Tamaichi ASHIDA: Introduction to Protein Crystallography Introduction to elementary protein crystallography including items such as, features of prote

入門講座

_{タンパ ク質結 晶構 造解析 入門}

名古屋大学

芦 田玉一

Tamaichi ASHIDA: Introduction to Protein Crystallography

Introduction to elementary protein crystallography including items such as, features of protein crystals, crystallization of proteins, the heavy atom isomorphous replacement method, model building and refine-ment, and a brief history of proten crystallography, is presented.

X線 結 晶構 造 解 析 法 は タ ンパ ク 質 分 子 を何 等 の 仮 定 な し に 「直 接 高 分 解 能 で 見 る」 方 法 で あ り,今 日の タ ンパ ク質 お よ び核 酸 の 科 学 の 発 展 に 不 可 欠 か つ 最 大 の貢 献 を 行 って きた.こ の 方 法 は 単 に 立 体 構 造 の 決 定 だ け で は な く,構 造 ・機 能相 関 の 研 究 に 欠 か せ な い 最 も重 要 な研 究 手段 で あ る.タ ンパ ク質 結 晶 解 析 の 重 要 性 は今 後 ます ま す 広 く認 識 さ れ る よ う に な ろ う.と くに機 能 の発 現 に直 接 関 連 した研 究,お よび 方 法 論 で は解 析 の 自動 化 を 目指 した研 究 が急 速 に進 む こ とが 期 待 され て い る. こ の解 説 は,タ ンパ ク質 結 晶 学 の 研 究 を始 め よ う とす る初 心 者 が 手 っ と り早 くそ の ア ウ トラ イ ンを理 解 す る こ と を 目的 と して い る.方 法 の 詳 しい解 説 で は な い こ と を お 断 り して お く.ま た,タ ンパ ク質 結 晶構 造 解 析 は 結 晶 とい う一 見 特 異 な環 境 に あ る もの を見 て い る の で あ る が, と くに専 門 外 の 関連 分 野 研 究 者 が,タ ンパ ク質 結 晶 学 の 生 物 科 学 にお け る 役 割,成 果 お よ び意 義 を正 当 に理 解 す る た め に,ま ず 最 初 に タ ンパ ク質 の結 晶 の 特 徴 をや や 詳 し く述 べ,タ ンパ ク質 の 構 造 と構 造 ・機 能 相 関 を調 べ る の に結 晶 が む しろ 理 想 的 な 場 で あ る こ とを示 した い.な お 最 後 に,タ ンパ ク 質 結 晶 学 の 歴 史 に も触 れ て お く.タ ンパ ク質 結 晶 学 そ の もの の理 解 に も貢 献 す るか らで あ る. ま た タ ンパ ク質 特 有 の 原 子 お よ び 内 部 回転 角等 の 命 名 法 等 は付 録 と して纏 め た. 1.タ ン パ ク 質 結 晶 の 特 徴 1.1タ ンパ ク質 結 晶 と溶 媒(水) タ ンパ ク質 結 晶 の重 要 な特 徴 は 「結 晶 の 中 で タ ンパ ク 質 は生 きてい て 活性 を持 っ て い る」 こ とで あ る.活 性が な け れ ば構 造 解析 の意 義 は小 さい.活 性 を持 つ の は 「結 晶の 容 積 の30∼70%,平 均50%を 結 晶 化 溶 媒(ほ とん ど は 水)が 占 め て い る」 か ら で あ る(図1).な か に は90% が水 とい う例 もあ る.タ ンパ ク質結 晶 で は この 溶 媒(水) こそ が 重 要 な 役 割 を果 た して い る.活 性 を持 つ タ ンパ ク 質 は 水 和 して い て,そ の 水 は結 合 水 とい わ れ る.結 合 水 を奪 え ば タ ンパ ク 質分 子 は構 造 を保 持 で きず 生 物 活 性 を 失 う.こ の 意味 で 結 合 水 は活 性 タ ンパ ク質 分 子 の 一 部 で あ る.結 合 水 の 一 部 は 分 子 内 部 の 隙 間 お よ び表 面 の 窪 み に 入 り,タ ンパ ク質 分 子 と水 素 結 合 を結 びそ の構 造 保 持 の役 割 を担 っ て い る.残 りは分 子 表 面 の1∼2層 の 水 で, 表 面 か ら4.5A位 まで の 距 離 に あ り,表 面 の 極 性 基 と直 接 間接 に水 素 結 合 し,タ ンパ ク質 と結 合 して い る.そ の 量 は タ ンパ ク質 分 子 の重 量 の ほ ぼ20∼40%で あ る.こ の 結 合 水 を持 つ 分 子 が 集 ま り,さ ら に 隙 間 に は流 動 性 の あ る 自由 水 が 詰 っ て結 晶 化 す る こ と に な る.し た が っ て,タ ンパ ク質分 子 が お互 い に直接 接触 して い る点 は少 な く,結 晶場 が 分 子 構 造 に大 きい影 響 を与 え る とは考 え られ ない. 溶 液 中 の タ ンパ ク質 も結 合水 を持 っ て い る の で,タ ンパ ク質 分 子 の 構 造 は結 晶 中 で も溶 液 中 で もほ ぼ 同 じで あ る と考 え られ る.自 由水 と結 合 水 との 区 別 は画 然 と した も の で は な く,中 間 状 態 の もの も多 い.結 晶 内 の結 合 水 の 多 くは 結 晶 解析 で 位 置 を決 定 す る こ とが で きる. 図1.タ ンパ ク質 結 晶 の 結 合水 と 自由水 の概 念 図.太 線 は タ ンパ ク 質,細 線 内の 点 は結 合 水,空 白 の 隙 間 は 自 由 水 が詰 って い る. 378 _{日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996)}

