Gから硫化水素が再生されなくてはならない.本研究では, G-SSS-Gから硫化水素再生の化学的反応について検討を 行った. 【材料と方法】 G-SH,G-SS-G,G-SSS-G,G-SSH,G-SSSH,G-SS-NACの 離 析は,オルトフタルア ルデヒドを検出試薬に用いたポストカラム誘導体化逆相 HPLCを用いて 行った.【結 果】 G-SSS-Gに N-ア セ チルシステイン (NAC)を作用させると,G-SSS-Gの初期 濃度を超える濃度の G-SS-NACが生成された.しかし,酸 化型グルタチオンの生成は認められなかった.このことか ら, SSS-G＋NAC-SH→ SSH＋SS-NACと G-SSH＋NAC-SH→ H2S＋G-SS-NACの S-S 換 反 応 が 起きていることが明らかとなった.また,S転移反応は認め られなかった.【 察と結語】 以上より,硫化水素はチ オール存在下で持続的なラジカルスカベンジャーとして機 能することが明らかとなった. 21．グルコース感知受容体の 子実体の解明：CaSRノッ クアウト細胞を用いた検討 中川 祐子 ，ヨハン メディナ ，藤谷与士夫 小島 至 （１ 群馬大・生調研） （２ クイーンズランド大学） 【背景と目的】 我々は膵 β細胞にグルコース感知性受 容体 (GSR)が発現し,グルコース作用に関与することを報 告 し て き た. GSRの 子 実 体 を 明 ら か に す る た め に HEK293細胞を用いて,様々な Cタイプの Gタンパク質 共役受容体 (GPCR)を発現させ,グルコースによって活性 化される GPCRを探索した.その結果,Calcium Sensing Receptor(CaSR)がグルコースによって活性化されること を報告した.興味あることに,CaSRが生体内で機能するこ とが既に良く知られている副甲状腺や腎尿細管由来の培養 細胞 MDCKや PT-rでも,グルコースによって CaSRが活 性化されることが かった. しかし, 膵 β細胞において CaSRがグルコースによって活性化されるか否かは明らか ではない.そこで,本研究では,膵 β細胞においても CaSR がグルコースによって活性化され,グルコース応答性イン スリン 泌に関与するか否かを明らかにする.【材料と方 法】 膵 β細胞の株である MIN6細胞を用いた.CRISPR/ Cas法により CaSRをノックアウトした細胞を作製した. 細胞内 Ca 濃度 (［Ca ］)をモニターするために,Fluo-8 を用いた.【結 果】 MIN6細胞における CaSRの機能 を解明するために CaSRをノックアウトした細胞を作製 した.クローン化した 9つのクローンのうち 2つのクロー ンで CaSRの発現が消失した.またこのクローンは,CaSR の Negative allosteric modulatorである Cinacalcetによる 効果が無くなっていたことから,このクローンにおいては CaSRの機能も消失していることが えられた.このク ローンを CaSRノックアウト細胞 (casr細胞)とし,以下の 検討を行った.MIN6細胞では,グルコースの濃度依存的に ［Ca ］が変化するが,casr細胞では,グルコースの濃度依 存性が低下した.しかし,高濃度の KClによる［Ca ］の変 化はコントロール細胞と同様であった.また,casr細胞に CaSRを発現させることにより,低下したグルコース誘発 性 Ca 応答の低下が回復した.【 察と結語】 MIN6細 胞では, グルコースの濃度依存的に Ca 応答を示すが, casr細胞では濃度依存性が消失した.しかし,高濃度 KCl 誘導性 Ca 応答はコントロール細胞と同程度であったこ とから,この変化は電位依存性 Ca 透過チャネルに依存し たものでないことが えられた.casr細胞に CaSRを強制 発現させることによりこの表現型が回復したことから,グ ルコース濃度依存性の低下は CaSRによるものであると えられた.以上の結果から,膵 β細胞において CaSRは グルコースの濃度依存的に Ca シグナルを発生させる経 路を制御する可能性が えられる. 22．インスリンによる新奇脂肪蓄積機構の解明 歩 云，奥西 勝秀，泉 哲郎 （群馬大・生調研・遺伝生化学 野） 【背景と目的】 我々は,これまでに,主に成熟白色脂肪に 発現し脂肪蓄積作用を有する I型 TGF-beta受容体 ALK7 のリガンドとして,TGF-betaスーパーファミリーに属す る蛋白の一つ GDF3を同定した. に,この GDF3が,白 色脂肪組織中の CD11c＋マクロファージから産生される こと,及び,この GDF3の発現がインスリンにより誘導さ れることを,昨年度の本学会で報告した.一般にインスリ ンは脂肪細胞に直接作用して脂肪代謝を制御することが知 られているが,我々が見出した知見からは,インスリンが, マクロファージからの GDF3の産生を誘導し,その結果, 白色脂肪の ALK7経路の活性化を介して間接的に脂肪蓄 積を亢進させる可能性が えられた.そこで,このインス リン-GDF3-ALK7経路が脂肪蓄積に与える効果を検討し た.【材料と方法】 各種マウス (インスリン抵抗性を伴う 肥満・糖尿病モデル TSODマウス,TSODマウスに BALB/ c由来の ALK7の変異を導入した Congenicマウス,ALK7 が保たれている C57BL/6マウス,及び,ALK7変異を有す る BALB/cマウス)を用いて,マウスから単離したマクロ ファージや白色脂肪細胞を用いた ex vivoの実験や,個体 レベルでのin vivoの実験を行い,インスリン-GDF3-ALK7 経路が脂肪蓄積に及ぼす効果を検討した.【結 果】 イ ンスリンは,60pM という低濃度で,脂肪組織由来マクロ ファージにおける GDF3の発現を強力に誘導し,その培養 上清は,脂肪細胞の Smad3を活性化し,脂肪 解を強く抑 制した.一方,脂肪細胞に直接作用して脂肪 解を抑制す るためには,より高濃度のインスリンを必要とした.イン スリンの in vivo投与は脂肪蓄積を亢進させたが,その効果 は,クロドロネート投与によりあらかじめマクロファージ を除去したマウスや,ALK7変異マウスでは認められな かった.【 察と結語】 インスリンによる新たな脂肪蓄 ―271―
積の機序として,脂肪組織中のマクロファージと脂肪細胞 間で働く GDF3-ALK7経路が明らかになった.
