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慢性炎症に伴うエピジェネティクスとマイクロ RNA の異常による
消化器発がんの分子機構の解明と治療への応用
慶應義塾大学薬学部薬物治療学講座齋藤 義正
キーワード： エピジェネティクス，マイクロ RNA，胃がん AbstractmicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that function as endogenous silencers of target genes and play critical roles in human malignancies. We have recently shown that epigenetic activation of tumor suppressor miRNAs may be a novel therapeutic approach for human cancers. miRNA microarray analysis revealed that miR-29c was significantly downregulated in gastric cancer tissues relative to non-tumor gastric mucosae. Downregulation of miR-29c was associated with progression of gastric cancer, and was more prominent in advanced gastric cancers than in gastric adenomas and early gastric cancer (p<0.05). In addition, expression of the oncogene Mcl-1, a target of miR-29c, was significantly increased in gastric cancer tissues relative to non-tumor gastric mucosae. Activation of miR-29c by celecoxib induced suppression of Mcl-1 and apoptosis in gastric cancer cells. We also found that miR-142 and miR-155 were overexpressed in gastric MALT lymphoma lesions. The expression levels of miR-142-5p and miR-155 were significantly increased in MALT lymphomas with the API2-MALT1 fusion gene, which do not respond to Helicobacter pylori eradication. The expression levels of miR-142-5p and miR-155 were associated with the histological findings and the clinical courses of gastric MALT lymphoma cases. To identify epigenetically regulated miRNAs, we developed a novel miRNA promoter microarray for chromatin immunoprecipitation (ChIP)-on-chip assay. Using this custom-made miRNA promoter microarray, we successfully performed ChIP-on-chip assay to identify miRNAs regulated by histone modification. One of these miRNAs, miR-9, is downregulated in gastric cancer tissues and is activated by chromatin-modifying drugs, suggesting that it may be a potential target for epigenetic therapy of gastric cancer. These findings suggest that some specific miRNAs can be novel molecular markers and therapeutic targets of human cancers.
背景および目的
マイクロ RNA は 21-25 塩基程度の小さな非コード RNA（蛋白質に翻訳されない RNA）であり、1 つのマイク ロ RNA が 100 以上の標的遺伝子の発現を抑制的に制御していると推測されている。これらのマイクロ RNA は 組織特異的、発生段階特異的に発現しており、細胞の増殖、分化、アポトーシスなどに重要な役割を果たしてい る。一方、DNA メチル化阻害薬やヒストン脱アセチル化酵素阻害薬をがん治療に応用するエピジェネティック 治療が開始されており、DNA メチル化阻害薬である 5-aza-2-deoxycytidine（5-Aza-CdR）が骨髄異形成症候群の治 療薬として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬である suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA)が皮膚 T 細胞リンパ 腫の治療薬として承認され、臨床の現場でがん患者に投与され効果をあげている。我々はいくつかのマイクロ RNAの発現がプロモーター領域のメチル化およびヒストン修飾の状態によって制御されていることを発見し、
