 1 / ︻ ¥ . f f 、 、 ム レ '/ ホ ロ ロ ク 10%硫酸 ンモニウム _{96%アルコール:水} (7 : 1) プロパノール:ギ酸:水 (20 : 1 : 5) 5 %硫酸 アンモニウム 96%アルコール:水 (7 : 1) 96%アルコール:水 (7 : 3) 10 ワ U F D 4 唖 F b A U F O ₅₈ 1 %硫 酸 アンモニウム

l

クロロホルム:メタノーノレ￨ :酢酸:水(25: 15 : 4 : 2)I 8 ι z n り F 同 U 96%アルコール:水 (7 : 1) 10%硫酸アンモニウムのシリカゲル吸着フ。レートを使 用したところ。表1に示すような Rf値を得た。その うち5 %の硫酸アンモニウムでシリカゲルGの吸着プ レートを使用し， 96%アノレコール:水(7:3)の溶媒で 展開したものが，ホスホセリン，ホスホスレオニンお よびセリン，スレオニンを対照として行なう場合，最 も適していると考えられる。 Vite11inより分離したホスセリンを試料(1) そのホ スホセリンの24時間酸分解物を試料(2)とし下記のごと く薄展クロマトグラフィーによる同定を行なった。 吸着プレート:シリカゲルG30gに5 %硫酸アンモ エウム溶液 60mlを加え， 0.25阻の吸着フ。レートを作 り1100

_C

_{で1時間乾燥し， 30分以上放置したものを用} L

、

T

こ。 5r t. .. I

•

2.

•

3

•

4- ₄

・

5

•

6

•

房、 占 .Spot 1.試料(1) 4. P-Thr・ -2.試 料(2) 3. P-Ser. 5. Ser. 6. Thr. 図4 アミノ酸の薄層クロマトグラフィー 展開溶媒・温度・時間:96%アルコール:水(7: 3)， 室温，

2

時間 呈色:0.3gのニンヒドリンを 100mlnーブ、タノール と3ml酢酸に溶解したものを噴霧し， 1100 Cで10分間 加熱。 結果:試料(1)Rf=0.50，試料(2)Rf=0.60 3)炉紙電気泳動 Vitellinより分離したホスホセリンを試料として水 平，液体冷却高圧泳動装置を使用して，次に示す条件 で行なった。 緩衝液:酢酸:ギ酸:水=15 : 5 : 80(pHl.9) 炉紙:東洋炉紙No.51(2x20佃)，正極より 5佃の 位置を原線とする。 泳 動 :75vjcm， 90分 呈色:0.2%ニンヒドリン水飽和ブタノール溶液を 噴霧し100o C，5分加熱 移動度:0.7佃 なお，標品のホスホセリン，ホスホスレオニンを対 表 2 アミノ酸の炉紙電気泳動の移動距離 〈佃〉 アミノ酸 pH 1.9 75vjcm 90分 試 料 P.Ser. P.Thr.

O

.

7

O. 7 1.9

- 35-恥1et. 110 123 173 135 Vitellin中の酸分解による アミノ酸の変化 (μmo

I

j

g Vitellin)

I

Pro.

I

表 4 Ser. 111 241 311 359 224 800 245 527 758 703 164 180 177 209 175 97 93 分解時間 / 乃 h ・ 9 “ 丹 、 usuτFapooo 噌 ・ 4 ， ↑﹁

1

1

1

1

1

1

1

昭和46年11

月

(1971) Ser. 429

3

3

1

1

尿点 865 I P-Ser.I 誌 料

i

アミノの酸

P

紙電気泳動 照として行ない表2，図 5に示す結果を得た。 11 -1 -11 Vitel1in 中のホスセリンの定量 図5 1)標品のホスホセリン， 解による残存率 ホスホセリンもホスホスレオニンも50佃カラムを使 用したアミノ酸分析器によるクロマトグラムは，ほぼ 同じ位置にピークを認める。そこで両者について 6N-HClを標品に対し200倍量加え封管して1l00 Cで分解し 時間経過によるホスセリン，ホスホスレオニンの残存 ホスホスレオニンの酸分 院。 Mtt ホスホセリン，ホスホスレオニンの 酸分解による残存率 表3 P-$er 2 4 6 分織防向 (hれ〉 百 (%) 分解時間 (hrr.) P.Ser

I

P-Ser Ser

I

P-Thr Vitellin中の酸分解によるアミノ酸の変化 率を検討し，表3，図 6に示す結果を得た。 2) Vitellin中のホスホセリンの弱酸および短時間 による分解 ホスホセリンは 6N-HCl では不安定なことから， Vitel1in を 1N，2N， 3N， 4N-HCl で分解して定量し たがあまり回収率はよくなかった。そこで6N-HClで 第7図のごとく， 8時間までの分解状態を検討し4時 間で最高値を得た。 以上の結果より Vitellin中のホスホセリンは， 6N-HClで 4時間加水分解を行なった定量値より Vitellin 100g中のアミノ酸残基に対する g数 を 算 出 す る と 2.6gとなっ Tこ。 II -1 -III Vitellin中のセリン， 図 7 Thr