タ ンパ ク 質結 晶 構 造 解 析 入 門 多 くの タ ンパ ク質 結 晶 で は 分 子 の 一 部 が 局 部 的 に 複 数 の コ ン フ ォ メー シ ョン を示 した り,無 秩 序 状 態 に あ る こ と,が 明 ら か に な っ て い る.ま た 基 質 や イ ン ヒ ビ ター と の 結 合 に 際 して 側 鎖 が 大 き く変 形 す る こ と も珍 し くは な い.結 晶 内 の タ ンパ ク質 分 子 の 構 造 変 化 に対 して 自由 水 が 緩 衝 帯 の 役 割 を果 して い る. タ ンパ ク質 の よ う に巨 大 な分 子 の結 晶 構 造 解 析 が 可 能 で あ るの は重 原 子 同 型 置 換 法 が 応 用 で きた か らで あ る が, こ れ も 自由 水 の 存 在 と い う結 晶 の特 徴 を上 手 く利 用 で き た こ とに よ る. 1.2結 晶 中 の タ ンパ ク質 の 活性 自 由水 の 存 在 に よ り,結 晶 内 の 環 境 が 生 体 内 の環 境 か ら大 き くは異 な らず,蛋 白質 は “生 きて ” い て,X線 結 晶 構 造 解 析 の意 義 が 大 きい こ とに な る. 一般 に 酵 素 の 活 性 部 位 は分 子 表 面 に は露 出 せ ず ,少 し くぼ ん だ所,ク レバ ス,ド メ イ ンの接 点 な ど にあ り,化 学 反 応 を進 め る た め に環 境 のpH,誘 電 率 等 の制 御 が 可 能 な場 一活 性 中心 一 を構 築 して い る.酵 素 結 晶 を基 質 を 含 む 母 液 に 入 れ る と,基 質 が 自 由水 相 中 に拡 散 し,酵 素 の 活 性 中 心 に接 して酵 素 作 用 を受 け る,生 成 物 は拡 散 し て 結 晶 外 に 出 る.基 質 の 代 りに 阻 害 剤 を 入 れ る と,同 様 に 酵 素 に結 合 して 機 能 を阻 害 す る.こ の よ うな酵 素 作 用 の 時 間 分 割 実 験 に よ る トレ ー ス を 目標 に した研 究 も試 み られ て い る.タ ン パ ク 質 結 晶 解 析 の フ ロ ー セ ル(flow cell)法 は ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リー 中 に結 晶 を 固 定 し,pHを 変 化 させ た溶 液,基 質 を含 む 溶 液 な ど を流 しな が らX線 回折 実験 を行 い,構 造 変 化 を トレー スす る方 法 で あ る が, これ が 可 能 な の も 自 由水 の 存 在 に よ る もの で あ る. 数種 の 酵 素 で 結 晶 お よ び溶 液 中 の 活性 の比 較 研 究 が 行 な わ れ て い る.多 くの酵 素 が 結 晶 中 で も触 媒 活 性 を持 つ が,溶 液 中 の そ れ と比 較 して,反 応 速 度 が 小 さ くな る の が 普 通 で あ る.ま っ た く活 性 が 認 め られ な くな る もの も あ る.し か しなが ら,そ の 原 因 は,隣 接 分 子 が 活 性 中心 をブ ロ ック して 基 質 が接 近 で き ない,反 応 進 行 に 必 要 な 構 造 変 化 が 隣接 分 子 の た め に 困 難,基 質 と生 成 物 が 大 き くて 結 晶 内 で は 拡 散 速 度 が 小 さい,な どで あ る.分 子 の パ ッキ ン グ の 故 で あ っ て,分 子 構 造 が 変 わ っ て活 性 を示 さな くな る とい う実 験 事 実 は 見 られ ない. 多 くの 酵 素 の 結 晶 で 基 質 を結 合 す る部 位 の熱 振 動 が 他 の 部 分 よ り大 き く,基 質 の 結 合 に必 要 な 構 造 変 化 を起 こ しや す い 状 態 に あ る こ とが 示 され た.あ る種 の イ ン ヒ ビ ター タ ンパ ク質 の 活性 部 位 は標 的 酵 素 と結 合 す る と,結 合 部 位 の 熱 振 動 が 小 さ くな り,構 造 が 安 定 化 す る こ とが 観 測 され た.結 晶 中 で あ っ て もこ の よ う に機 能 ・活 性 に 直接 関 係 した現 象 が 見 ら れ,そ れ を結 晶 解 析 で 明 らか に す る こ とが で き るの で あ る. 1.3結 晶 内 と溶 液 内 の分 子 構 造 NMR法 が 発 展 して,溶 液 内 の 構 造 も詳 し く研 究 さ れ る よ うに な っ て き たが,結 晶 内 の構 造 と溶 液 内 の そ れ の 基 本 構 造 は同 じで あ る こ とが 明 らか に な っ た. そ の ほか に も結 晶内 と溶 液 内 で基 本的 な構造 が変 わ らな い こ と を示 す 実験:事実 が あ る.(a)い ろ い ろ な 種 の 同 じ タ ンパ ク質 は結 晶 化 条 件 が異 な っ て も,ま た異 な っ た対称 系 で 結 晶 化 して も基 本 的 に 同 じ分 子 構 造 を示 す.(b)溶 液 中 の タ ンパ ク質 の 化学 修 飾 が結 晶 中 の分 子 構 造 か ら旨 く説 明 で きる.す な わ ち,目 的 の 側 鎖 の 修 飾 の 難 易 度 が 結 晶 内 分 子 構 造 で 見 た 側 鎖 へ の接 近 の 難 易 度 に応 じて 説 明 で き る.(c)X線 小 角散 乱 法 で 測 定 した慣 性 半径 は結 合 水 も含 め て結 晶構 造 か ら計 算 した もの と良 く一 致 す る.基 質 等 を 結 合 させ て生 じる構 造 変 化 も旨 く説 明 され て い る. こ れ らの 現 象 を総 合 す る と,現 在 我 々が 結 晶 構 造 解 析 で 観 察 して い る骨 格 構 造 あ る い は活 性 中心 の 構 造 は安 定 で ユ ニ ー ク な もの で あ り,結 晶 中 あ る い は溶 液 を問 わず 少 々 の 条 件 の 変 化 で は 基 本 的 分 子 構 造 が容 易 に有 意 に変 る もの で は ない こ とを 示 して い る よ うに思 わ れ る.以 上 述 べ た結 晶 の 特 徴 は タ ンパ ク質 だ け で は な く,結 晶性 の tRNAお よ びDNAオ リ ゴマ ー結 晶 で も共 通 に見 られ る こ とで あ る. 2.タ ン パ ク 質 の 結 晶 化 タ ンパ ク質 結 晶 構 造 解 析 の 成 否 は 結 晶 の 良 否 が 左 右 し, そ の精 度 と信 頼 度 を制 御 す る.結 晶 化 が タ ンパ ク質 結 晶 解 析 の最 大 の 律 速 段 階 で あ る.貧 弱 な結 晶 で は労 ば か り 多 く,時 間 をか け て も よ い結 果 は 期 待 で き ない.と に か くよ い結 晶 を作 る よ うに努 め るべ きで あ る. (1)解 析 に必 要 な試 料 の 量: 結 晶化 につ い て の情 報 が 少 ない タ ンパ ク質 で は結 晶 化 条 件 の探 索 だ け で も10∼30mgの 量 が必 要 で あ る.最 も こ れ以 下 で 解 析 が 完 了 す る 場 合 も珍 し くは な い.天 然 に 極 く微 量 しか 存 在 しな い タ ンパ ク質 は遺 伝 子 組 換 え等 を 利 用 して大 量 に得 る方 法 が 用 い られ る. (2)タ ンパ ク質 の 溶 解 度,塩 析 ・塩 溶: タ ンパ ク質 溶 液 で,イ オ ン強 度 を減 少 させ て0に 近 ず け れ ば 溶 解 度 は小 さ くな る.こ の 現 象 を利 用 して塩 濃 度 を減 少 させ て 結 晶化 す る の が 透 析 法 で あ る.一 方 イ オ ン 強 度 が 大 きい 場 合 に さ ら に大 き くす る と,溶 解 度 は ほ ぼ 直 線 的 に減 少 す る.こ の現 象 を利 用 す る の が塩 析 で あ る. こ の と き小 さ い多 価 イ オ ンが よ り有 効 で あ り,実 際 に硫 酸 塩 や燐 酸 塩 が よ く用 い られ る.溶 解 度 を下 げ る 目的 で エ タ ノ ー ル あ る い は2-メ チ ル ー2,4-ペン タ ン ジ オ ー ル 等 の 有 機 溶 媒 が 用 い られ る こ と もあ る.ポ リエ チ レ ン グ リ コー ル(PEG,分 子 量1mm∼6000)も よ く用 い られ るが, 沈 澱 剤 とい う よ りは,結 晶性 を 良 くす る 目 的 で 用 い られ る こ とが 多 い. (3)結 晶 化 に 影 響 す る因子: 結 晶 化 に は多 くの 因 子,タ ンパ ク 質 濃 度,純 度,緩 衝 日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996) 379

溶 液 の 種 類,pH,沈 澱 剤 の 種 類 と濃 度,温 度,等 が 関係 す る.有 機 溶 媒,金 属 イ オ ン,イ フ ェ ク タ ー,界 面 活 性 剤 の 種 類 と濃 度(疎 水 性 タ ンパ ク 質).等 が 関 係 す る も の もあ る.そ こで 多 くの 因 子 の 組 み 合 わせ の 多 くの 条 件 を短 時 間 で調 べ る 目 的 で,種 々 の 条 件 の沈 澱 剤 試 薬 をセ ッ トに した ク リ ス タル ス ク リー ン とい う タ ンパ ク質 結 晶 化 条 件 探 索 用 の キ ッ トが 市 販 され て い て,好 成 績 を納 め て い る.便 利 な 自動 結 晶 化 装 置 も市 販 され て い る.な お, 結 晶 化 で 再 現 性 が 乏 しい こ と を よ く経 験 す る.タ ンパ ク 質 の純 度 お よ び微 量 不 純 物 に 問 題 が あ る 場 合 もあ る.新 鮮 な試 料 を用 い,迅 速 に結 晶 化 す る こ とが必 要 で あ る. (4)結 晶 化 法: 現 在 最 も よ く用 い られ て い る方 法 は,hanging drop va