し得ることを報告した。さらにエピジェネティックな処理によって最も高い上昇を認めたマイクロ RNA である miR-127はがん遺伝子である BCL6 を標的の一つにしていることが確認された。マイクロ RNA が発がんに関す る重要な遺伝子を標的としていることが示唆され、DNA メチル化阻害薬やヒストン脱アセチル化酵素阻害薬な どを用いたエピジェネティック治療ががん抑制マイクロ RNA の発現誘導を介して抗腫瘍効果を発揮し、がんの 新たな予防・治療戦略となることが期待される。
これまでの多くの基礎および臨床研究から、Hellicobacter pylori (H. pylori)や肝炎ウイルスの持続感染および自 己免疫異常などによる消化管や肝臓の慢性炎症が消化器発がんの主な原因になると考えられている。慢性炎症 に伴う変化は後天的な修飾であり、エピジェネティクス異常が慢性炎症からの発がんにおいて重要な役割を果た していると考えられる。本研究では、消化器がん、特に胃悪性腫瘍の発生・進展に関与し、エピジェネティクス 変化によって制御されているマイクロ RNA を網羅的に探索し、胃悪性腫瘍の新たな診断・治療法の開発を目指 すことを目的とした。 方法 1. 胃悪性腫瘍の発生・進展に関連したマイクロ RNA の探索 胃腫瘍性病変（胃腺腫 8 例、早期胃がん 22 例、進行胃がん 23 例、胃 MALT リンパ腫 15 例）の患者より充分 なインフォームド・コンセントを得て病変組織ならびに正常粘膜組織を採取し、マイクロ RNA の発現変化をマ イクロアレイおよび定量的 PT-PCR によって網羅的に解析した。有意な発現変化のみられたマイクロ RNA につ いては臨床情報との相関を解析し、その標的遺伝子についても検討を行った。 2. マイクロ RNA プロモーターアレイによるエピジェネティクス変化により制御されているマイクロ RNA の同 定 英国サンガー研究所のデータベース（http://microrna.sanger.ac.uk）の情報をもとにマイクロ RNA のプロモータ ー領域を想定し、それらの配列を搭載した DNA マイクロアレイを独自に開発した。胃がん細胞株 AGS を DNA メチル化阻害薬 5-Aza-CdR およびヒストン脱アセチル化阻害薬 4-Phenylbutyric acid（PBA)にて処理し、アセチル 化ヒストン H3 抗体およびメチル化ヒストン H3 リジン 4 抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）とマイクロ アレイ解析を組み合わせた ChIP on chip 解析を行った。これらの検討から、エピジェネティクス変化によって制 御されている胃がん関連マイクロ RNA の同定を試みた。 結果 1. miR-29c発現の低下と胃がんの進展との相関 我々はマイクロアレイによるマイクロ RNA 発現の網羅的解析により、miR-29c 発現が非がん胃粘膜に比べ胃が ん組織において有意に低下していることを見出した。さらに、図 1 に示すように、miR-29c 発現が前がん病変の 胃腺腫から早期胃がんへと進行する過程で低下し、進行胃がんでは早期胃がんよりも顕著に miR-29c 発現が低下 することを確認した。さらに miR-29c の標的遺伝子の一つである Mcl-1 の発現が進行胃がんにおいて上昇して おり、miR-29c の発現低下が Mcl-1 を活性化して胃発がんに重要な役割を果たしていることが考えられた。また、 AGS細胞に選択的 COX-2 阻害薬である celecoxib を投与したところ、miR-29c の有意な発現上昇を認め、標的遺
図 1．miR-29c 発現の低下と胃がんの進展との相関
miR-29c発現が前がん病変の胃腺腫から早期胃がんへと進行する過程で低下し、進行胃がんでは早期胃が んよりも顕著に miR-29c 発現が低下することを確認した。
2. MALTリンパ腫における miR-142-5p および miR-155 の発現変化と除菌治療の反応
胃 MALT リンパ腫では、その発症・増殖に H. pylori が深く関与していることが明らかになっている。約 70％ の症例で H. pylori 除菌治療により胃 MALT リンパ腫の寛解を認めるが、病変部において API2-MALT1 キメラ遺 伝子が存在すると、H. pylori 除菌治療による効果が低いことが報告されている。胃 MALT リンパ腫に関しても同 様にマイクロ RNA 発現プロファイルを解析したところ、API2-MALT1 キメラ遺伝子を伴い H. pylori 除菌治療に 抵抗性の胃 MALT リンパ腫において miR-142 および miR-155 の発現が著明に上昇していた。また、図 2 に示す 通り、除菌治療に対して完全寛解（complete remission: CR）を示したグループに比べ、除菌治療抵抗性（no change: NC）であったグループにおいては miR-142 および miR-155 の発現が有意に上昇していた。さらにこれらのマイ クロ RNA の標的遺伝子である TP53INP1 の発現抑制を認めた。miR-142 は造血系細胞特異的マイクロ RNA であ り、miR-155 は腫瘍特異的マイクロ RNA であることが報告されている。miR-142 および miR-155 の過剰発現が癌 抑制遺伝子である TP53INP1 の発現抑制を介して API2-MALT1 陽性胃 MALT リンパ腫発生の一因となっている ことが示唆された。