23．Mechanism Underlying Clearance of Circulating FABP4 Suman Shrestha,Tatsuya Iso,
Hirofumi Hanaoka,Hiroaki Sunaga, Aiko Yamaguchi,Yoshito Tsushima and Masahiko Kurabayashi
（１ Department of Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine,Gunma Univer -sity Graduate School of Medicine） （２ Department of Cardiovascular Medicine,
Gunma University Graduate School of Medicine）
【Background& Objective】 Circulating Fatty acid bi nd-ing protein 4 (FABP4),secreted from adipocytes,is a potential biomarker for metabolic and cardiovascular dis -eases such as obesity,insulin resistance and acute myocar -dial infarction.Serum FABP4 levels are positively associat -ed with adiposity and adrenergic stimulation,but negatively with renal function.The purpose of this study is to clarify how kidney is involved in clearance of circulating FABP4 in mice.【Methods】 1) Bilateral and unilateral ne -phrectomy and sham-operated models were made in wil d-type mice.Before and 6,12 and 24 h after operation,blood sampling was done for measurement of serum FABP4 and biochemical parameters.2)Biodistribution of I125-labeled FABP4 was determined at 10 min,1,3 and 6 h after intravenous injection in wild-type mice.3)Serum and urine levels of FABP4 were measured in wild-type and megalin knockout mice.【Results】 1)Serum levels of FABP4 and creatinine were significantly higher in bilateral ne -phrectomy group than unilateral and sham-operated groups at any time point after operation.2)Remarkable accumula -tion of I125-FABP4 was seen in kidney 10 min after injec -tion and declined thereafter.3)A large amount of FABP4 was detected in urine in megalin knockout mice while little FABP4 was detected in wild-type urine.【Conclusion】 A significant increase in serum FABP4 in bilateral ne -phrectomy mice and remarkable and rapid accumulation of I125-FABP4 in kidney suggest an essential role of kidney in clearance of circulating FABP4. Clearance of circulating FABP4 in kidney is likely to be mediated by megalin,a giant membrane glycoprotein involved in reabsorption of many proteins in proximal tubular epithelial cells.
24．卵母細胞のmeiotic silencing of unsynapsed chromatin に必要なマウス HORMAD2のリン酸化と減数 裂にお ける対合不全チェックの 子機構 向後 寛，向後 晶子， 崎 利行 （群馬大院・医・生体構造学） 【背景と目的】 第一減数 裂前期に起こる相同染色体間の 組換えや対合は,正確な染色体の 配に必須であり,その 正常な進行を監視・保証するチェックポイント機構が存在 すると えられるが,哺乳類におけるそのメカニズムは不 明であった.これまでの Hormad2遺伝子ノックアウトマ ウスの解析により,哺乳類の卵母細胞において対合不全 チェック機構が存在することや, HORMAD2に依存する meiotic silencing of unsynapsed chromatin(MSUC)と呼ば れる現象がチェック機構に必要である可能性が示された. SPO11欠 損 に よ り 対 合 不 全 が 多 数 生 じ た 場 合, HOR-MAD2は非対合部 全体に 布するのに対し,MSUCは その一部にのみ形成される. この理由を解明することが MSUCや対合不全チェックの 子機構を理解する端緒に なると えた.【材料と方法】 HORMAD2依存的なMSUC が局所的に起こるメカニズムとして, その部位における HORMAD2の特異的なリン酸化が重要である可能性を想 定し,HORMAD2の2ヶ所のセリン (Ser284およびSer288) のリン酸化特異的抗体を作製し,野性型および SPO11欠損 マウス卵母細胞の染色体標本の免疫染色により解析した. 【結 果】 対合の正常な野生型卵母細胞では Ser284およ び Ser288のどちらのリン酸化も検出されなかった.一方, 対 合 不 全 を 生 じ た 野 性 型 卵 母 細 胞 で は 非 対 合 部 に MSUCが形成され,その染色体軸上に Ser284のリン酸化 が特に顕著に観察された. さらに SPO11欠損卵母細胞で は,非対合染色体軸上全体に HORMAD2が 布する一方, 観察されたほぼ全ての MSUC形成部位の染色体軸上に Ser284のリン酸化が観察された.一方 Ser288のリン酸化 は比較的大型の MSUCの一部でのみ観察された.【 察 と結語】 以上の結果は,HORMAD2の Ser284のリン酸 化が卵母細胞の MSUCの開始に必要である可能性を示し ており,対合不全チェックの 子機構を解明するために重 要な知見である.現在ゲノムリソースセンターとの共同研 究により,ゲノム編集によって Ser284をアラニンやアスパ ラギン酸に置換した変異体マウスを作製しており,これら の変異体マウスの表現型解析を行うことで HORMAD2の リン酸化の機能的意義を解明したい. ―272― 第 64回北関東医学会 会