por diffusioon法 で あ る(図2).容 積 約SmEの 容 器 の 底

(リ ザ ーバ ー)に 強 塩 濃 度 の塩 析 溶 液 あ るい は有 機 溶 媒 等 の 沈 澱 剤 溶 液 を0.5∼1mG入 れ る.5∼10μkの 飽 和 に近 い タ ンパ ク質 溶 液 の小 さ い 液 滴 を カ バ ー グ ラ ス か らぶ ら 下 げ,リ ザ ー バ ー の 上 に 置 き,密 閉 す る.蒸 気 拡 散 で 結 晶化 条件 に達 す る の を待 つ とい う方 法 で あ る.こ の 方 法 は 少 量 の 試 料 で 多 数 の 条 件 を一 時 に試 み る こ とが で き, 進 行 状 況 や結 晶 をそ の ま ま顕 微 鏡 で 観 察 で き るの で,好 ん で 用 い られ る.液 滴 を横 にお くsitting drop法 も時 々用 い られ る.液 滴 内 に種 結 晶 を 入れ る 方 法 も よ く用 い られ る.ミ ク ロ透 杤 法 は 肉 厚 の ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リー に20∼ 100μkの タ ン パ ク 質 溶 液 を 入 れ,下 端 を透 析 膜 で 封 じ, 沈 澱 剤 溶 液 中 に 入 れ,透 析 あ るい は拡 散 で 結 晶 化 させ る 方 法 で あ る.膜 を使 わ ず,キ ャ ピ ラ リー 中 で2液 を界 面 を乱 さな いで 接 触 させ る 自 由 界 面 法 も用 い られ る, (5)結 晶 の 大 き さ と質: 放 射 光,イ メ ー ジ ン グ プ レー トな どの 強 力 な機 器 の 発 展 で0.lmm角(体 積 で)以 下 の 結 晶 で も回 折 強 度 測 定 が

図2 hanging drop vapor diffusion法.reservoirに は 沈 澱 剤 溶 液 を 入 れ,カ バ ー グ ラ ス に5∼10ｵoの 飽 和 状 態 に 近 い タ ンパ ク 質 溶 液 の 液 適 を ぶ ら 下 げ る(カ バ ー グ ラ ス の 中 心 に 白 く見 え る).密 閉 され て い て,蒸 気 平 衡 で 結 晶 を 析 出 させ る. で きる よ う に な っ たが,や は りで きれ ば0.3mm角 くら い の 結 晶 が 望 ま しい.迅 速 に,高 次 の 反射 まで で きる だ け 多 くの デ ー タ を測 定 で き る こ とが 理 想 的 で あ る.目 的 に よ っ て は,回 折 強 度 測 定 に ラ ウエ 法 も用 い られ るが,そ の た め に は結 晶性 が さ ら に優 れ て い る(mosaicityが 小 さ い)こ とが 要 求 さ れ る.な お,顕 微 鏡 観 察 で 良 くて も,X 線 的 に は 解析 に適 さ な い もの も多 く,注 意 が必 要 で あ る. (6)膜 タ ンパ ク質(疎 水性 タ ンパ ク質)結 晶 化: 膜 タ ンパ ク質 に は 生 物 学 的 に重 要 な機 能 を もつ もの が 多 い が,疎 水 性 で あ る故 に一 般 に結 晶 化 が 難 しい.界 面 活 性 剤 を用 い て 結 晶 化 を試 み るが,界 面 活 性 剤 の フ ィル ム に 包 ま れ た タ ンパ ク質 分 子 が 集 ま っ て結 晶 を作 り,溶 媒(ほ とん どは 水)も 多 量 に 含 ま れ る の で,結 晶 性 が 劣 る もの が 多 い.界 面 活 性 剤 の種 類 の 選択 も重 要 で あ る. (7)結 晶 の 密 度 と溶 媒 の 量: 結 晶 格 子 に含 まれ る タ ンパ ク質 分 子 の 数Zお よ び溶 媒 の量 を求 め る た め に,結 晶 の 密 度 を測 定 す る.密 度 勾 配 法 が 手 っ と り早 い.密 度 と分 子 量 か らZと 溶 媒 の 量 を推 定 す る.溶 媒 含 有 量40∼50%に 対 応 す るZが 最 も確 か ら しい. (8)微 小 重 力 下(宇 宙)で の結 晶化 実験: 地 上 で 得 られ な か っ た タ ンパ ク質 の 結 晶 が 宇 宙 で 成 長 し,構 造 解 析 に 成 功 した とい う報 告 は まだ な い よ うで あ る が,得 られ た 結 晶 のX線 回折 強 度 測 定 でS/N比 が 数 十%改 良 され た と報 告 され て い る例 が 多 い.ま た,解 析 の 分 解 能(電 子 密 度 図 の 解 像 度,7,1参 照)も05A程 度 向上 した とい う例 もよ く見 ら れ る.地 上 の実 験 よ り10倍 も大 き い 結 晶 や,新 しい 形 の 結 晶 が 得 られ た とい う報 告 もあ る.高 分 解 能 の 解 析 で0.5Aの 分 解 能 の 向 上 は意 義 が 大 き い,そ の タ ンパ ク質 が 重 要 で あ る ほ ど宇 宙 実 験 の 科 学 的 意 義 が 大 き くな る 。 3.X線 回 折 強 度 の 測 定 タ ンパ ク質 の 結 晶 は空 気 中 で は,す ぐ溶 媒 を失 い,壊 れ て しま う.そ こでX線 実験 に際 して は結 晶 を ガ ラ ス キ ャ ピ ラ リ ー 中 に溶 媒 と一 緒 に封 入 して 実 験 に用 い る. タ ンパ ク質 結 晶 に 含 ま れ る 多量 の 流 動 性 溶 媒 や 局 部 的 無 秩 序 構 造 はBragg反 射 には 寄 与 しな い,ま た,見 か け の 温 度 因子 が低 分子 の結 晶 よ り も数 倍 も大 きい の で,X線 回 折 強 度 は 低 分 子 の そ れ と比 較 して格 段 に弱 い.一 方,結 晶 はX線 照 射 で 放 射 線 損 傷 を受 け,も の に よ り数 時 間 で 壊 れ て しま う も の もあ る.ま た解 析 に必 要 な 反 射 の 数 は 数千 ∼数 万 で あ る.(一 例 と して,分 子量3万 の タ ンパ ク 質 で2A分 解 能 の解 析 に は20,mm∼30,mm個 の反 射 デ ー タが必 要 で あ る,反 射 数 は 分解 能 の 逆 数 の3乗 に比 例 し, また 分子 量 に比 例 す る 〉.格 子 定 数 が 大 きい の で,隣 接 し た 回 折 斑 点 の 分 離 が 難 しい 場 合 もあ る.こ の様 に 不 利 な 条件 が 多 い が,弱 い 反 射 を短 時 間 で 多量 に測 定 す る こ と 380

タ ンパ ク質 結 晶 構 造 解 析 入 門 が 要 求 され る.実 験装 置 お よ び問 題 点 を見 て み よ う. (1)イ メー ジ ング ・プ レー ト(IP): 富 士 写 真 フ イル ム(株)で開 発 され た,ポ リエ ス テ ル フ ィ ル ム に輝 尽 性 蛍 光 体(BaFBr:Eu2+)の 微 結 晶 を塗 布 した新 しい タ イ プ の 高 性 能 二 次 元 放 射 線 検 出 器 で あ る. 感 度 は従 来 のX線 フ ィル ム よ り2桁 大 き く,適 性 露 光 域 (ダ イ ナ ミ ック ・レ ンジ)は5桁 に及 ぶ 広 い もの で あ る. タ ンパ ク 質結 晶 学 で は急 激 に従 来 のX線 フ ィル ム に とっ て 代 わ り,タ ンパ ク 質 結 晶 のX線 回 折 実 験 を容 易 に し, 解 析 の 分 解 能 と精 度 の 向上 に画 期 的 な 貢 献 を果 た した. (2)プ リセ ッ シ ョ ン写 真 法: 回 折 斑 点 が 単 位 格 子 の 形 状 に対 応 した格 子 状 に 配 列 し, 指 数 付 け が 容 易 な写 真 法 で あ る.結 晶 の 予 備 実 験:およ び 重 原 子 置 換 結 晶 の 適 否 を調 べ る の に最 適 で あ る.し か し 下 記 のIP回 折 計 が 便 利 と な り,用 い られ な くな っ た. (3)振 動 写 真 法: 入 射X線 に垂 直 な 軸 の 周 りに一 定 の 角 度 回転 させ て 回 折 線 を記 録 す る方 法 で あ る.格 子 定 数 が 比 較 的大 き くて も よ く,短 時 間 で 多 くの 回 折 点 を 記 録 で き る の で 強 度 測 定 に現 在 最 も よ く用 い られ て い る.振 動 カ メ ラ と ワ イセ ンベ ル グ カ メ ラが あ る.と くに坂 部 の ワ イ セ ンベ ル グ カ メ ラが 有 力 で あ る. (4)ラ ウエ 写 真 法: 結 晶 は静 止 させ,連 続 波 長 のX線 を用 い る.放 射 光X 線 とIPが 利 用 で きる よ うに な っ て 再 び脚 光 を浴 び る よ う に な っ た古 くて 新 しい 方 法 で あ る.結 晶 相 反 応 の トレー ス に力 を発 揮 す るで あ ろ う. (5)lP回 折 計: 一 般 の実 験 室 で 最 も広 く用 い ら れ て い る .IP(お よ び そ の 読 取 装 置)と 回 転 対 陰 極X線 発 生 装 置 を組 み 合 わ せ た 自動 測 定 装 置 で あ る.結 晶 は振 動 させ る. (6)二 次元 検 出器:

多線 式2次 元 検 出 器(multiwire area detector),あ るい

は テ レ ビ検出 器 を装 着 した 回 折 計 も実 績 を挙 げ る よ う に な って きた. (7)放 射 線 損 傷: X線 実 験 にお け る大 き な 問 題 は タ ンパ ク質 結 晶 の 放 射 線 損 傷 で あ る.X線 照 射 に よ りラ ジ カ ル が 発 生 し,こ れ が連 鎖 反応 で次 々 に伝 播 し,タ ンパ ク質 分 子 を破 壊 し,結 晶 格 子 を壊 す と考 え られ て い る.X線 照 射 時 間 の 増 加 に つ れ て,回 折 線 幅 が 広 くな り,強 度 が 減 少 す る.そ の 速 度 は もの に よ り差 異 が 大 きい.そ の 結 果,一 組 の デ ー タ を測 定 す る の に 数個 の 結 晶 を必 要 とす る もの もあ る.と ころ が 放 射 光 の よ う に強 力 なX線 _{源 で 測 定 で き る と ,1} 個 の結 晶 で 壊 れ る まで に以 前 よ りは るか に 多 くの デ ー タ が 測 定 で きる よ う に な り,こ の 問 題 は あ ま り重 大 な 問題 で は な くな っ て きた.た だ し,大 学 の研 究 室 レベ ル で の 装 置 で は依 然 と して 重 大 な難 点 で あ る. (8)低 温 実 験: い ろ い ろ な点 か ら低 温 実 験 が 有 利 で あ る,す な わ ち低 温 で は,(i)温 度 因子 が 小 さ くな り,高 次 の デ ー タが 測 定 で き,分 解 能 と精 度 が 向 上 す る.(ii)結 晶 のX線 損 傷 は急 激 に軽 くな り,分 解 能 と精 度 は 向上 す る.(iii)反 応 速 度 が 指 数 関数 的 に減 少 す るの で酵 素 反 応 等 の 固 相 反応 に伴 う構 造 変 化 を トレー ス す る こ とが 可 能 に な る.た だ し低 温 実 験 を行 う た め には,水 を有 機 溶 媒 で 置 き換 え て 低 温 に した り,急 速 冷 凍 して結 晶 構 造 を壊 さ ない で 溶 媒 を過 冷 の ガ ラス状 態 にす る必 要 が あ る. 4.重 原 子 同 型 置 換 法 タ ンパ ク質 分 子 は 通 常 の 低 分 子 よ り10倍 以 上 も大 き く,重 原 子 法 や 直 接 法 で は構 造 決 定 は で きな い.幸 い に も,タ ンパ ク質 結 晶 構 造 解 析 で は 間 接 的 で は あ る が 位 相 を実 験 的 に求 め る 唯 一 の 方 法 で あ る 多重 重 原 子 同 型 置 換 法 を用 い る こ とが で き る. タ ンパ ク 質結 晶 を重 原 子 化 合 物 を含 む母 液 中 に浸 す と, 重 原 子(団)が 拡 散 して 結 晶 内 に入 り,自 由水 相 を通 り, タ ンパ ク質 の 分 子 構 造 を変 え ず 同 型 性 を保 っ た ま ま単 位 胞 中 の 少 数 の 定 点(で きれ ば 一 つ)に 定 着 す る と必 要 な 同型 置換 結 晶 が 得 られ る(こ の 際 格 子 サ イ ズ も変 化 して は い け な い,し たが っ て,等 構 造(isostructural)と 言 う べ きで あ るが,慣 用 的 に 「同型 」(isomorphous)が 用 い ら れ て い る)(図3). 重 原 子 同 型 置 換 結 晶 の 良否 が 結 晶 解 析 の成 否 を左 右 す る.悪 い もの で は信 頼 性 の あ る 位 相 が 得 られ な い.実 際 に,重 原 子 の 座 標 決 定 ・精 密 化 一位 相 決 定 一モ デ ル作 成 と 解 析 が 進 む ま で は,置 換 結 晶 の 良 否 の 最 終 的 判 定 は で き な い場 合 が 多 い.良 い 同 型 置 換 結 晶 を得 る ま で努 力 す べ きで あ る.不 十 分 な もの で は 時 間 と労 力 の 無駄 で あ る. 4.1重 原 子 同 型 置 換 結 晶 の 作 製 重 原 子 の 異 常 分 散 効 果 を利 用 す れ ば解 析 は一 種 類 の 重 原 子 同 型 置 換 結 晶 だ け で も可 能 で は あ る が,や は り二 種 類 は欲 しい もの で あ る.良 く用 い られ る 重 原 子 試薬 は: 図3.重 原 子 同 型 置 換 結 晶 の 概 念 図.(a)タ ンパ ク 質 結 晶, (b)重 原 子(●)同 型 置 換 さ れ た 結 晶,タ ンパ ク 質 の 構 造 は 不 変. 日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996)381