図 2．MALT リンパ腫における miR-142-5p および miR-155 の発現変化と除菌治療の反応
H. pylori除菌治療に対して完全寛解（complete remission: CR）を示したグループに比べ、除菌治療抵抗性 （no change: NC）であったグループにおいては miR-142 および miR-155 の発現が有意に上昇していた。
3. ChIP on chip解析によるエピジェネティクス変化により制御されているマイクロ RNA の同定
独自に開発したマイクロ RNA プロモーターアレイを用いた ChIP on chip 解析を行った。ChIP on chip 解析に て、アセチル化ヒストン H3 およびメチル化ヒストン H3 リジン 4 の有意なシグナル上昇を認め、かつ CpG アイ ランドを有している 22 のマイクロ RNA を同定した。今回の解析により同定されたエピジェネティクス変化に より制御されているマイクロ RNA の候補の中で、転移性がんや乳がんにてがん抑制マイクロ RNA として機能す ることが報告されている miR-9 に特に注目した。胃がん臨床検体を用いた検討においては、miR-9 発現が非がん 胃粘膜に比べ胃がん組織で有意に低下していた。さらに胃がん細胞株を 5-Aza-CdR および PBA で処理すること により miR-9 の著明な発現上昇を認めた。 考察
マイクロ RNA は長さ 21-25 塩基程度であるために非常に安定性が高く、メッセンジャー RNA よりもマイクロ RNAの発現プロファイルが鋭敏に腫瘍の状態を反映していることが報告されている。臨床内科医や病理医が判 定困難な早期胃がんの診断や再発の有無、進行胃がんの悪性度や転移・予後をマイクロ RNA 発現プロファイリ ングで予想出来ることが期待される。早期診断や病期決定につながる簡便かつ鋭敏な分子マーカーを構築する ことで、患者の再発予防、QOL の改善、医療費のコスト削減を目指したい。さらに、マイクロ RNA は内在性の siRNAとも考えられており、国内外でがん治療薬の新たな標的として大きな注目を集めている。エピジェネティ ック治療により元々生体に存在するマイクロ RNA の発現を制御することから、従来の外来性 siRNA などを用い た遺伝子治療よりも安全性の点で格段に優れていると考えられる。さらに一つのマイクロ RNA が複数の標的遺 伝子を抑制するため、相乗的抗腫瘍効果が期待できる。本研究の成果が現行の化学療法でも効果の得られない進 行胃がんに対する新たな治療戦略につながることが期待される。 発表論文・参考文献
1） Sato A, Saito Y, Sugiyama K, Sakasegawa N, Muramatsu T, Fukuda S, Yoneya M, Kimura M, Ebinuma H, Hibi T, Saito H. Suppressive Effect of the Histone Deacetylase Inhibitor, Suberoylanilide Hydroxamic Acid (SAHA), on Hepatitis C Virus Replication via Epigenetic Changes in Host Cells. J Cell Biochem. 2013 (in press).
2） Saito Y, Suzuki H, Imaeda H, Matsuzaki J, Hirata K , Tsugawa H, Hibino S, Kanai Y, Saito H, Hibi T. The tumor suppressor microRNA-29c is downregulated and restored by celecoxib in human gastric cancer cells. Int J Cancer 2013; 132(8): 1751-60.
3） Saito Y, Suzuki H, Tsugawa H, Imaeda H, Matsuzaki J, Hirata K, Hosoe N, Nakamura M, Mukai M, Saito H, Hibi T. Overexpression of miR-142-5p and miR-155 in gastric mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma resistant to Helicobacter pylori eradication. PLoS ONE 2012; 7(11): e47396.
4） Saito Y, Suzuki H, Taya T, Nishizawa M, Tsugawa H, Matsuzaki J, Hirata K, Saito H, Hibi T. Development of a novel microRNA promoter microarray for ChIP-on-chip assay to identify epigenetically regulated microRNAs. Biochem Biophys Res Commun. 2012; 426(1): 33-7.
5） Saito Y, Saito H. Role of CTCF in the regulation of microRNA expression Front Genet. 2012; 3: 186. 6） Saito Y, Saito H. MicroRNAs in cancers and neurodegenerative disorders. Front Genet. 2012; 3: 194.