。

内_J A υ 晶 U F b ( 守 、 u u 3.0 16.2 21. 7 100 92.4 100.4 90.5 67.2 10.6 29.7 47.6 44.6 49.3 52.5

。

41. 5 32.4 18.7 5.9 1.6 0 79.1 100 2 a 品 Z P 0 0 0 円 4 0 0 a せ 噌 i 唱 i ヮ “ O/21i 4 1 4_， メチオニ ンの定量 ホスホセリンの定量と同様， 6N-HClで 8時間まで の分解による変化を検討し図7のような結果を得， 時間で最高値を得た。 II-II実験結果および考察 (l)Vi tellin よりホスホセリンをアンバライト IR-45 を使用し分離精製を行ない粘着褐色物を得，その性状 をアミノ酸自動分析器や，薄層クロマトグラフィー， 8 プロリン， 24 -P-S.r ホスホセリン，ホスホスレオニンの 酸分解による残存率 p-T

.

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図6 19 12. 日寺向 ( hr守〉 百 4 2

- 36-電気泳動により実験した結果，ホスホセリンであるこ とを認めた。結品化を試みたが，微量成分である上に， セリンとリンが分離しやすく，結品化には至らなかっ た。 (の第

1

報で、得たホスホセリンの含量が理論値とかな りの差を認めるのでホスホセリンの定量法について 検討を行なった結果，表 3のようにホスホスレオニ ンは 6N-HClと加熱した場合， 8時間ではその残存 率が67.2%と比較的安定なのに対し，ホスホセリンは 18.7%となっていることから 6N-HClで Vitellinを 定量する場合，短時間によらなければならないことが 判明し， Vitellin中のホスホセリンは 4時間で最高値 を得，その結果ホスホセリン含量は2.6gとなった。 この値は理論値 2.8gより低い値となるが，セリンと 同様ホスホセリンは酸と加熱することにより非常に分 解されやすいので， 10%増の補正を加えると， 2.86g となり理論{直に近い値が得られる。 (3)ホスホセリンの他，第 1報で外そう法じよりアミ ノ酸含量を算出したセリン，プロリン，メチオニンに ついても， 6N-HClで短時間による分解を検討してみ たが，いずれも 8時間の分析値の方が高いと考えられ 表5 Vltellinのアミノ酸組成 (g!100g Vltellin) ア ミ ノ 酔

￨

たんぱく質100g中アミノ 問 ￨ 酸残基に対するg数 V A

y

a

q

山 σEhnp 仁 L H L 仏 子 み & L t n 比 比 仁

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h e I r -y a k e e T L H A P A T S G P G A C V M H L T P

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••

4 1 2 〆 t ¥ / S K / t ¥ 2 5 9 9 8 6 1 4 2 2 4 4 3 3 2 9 6 4 4

••••...••.•

-A Q U ワ h H Q U ワ臼 Q U S 笠 宮 U O V A 吐 ワ 白 A 吐 1 A 伊 b q d p b o O A せ A 吐 噌' A 合 計 99. 7 (99. 1) ( )は8時間酸分解値をとった場合 食物学会誌・第26号 る。したがってセリンについては8時間の値に補正を 加えた 8.4gとする方がよいのではないかと考える。 他のアミノ酸については.8時間の値をとれば， Vite -llin中のプロリン4.2g，メチオニン2.8gとなり，シ スチンの場合も 8時間の値から算出すれば1.1gとな る。 以上の結果より第1報で、得た Vitellin中のアミノ 酸含量を再検討することにより，第1報のアミノ酸の 中，ホスホセリンを4時間の分析値に約10%の補正を 加え， 2.8gとすると，全アミノ酸の回収率は100_1% となる。さらにセリンを8時間の値に10%補正を加え， 8.4gとすると 99.7%となり，シスチン，プロリン， メチオニン含量を外そう法によらず 8時間の値をとれ ば99.1%となり，よい回収率が得られた。 111 . 要 約 (l)Vitellinよりセリンとリンのエステル結合したホ スホセリンを分離した。 (2)Vitellinを短時間で酸分解することにより， 4時 間の分解値に10%補正を加え，理論値に近いホスホセ リン含量を得た。 (3)セリン，プロリン，メチオニンについても短時間 による酸分解による変化を検討した結果，セリンにつ いては8時間の分解値に10%補正した値をとる方がよ いものと考える。またシチスン，メチオニンについは 外そう法によらず8時間の値をとる方がよいと考える。 以上のように卵黄Vitellinを酸分解時間による各ア ミノ酸含量をアミノ酸自動分析器により定量を行ない， Vitellinのアミノ酸組成を検索し，表5に示すように 99"-'100%の回収率を得た。 本研究に対し御指導，御配慮、をたまわりました本学 名誉教授工藤豊先生に深謝します。 参 考 文 献 1)安福，木戸，本誌， 26. 27 (1971) 2) S. Rapoport， Biochem Z.， 289， 420 (1963"-'1937) 3) E. S. Perry， A. Weissberger， Technigue of Or

-ganic Chemistry， 12， 309， 438 (1967)

4) Kurt Randeratb， Thin-Layer Chromatography.，

110

，

159

，

170 (1966)

5) H.K. Mangold， R. Kammereck， J.Am. Oil Chemist's Soc.， 39， 201 (1962)