K3UO2F5,

UO2Ac2, UO2 (NO3) 2, HgAc2, HgCl2, K2Hgla,

PCMB, PCMBS, K2PtCla, K2PtCl6, K2Pt (CN) 4, KAuCI4,

SmC13,

AgNO3 (Ac, acetate; PCMB, p-chloromerucuriben

zoate;PCMBS,P-chloromercuribenzene sulphonate)等 で あ る. 試 薬 の 濃 度 お よ び浸 漬 の 時 間 等 の 条 件 は試 誤 法 で 調 節 す るが,時 間 と労 力 が 必 要 で あ る.も と も と金 属 原 子 を 含 む タ ンパ ク質 で は い っ た ん 金 属 原 子 を キ レー ト剤 で 除 き,次 い で よ り重 い 金 属 原 子 で 置 換 す る 方 法 が 面 白 い. 位 相 と タ ンパ ク質 内 の 重 原 子 位 置(通 常 活 性 中 心 近 傍 に あ る)が 同 時 に決 定 で き る こ と に な る.最 初 か ら重 原 子 化 合 物 を含 む溶 液 か ら タ ンパ ク 質 を結 晶 化 させ る 共結 晶 化 は成 功 例 が 少 な く,有 効 で は ない. 位 相 決 定 以外 で も,重 原 子 同 型 置 換 結 晶 が 構 造 と機 能 に関 す る重 要 な 情 報 を 直接 与 え る 場 合 が あ る.重 原 子 を 含 む 阻 害 分 子 は位 相 決 定 と活性 中 心 の 同 定 の 双 方 に 有 力 で あ る.ま た,重 原 子 試 薬 は そ れ ぞ れ 特 定 の 極 性 を持 つ ア ミノ 酸 側 鎖 と の 親 和 力 が 強 く,水 銀 化 合 物(イ オ ン) は一 般 にCys,His等 と,ウ ラ ニ ル化 合 物 はGlu,Asp等 と,Pt化 合 物 はMet,His,Arg等 と結 合 す る.こ の 種 の 情 報 は 電 子 密 度 図 か らモ デ ル を作 る の に有 力 な 手 が か り を与 え る こ とに な る. 浸 漬 法 で 重 原 子 が う ま く置 換 した か ど うか は,X線 回 折 強 度 が 元 の 結 晶 の そ れ か ら変化 した か ど うか で 調 べ る. 回折 強 度 の 変 化 が 過 大 で あ っ た り格 子 定 数 が 変 化 す る と 利 用 で きな い.試 薬 に よ っ て は,タ ンパ ク 質分 子 自体 の 構 造 が 有 意 に変 化 した り,同 型 性 が 壊 れ た り,結 晶 が 壊 れ た りす る こ と も よ く見 られ る.強 度 変 化 は10%程 度 が 一 応 の 目安 に な ろ う.格 子定 数の変 化 は程 度の問題で は あ るが,小 さ くて も高 次 の 反 射 の位 相 決 定 に は(悪)影 響 が 大 き く,フ ー リエ 図 の 精 度 を制 約 す る こ とに な る. 4.2重 原 子 同型 置 換 法 の適 用 (1)ス ケ ー ル 因子 決 定: X線 回 折 強 度 を測 定 す る と,タ ンパ ク 質結 晶(構 造 因 子 をFpと す る,簡 明 の た め に ミ ラー 指 数 は省 略 す る)と 重 原 子 同型 置 換 結 晶(構 造 因子FPx)の そ れ ぞ れ につ い て,Wilson's plotに よ り,ス ケ ー ル 因子 と温 度 因子 を求 め る.結 晶 は多 量 の 溶 媒 を含 み,そ の う ち一 部 は 回 折 に 寄 与 し残 りは 寄 与 しな い(バ ッ ク グ ラ ウ ン ドを高 くす る), 置 換 され た 重 原 子 の 量 は 定 か で は な い,強 度 デ ー タ の (sinO1λ)2の範 囲 が小 さい,な どの不 利 な条 件 が あ るの で, ア バ ウ トな値 しか 得 られ な い が,他 に 方 法 が ない.な お, (IFPHI2/IFPI2)の 比 に つ い て 同様 の プ ロ ッ トを行 な え ば, 単 独 の プ ロ ッ トよ り確 か な 相 対 ス ケ ー ル 因 子 と温 度 因子 の差,△B,が 得 られ る.重 原 子 同型 置 換 法 の 初期 に要 求 さ れ る の は この 二 つ で あ り,こ の 方 法 が 有 力 で あ る. (2)差 パ タ ー ソ ン関 数 一重 原 子 位 置 の 決 定: 重 原 子Hの 位 置 は(￨FPH￨-IFPI)2を 係 数 とす る差 パ タ 一 ソ ン関 数 で 求 め る こ とが で きる .幸 い に もこの便宜的 な 関 数 で,ノ イ ズ は 多 い が,重 原子 間ベ ク トルが 現 れ(少 数 の 重 原 子 問 ベ ク トル と多 数 の 重 原子 一タ ンパ ク質 原 子 間 ベ ク トルが 含 ま れ るが,前 者 だ けが 浮 び上 が る),そ の 位 置 を 決 定 す る こ とが で きる.重 原 子 同型 置換 法 が 成 功 した 理 由 の一 つ は この 点 にあ る. (3)重 原 子 同 型 置 換 法 の原 理: FP,FPH,お よ び重 原 子 だ け の 構 造 因子 へ の 寄 与(計 算 値)FHの 間 の 関 係 は: 〓(1) 〓(2) 〓(3) こ の3個 の量 は複 素 平 面 上 の ベ ク トル で,式(3)で 示 す よ うに 三 角 形 を作 る(図4a). そ こで,原 点 を 中心 に して 半 径IFPIの 円 を描 く.次 に 第1の 重 原 子 同型 置換 結 晶 のFHiを 計 算 し,原 点 か らベ ク トル ーFH1を 描 き,そ の 先 端 を 中心 と した 半 径￨FPHl￨の 円 を描 く.こ の2個 の 円 の交 点 は と もに式(3)を 満 足 す る.次 に第2の 重 原 子 置 換 結 晶 につ い て 同様 の 作 業 を行 う と,3個 の 円 が 一 点 で 交 わ るP点 が 位 相 φを与 え る.こ の よ う に して,少 な く と も2種 の 重 原 子 同 型 置 換 結 晶 が 必 要 で あ る.と こ ろ が,測 定 値 に も計 算 値(重 原 子 の位 置,占 有 率 等 の パ ラ メ ー タの 誤 差 に よる)に も誤 差 が 含 まれ る の で,3個 の 円 が 一 点 で 交 わ る こ とは偶 然 しか 期待 で きな い. この 問 題 は 位 相 の確 率 分 布 を考 慮 して 巧 み に解 決 され 図4.重 原 子 同 型 置 換 法(a)位 相 平 面(実 数 軸:r,虚 数 軸:1)上 に,FP.,FPH,FH(添 え 字1,2は 重 原 子 置 換 結 晶 の 番 号),φ(FPの 位 相 角),原 点 を 中 心 と す る 半 径IFBIの 円,ベ ク トル ーFHiの 先 端 を 中 心 とす る 半 径￨FPHi￨の 円,を 描 く.3個 の 円 の 交 点Pが 位 相 φ を 示 す.(b)位 相 角 の 確 率 分 布 の 計 算,式(4),εi= ￨￨ FP￨-d;￨.diは 太 線 で 示 す 原 点 を 通 る 線 分(位 相 φ) とFPHiの 円 との 交 点 の 原 点 か ら の 距 離. 日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996)

タ ンパ ク質結晶構造解 析入 門 図5.位 相 角 確 率 分 布 の 一 例.重 原 子 同 型 置 換 結 晶4種 を 用 い た もの. (a)中 心 の 短 い 線 分 は-FHベ ク トル,+は 位 相 確 率 分 布 の 重 心.φb:最 良 位 相 角,φm:最 確 位 相 角.(b) 横 軸 φ,縦 軸P(φ),m:figure of merit. た.す な わ ち,0∼2π の どの 角 度 も正 しい位 相 で あ る確 率 が0で は な く有 限 の 値 を も って い る,と 考 え る の で あ る.図4bで,任 意 の 位 相 φの 線 分 を描 く.こ の 線 分 と 第1の 同 型 置 換 結 晶 のIF'PHIIの円 との 交 点 の原 点 か ら の 距 離 を41と す る.FPの 円 との 交 点 の 距 離 はIFPIで あ る. こ の2個 の 交 点 の 間 の 距 離 ε1(φ)(=￨￨FP￨-dl￨)が 小 さ い ほ ど,φ が 正 しい位 相 で あ る 確 率 が 高 い.ε1(φ)はFPx1 の観 測 値 と位 相 を φ と した と きの 計 算 値 の差 で あ り,式 (3)の 位 相 三 角 形 が 閉 じな い 量 で あ る.そ こ で,FPの 位 相 が φで あ る確 率 をP(φ)と す る と, P(φ)=exp[-εi2(φ)/2Ei2] (4) で表 され る.た だ しEI2は 第1の 重 原 子 置 換 結 晶 の￨FPHl￨ の 自乗 平 均 誤 差 で あ る.同 型 置 換 結 晶 が 複 数 個 あ れ ば, 同 じ操 作 を行 い,P(φ)は 右 辺 の 積 とな る.実 際 に は,0 ∼2π の 全 領 域 につ い て例 え ば10.お き に式(4)を 計 算 し,位 相 確 率 分 布(図5)を 求 め る. (4)異 常 分 散 効 果 の 利 用: 重 原 子 のX線 異 常 分 散 効 果 を利 用 す る と さ ら に有 力 で あ る.FPHのFriedel対 をFPH(+)とFpx(-)で 表 す と, FPH(+)=FP(+)+FH(+)+iF”H(+) FPH(-)=FP(-)+FH(-)+iF”H(-) (5) とな り,IFpH(+)￨≠IFpH(-)1で あ る.と くに放 射 光 で, △f'の大 き い 波 長 を選 択 す る と,こ の 差 が 大 き く精 度 良 い測 定 が で きる.そ こ で こ の対 を別 々 の2種 の重 原 子 置 換 結 晶 と見 做 す と,1個 の重 原 子 置 換 結 晶 だ けか らで も位 相 決 定 が 可 能 に な る.現 在 この 方 法 が よ く採 用 され て い る.さ ら には,も と も と重 原 子 を含 む タ ンパ ク質結 晶 で は ま っ た く同型 置 換 結 晶 な しの 構 造 決 定 も可 能 で あ る. タ ンパ ク 質 中 にMetが 含 まれ て い る場 合 は,SをSeで 置 換 したSe-Metを 組 み込 み,利 用 す る場 合 が 多 くな っ て い る. (5)best Fourier: 位 相 の 確 率 分 布(図5)で 得 ら れ るP(φ)極 大 の 最 確 位 相 角 φmを 用 い る`最 確 フー リエ'は 一 見 良 さそ うで あ る が,と くに解 析 の 初 期 段 階 で は ノ イ ズ が 多 く,通 常 は 用 い られ な い.タ ンパ ク 質結 晶 解 析 で は独 特 の 的 確 な方 法 が 考 案 され て い る.確 率 分 布 が散 漫 な もの,あ る い は 図5の 例 の よ うな バ イモ ー ダル な分 布 が よ く見 られ るが, 例 え ば,図5の 例 で,φmを 用 い る と150.近 辺 の 有 意 な 確 率 を持 つ 位 相 角 を まっ た く無 視 す る,す な わ ち情 報 の 一 部 を無 視 す る こ と に な る<sub>.し か し,0∼2π の す べ て の</sub> 角 をそ の 確 率 に応 じて フー リエ 合 成 に取 り込 む こ と,す な わ ちす べ て の 情 報 を 利 用 す る こ とが 求 め ら れ て い る と 考 え る の で あ る.そ の た め に は,位 相 平 面 上 でIFPIの 円 周 上 に重 みP(φ)を 付 け,そ の 重 心 を フ ー リエ 係 数 とす る の が よい こ とが わ か る.(証 明 は 参 考 文 献 参 照).こ の フー リエ は位 相 確 率 分 布 をそ の ま ま取 り入 れ た とい う意 味 でbest Fourier(最 良 フ ー リエ)と 呼 ば れ,最 も`無 難 な'フ ー リエ で あ り,実 際 に最 も よ く用 い られ て い る. 実 際 に は,重 心[極 座 標 で(m￨FP￨,φb)と 表 す]を 計 算 で 求 め,振 幅m￨FP￨,位 相 角 φb(最 良位 相 角 と呼 ば れ る) を用 い て 電 子 密 度 分 布 を計 算 す る.位 相 角 だ け で は な く, 確 率 分 布 に 対 応 した フー リエ 係 数 へ の 重荷 まで 求 め て い る こ と に注 意 され た い.m(=0∼1)は0∼2π の すべ て の 角 の φbか らの差 の重 荷 平 均 で あ り,有 効 度 因子(figure of merit)と 呼 ば れ,確 率 分 布 が シ ャー プ で あ る ほ ど1に 近 く,フ ー リエ 図 に大 き く寄 与 す る.mの 統 計 は解 析 の 進 歩 を示 す 一 つ の 指 標 と して 用 い ら れ る が,解 に 依 存 し,そ の 適 切 な 見 積 りが 必 要 で あ る.異 な る結 晶 問 のm の 比 較 に は意 義 が 少 な い. 一例 と して_{,一 つ のFPの 位 相 確 率 分 布 で,φ=0° が 確 率} 50%,φ=90° が 確 率50%,そ の他 は確 率0%と 得 られ た とす る.こ の 時,(0.5￨FP￨,0°)と,(0.S￨FP￨,90.)を と も に フ ー リエ 合 成 に用 い れ ば 全 情 報 を利 用 す る こ とに な る. これ は2つ の 重 心,[(1/√2)￨FP￨,45.]を 単 独 に用 い るの と同 等 で あ る.有 効 度 因子 は,m=〈cos 45° 〉=1/√2. 一 方 ,φmは 選 び よ うが な く,最 確 フ ー リエ は不 合 理 で あ る こ とが わ か る. 5.分 子 置 換 法 タ ンパ ク質 分 子 の 中 には,例 え ばヘ モ グ ロ ビ ンや ウ イ ル ス の よ う に ま っ た く等 しい か あ る い は ほ と ん ど等 しい 複 数 個 の サ ブ ユ ニ ッ トか らで き て い る もの が 多 い.そ れ が 結 晶 中 で 厳 密 な対 称 を も た な い と き に,パ タ ー ソ ン関 数 の 検 討 か らサ ブユ ニ ッ トの 相 対 方 位 と位 置 を定 め よ う 日 本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996) 383

とす る 方 法 が あ る.ま た 類 似 の タ ンパ ク質 の 構 造 が す で に 報 告 さ れ て い る と き に,両 者 の パ タ ー ソ ン関 数 の 比 較 か ら構 造 決 定 を試 み る 方 法 が あ る.こ の 方 法 は ま とめ て 分 子 置 換 法 と呼 ば れ る.い ま,結 晶 学 的 な対 称 関 係 に な い2個 の 同 じ分 子 が 非 対 称 単 位 内 に あ る場 合 を考 え る. 元 来 の パ タ ー ソ ン関 数 をP(x)で 表 し,そ れ を 回転 させ た パ タ ー ソ ン関 数 をP(xと す る(x=[C]x,[C]は 回 転 マ トリ ックス).非 対 称 単 位 内 の 両 分 子 の 方 位 の差 だ け 回転 させ て重 ね 合 わ せ た と き に2つ の 分 子 内 ベ ク トル セ ッ ト が 最 も良 く一致 す る.そ こで 回転 関 数R(θ1,02,θ3)を, R(θ1,θ2,θ3)=j UP(x)P(x')ぬ(6) と定 義 し,指 標 とす る.積 分 は 分 子 内 ベ ク トルが 現 れ る 領 域 に 限 ら れ る.θ1,θ2,θ3の 全 領 域 に つ い て式(6)を 計 算 し,関 数値 が 最 も大 きい ピー クが2個 の 分 子 の相 対 方 位 を与 え る.構 造 既 知 の タ ンパ ク 質結 晶 と比 較 す る 場 合 は そ の パ タ ー ソ ン関 数 をP(xと す る.構 造 が 異 な る 可 能性 が あ る部 分 はP(め の 計 算 か ら除 外 す る こ とが 必 要 で あ る.積 分 領 域 の 設 定 な どの 条 件 を適 当 に選 ぶ と, 予 期 以 上 に 有 力 な 方 法 で あ る.方 位 が 得 られ る と次 は, 分 子 間ベ ク トル に着 目 して位 置 を求 め る.分 子 の 重 心 問 ベ ク トル に 対 応 した パ タ ー ソ ン関 数 を合 成 して,元 の パ ター ソ ン関 数 との 一 致 の 具 合 を見 る.あ る い は分 子 を非 対 称 単 位 中 で動 か してR因 子 を計 算 す る,な どの 方 法 が 用 い られ る. 生 物 界 で,同 一 機 能 を持 つ タ ンパ ク質 は種 が 異 な りア ミ ノ酸 配 列 が か な り異 な っ て も基 本 構 造 は 同 じで あ り, また,機 能 が 異 な っ て も部 分 的 に類 似 の 立 体 構 造 を持 つ タ ンパ ク 質 が 多 い こ とが 明 らか に な っ て きた.分 子 置 換 法 の応 用 範 囲 は広 い. 6.モ デ ル 作 成 と精 密 化 6.1フ ー リエ 図 の 改 良 構 造 因 子 の位 相 角 が 得 られ る と,フ ー リエ 図 が 合 成 さ れ る.一 般 に は分 解 能 の 不 足 と位 相 角 の 精 度 の不 足 で, 直 ち にモ デ ル の 作 成 が 始 め られ る とい う よ うな 良 質 の フ ー リエ 図 が 得 られ る こ と は少 な い_{.こ の よ うな 場 合 に 良} く用 い られ る フ ー リエ 図 を改 良 す る有 力 な手 段 が あ る. 第 一 は 溶 媒 領 域 の電 子 密 度 平 滑 化(solventf flattening)で あ る.自 由水 の 溶 媒 領 域 は定 ま っ た構 造 を持 たず,そ の 電 子 密 度 は 水 の 平 均 電 子 密 度 で あ り,平 滑 で あ る,と い う論 拠 で,溶 媒 領 域 を低 い 平 坦 な密 度 の領 域 に修 正 す る 方 法 で あ る.第 二 は,電 子 密 度 平均 化 法 で,単 位 胞 内 に 結 晶 学 的 に等 価 で は な い 複 数 個 の サ ブユ ニ ッ トが あ る と き,そ の 構 造 は ほ ぼ 等 しい の で,そ の 電 子 密 度 を平 均 す る と よ り信 頼 度 の 高 い 電 子 密 度 図 が 得 られ る,と い う方 法 で あ る.そ の 他 に,タ ンパ ク 質 領 域 の電 子 密 度 に は上 限 が あ る か ら,高 さ に適 切 な 制 限 を加 え る とい う ヒス ト グ ラム マ ッピ ン グ法 が 用 い られ る場 合 もあ る. この よ うに して 修 正 され た フ ー リエ 図 を フ ー リエ 変 換 して 位 相 角 を求 め,そ れ を用 い て よ り良 い フ ー リエ 図 を 得 るわ けで あ る.こ の 過 程 は何 回 か 繰 り返 す こ とが 多 い. 解 析 の 初 期 段 階 で と くに 有 力 な 方 法 で あ る. 6.2モ デ ル の作 製 電 子 密 度 は単 位 胞 を3次 元 の 格 子 状 に細 分 し,そ の 格 子 点 で計 算 す る.か つ て は透 明 な シー トに一 つ 一 つ の 断 面 の 密 度 を等 高 線 で 表 し,そ れ を 重 ね てRichards Box と い う装 置 を利 用 して,モ デ ル を作 っ て い た.現 在 は モ デ ル作 製 は専 ら コ ン ピ ュ ー タ ・グ ラ フ ィ ッ クス で 行 わ れ て い る が,縮 尺 した 電 子 密 度 図 を透 明 シー トに描 き,重 ね て 見 る と(ミ ニ マ ップ),分 子 全 体 が 見 られ,分 子 境 界 が 見 や す く,ま た ペ プチ ド鎖 の トレ ー ス も容 易 で あ る こ と か ら,便 利 に 用 い ら れ て い る.と くに コ ン ピ ュ ー タ ・グ ラ フ ィ ッ クス で は全 体 を見 る の は 難 し く,ブ ロ ッ ク毎 の 検 討 しか で きな い の で,ミ ニ マ ップ をそ ば に置 い て 対 照 しな が らモ デ ル を作 って 行 くの は 賢 明 なや り方 で あ ろ う. コ ン ピ ュ ー タ ・グ ラ フ ィ ッ ク ス で は,フ ー リエ 図 は あ る 値 以 上 の電 子 密 度 を持 つ 領 域 を'鳥 か ご'状 の 網 目で 囲 っ て 示 す 方 法 が 用 い られ る(図6),一 方,標 準 の結 合 距 離,結 合 角 を も っ た部 分構 造 を作 り,結 合 の 捻 れ 角 を 調 節 して,電 子 密 度 に最 も う ま く適 合 す る よ う に モ デ ル を作 り上 げ て い く.ペ プ チ ド結 合 は 剛体 と して扱 え る の で,主 鎖 の 内部 回 転 角,φ(C-N-Cα-C)お よ び Ψ(N-Cα-CLN),お よ び側 鎖 の 内 部 回転 角 を調 節 す れ ば よい.モ デ ル 作 成 の 支 援 プ ロ グ ラ ム と して は,TURBO-FRODOや 0等 の よ くで きた 高 機 能 の ソ フ トが 用 い られ て い る.最 初 にモ デ ル を作 る の は2.5∼3A分 解 能 の段 階 が 多 いが, モ デ ル作 製 の ス ター トは,大 き くて特 徴 の あ る形 を持 っ た 芳 香 族 側 鎖 や,も しあ れ ば 金 属 原 子 が 目印 に な る.一 次 構 造 が 分 か っ て い れ ば,二 次 構 造 予 測 法 で α らせ んの 可 能 性 の 高 い ペ プ チ ド鎖 部 分 が 推 定 で きる の で,大 きい よ り ど こ ろ に な る.α らせ ん部 分 は 一 般 に 電 子 密 度 が 高 く認 識 が 容 易 で あ る.モ デ ル 作 製 は 時 間 が か か る根 気 の 図6.鳥 篭 状 に表 した電 子密 度 図 の一 例.分 子 の一 部 の骨 格 が書 き こんで あ る.図 はあ る タ ンパ ク質 のCa-結 合部. 384 _{日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996)}

タ ンパ ク 質 結 晶 構 造 解 析 入 門 要 る作 業 で あ る.電 子 密 度 が う ま く説 明 で き な い部 分 は 多 く,と くに 主 鎖 の 両 末 端 部,分 子 表 面 の ラ ン ダ ム 構 造 部 分,あ る い は,Lys,Arg,Glu,Met等 の 長 い 側 鎖 等 で は 電 子 密 度 が 低 く,構 造 を まっ た く定 め られ な い場 合 が 多 い.実 際 に多 くの い ろ い ろ な コ ン ポ メー シ ョ ン を とっ て い るの で あ ろ う. 一 次 構 造 も分 か って い な い タ ンパ ク質 で は ,電 子 密 度 だ けで は識 別 が で き ない 側 鎖 も多 く,02Aの 分 解 能 の解 析 で は 同定 で きる 側 鎖 は約60%と 言 わ れ て い る. 6.3精 密 化 フ ー リエ の解 釈 で モ デ ル が で きる と,よ り信 頼 度 の 高 い構 造 を得 る た め にパ ラ メ ー タ の精 密 化 が 行 わ れ る.し か しな が ら,分 解 能 が 低 く,反 射 数 が1原 子 当 り数 個 か ら 10個 程 度 と少 な く反射 数 とパ ラ メ ー タ数 の 比 が 異 常 に小 さい こ と,ま た 一 方,初 期 モ デ ル の 精 度 が 悪 く,主 鎖 の 流 れ は ほ ぼ 正 しい と して も,多 くの 原 子 位 置 が 通 常 の 最 小 自乗 法 で は 収 束 で き な い ほ どず れ て い る こ と,さ ら に コ ン ポ メ ー シ ョ ンが ま っ た く異 な っ て い る 部 分 もあ る, とい う よ う な状 態 で あ る の で,精 密 化 す る た め に は,最 小 自乗 法 に よ る精 密 化 一 差 フ ー リエ 合 成 一 モ デ ル の 再 検 討 と,新 し く構 造 が 決 っ た原 子 の 追 加,と い う過 程 を何 回 もサ イ ク ルす る こ とが必 要 で あ る. (1)最 小 自乗 法: タ ンパ ク質 結 晶 の 解 析 で は,通 常 の 束 縛 条 件 な しの 最 小 自乗 法 精 密 化 が 成 功 す る こ と は例 外 的 で あ り,一 般 に 束 縛 条 件 付 きの 方 法 が 用 い ら れ て い る.結 合 距 離,結 合 角,捻 れ 角,平 面 性,非 結 合 原 子 問 距 離 等 が 異 常 に な ら, ない よ うに束 縛 して い る.分 解 能 が 低 い と き,あ る い は, モ デ ル の 精 度 が 悪 い と きは 剛 体 グ ル ー プ を 旨 く利 用 す る 方 法,プ ロ グ ラ ムCORELS,が パ ラ メ ー タ数 を小 さ く し て有 効 で あ る.解 析 の 最 終 段 階 で は,分 子 内 の 結 合 距 離, 結 合 角,捻 れ 角 等 の標 準 値 か らの ず れ お よ び非 結 合 原 子 間距 離 に 対 応 す る ポ テ ン シ ャル エ ネ ル ギ ー の 最 小 化 を, 構 造 因 子 の 精 密 化 と組 み 合 わ せ る 方 法(プ ロ グ ラ ム PROLSQ)が よ く用 い ら れ る.構 造 因子 は 周 期 関 数 の 和 で あ る の で,真 の構 造 に よ ほ ど近 くな け れ ば通 常 の 最 小 自乗 法 で はpseudo minimumに 落 ち 込 ん で 真 の 構 造 に達 しな い こ とが 多 い.こ の 難 点 を計 算 で 解 決 す る た め に プ ロ グ ラ ムXPLORはsimulated annealing法 を用 い て成 功 し た.こ の 方 法 で は まず3000K程 度 の 高 い温 度 にお け る分 子 運 動 を シ ミュ レー シ ョ ンす る.運 動 が 激 しい の でpseu do minimumを 飛 び 出 して,別 のminimumに 移 る こ とが で き る.そ の 後 焼 きな ます(anneal)と 真 の 構 造 へ 収 束 す る と い う わ け で あ る.こ の プ ロ グ ラ ム は 構 造 精 密 化 の ス ピー ドア ップ に大 き く貢 献 し,広 く用 い られ てい る. 精 密 化 の 進 展 は 通 常R因 子 で 判 定 す る.最 初 の モ デ ル で はRは ほ ぼ0.4∼0.5で あ るが,精 密 化 が 進 ん でRが ほ ぼ0.20あ る い は よ り小 さ くな る と精 密 化 が う ま く進 ん だ こ とが わ か る.最 近 よ く用 い ら れ る指 標 に‘free R'が あ る.こ れ は,全 観 測 デ ー タの うち5∼10%を あ らか じめ 精 密 化 か ら除 い て お き,精 密 化 の 進 展 に 応 じて そ の デ ー タの み のR因 子 を計 算 した もの で あ る.精 密 化 に 含 め て い な い の で よ り客 観 的 な指 標 で あ り,全 体 のR因 子 と対 比 して 評 価 に用 い られ る. (2)差 フ ー リエ 合 成: 精 密 化 の 中 途 で,モ デ ル の 検 討 に よ く用 い られ るの が 構 造 因子 の 観 測 値 と計 算 値 の 差 を係 数 と した フー リエ 合 成 で あ る.[2F。(hkl)-Fc(hkl)]が 係 数 と して 用 い ら れ る こ とが 多 い が,こ れ は誤 っ た位 置 に置 い た原 子 の ピ ー ク を押 え,真 の 電 子 密 度 に 最 も近 い フ ー リエ 図 を与 え る もの で あ る.最 終 段 階 で は[Fo(hkl)-Fc(hk1)]が 用 い られ,計 算 に 含 め て い な い 原 子 だ け が 正 の ピー ク と して 現 れ る.通 常 の フ ー リエ 図 お よび差 フ ー リエ 図 で の モ デ ル の 検 討 は念 を 入 れ て 行 こ な わ な け れ ば い け ない.フ ー リエ 図 か ら も,モ デ ル か ら も疑 問 の な い構 造 が 正 しい 構 造 で あ る.溶 媒 分 子 の 同 定 に は水 素 結 合 等 の 幾何 学 的 条 件 の考 慮 が必 要 で あ る. タ ンパ ク質 の結 晶 構 造 が い っ た ん 決 定 され る と,擬 基 質 や イ ン ヒ ビ ター 等 の 小 さい分 子 が 同型 性 を保 っ た ま ま 結 合 した 結 晶 が 得 られ た場 合(観 測 構 造 因 子FPL),そ の 結 合 状 態 は(FPS-FP)を 係 数 と した 差 フ ー リエ 合 成 図 で容 易 に調 べ る こ とが で きる.そ の フ ー リエ 図 に小 分 子 が 正 の ピ ー ク と して 現 れ る が,同 時 に そ の結 合 に よ り生 じた タ ンパ ク質 自体 の 構 造 変 化 も現 れ る.こ の 方 法 は 同 型 性 が 保 た れ て い るか ぎ り回折 強 度 を測 定 す る だ け で容 易 に実 行 で きる の で 広 く便 宜 に用 い られ て い る.ま た こ の 目的 の場 合 は 必 ず し も高 分 解 能 の ワ ンセ ッ トの デ ー タ は 必 要 で は な く,低 分 解 能 の あ る い は部 分 的 な デ ー タで も信 頼 度 の 高 い 情 報 が 得 られ る の で 大 い に 有 利 で あ る. この 方 法 は最 初 リ ゾ チ ー ム の 解 析 で 用 い ら れ て か ら,タ ンパ ク 質 の 活性 ・機 能 に つ い て 最 も確 実 な構 造 的基 礎 を 与 えて き た もの で あ る. 7.解 析 の 精 度 と 結 果 の 整 理 7.1.分 解 能 全 体 的 な解 析 の 信 頼 度 の 目安 は分 解 能 で あ る.Bragg 角0.か らOm、、.まで の 反 射 デ ー タを用 い た 解 析 の 分 解 能 と して,対 応 す るdmin(=λ/2sinθmax)Aを 用 い る.光 学 理 論 で は0.726mi,が 分 解 能 で あ る が,タ ンパ ク 質 の 場 合 は誤 差 もあ り,デ ー タ数 も不 完 全 で あ る か ら,dminを そ の ま ま便 宜 的 に用 い て い る.こ こ で 分 解 能 とは フー リエ 図 上 で 近 接 した2個 の 原 子 が 分 離 して 見 え る 限 界 の 距 離 で あ る,決 定 され た原 子 の 座 標 の 精 度(後 述)を 直 接 示 す もの で は な い こ とに留 意 され た い. 低 分 子 の 解 析 は 一般 に0.8∼1.OOA分 解 能 で あ り,さ ら に高 分 解 能 の 精 密 解 析 も行 わ れ る.と こ ろ が タ ンパ ク 質 日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996)385

図7.分 解 能 と電 子 密 度 図.Cys-Ser-Glu-Trp-OH.3H2Oで

の モ デ ル 計 算.温 度 因 子 は,主 鎖 原 子(β 原 子 も 含 む)はSA2,側 鎖 原 子 は7A2,水(遊 離 し た3個)は 10A2.(a)1.5A分 解 能,(b)02A分 解 能,(c)03A 分 解 能. 結 晶 で は,温 度 因 子 が 低 分 子 結 晶 よ り も大 き い だ け で は な く,結 晶溶 媒 の構 造 の無 秩 序 性,タ ンパ ク質 自体 の(主 に分 子 表 面 の)構 造 の 無 秩 序 性 が 大 き く,格 子 構 造 の 周 期 性 のず れ も無 視 で きず,さ ら にX線 損 傷 も無 秩 序 性 を 増 大 す る.こ れ らが す べ て 協 調 して,高 次 の 反射 を弱 く, つ い に は測 定 で きな く して しま う.こ の 結 果,タ ンパ ク 質 結 晶 で は,1A程 度 の 分 解 能 の解 析 が で き る もの は まっ た く例 外 的 な もの で あ る.で き る だ け 高 次 の デ ー タ ま で 測 定 して も,小 さい結 晶性 が 良 い タ ンパ ク 質 で1.5A程 度 の 解析 が で きれ ば 最 高 で あ る.複 雑 な もの で は3∼3.5A 程 度 で も満 足 しな け れ ば な らな い.さ ら に結 晶 性 が 悪 い もの も多 い. で は,い ろい ろ な分 解 能 の フ ー リエ 図 の特 徴,お よび そ こ か ら得 ら れ る 構 造 情 報 を 図7を 参 考 に して纏 め て み よ う.1.5λ:原 子 が ほ ぼ 分 離 して 見 え る.し か し,C=0 基 で は 電 子 の 少 ないC原 子 はや や 見 難 い.2∼2.5減:ほ と ん どす べ て の 側 鎖 が特 有 の形 を表 し,同 定 で きる.モ デ ル の作 成 が さ ほ ど難 し くな く,信 頼 度 の 高 い 精 度 の構 造 が 得 られ る こ とが わ か る.た だ し,細 部 は 明 確 で は な い場 合 もあ る.3λ:ペ プ チ ド主 鎖 が ほ ぼ トレー ス で き, 側 鎖 が 同 定 で き る もの も多 い.S-Sグ ル ー プが ま だ 明 瞭 に は現 れ な い こ と もあ る.5∼ 語:分 子 の お お よそ の外 形 が 見 やす い.α らせ ん は棒 状 に現 れ,ヘ ム 基 は 中 心 が厚 い 円盤 状 に見 え る. 1.5∼2A分 解 能 の解 析 で,用 い られ る観 測 値(反 射)の 数 は 原 子 一個 当 り数 個,す な わ ち変 数 の 数 と観 測 値 の 数 が ほ ぼ 同 程 度 に な る.図7を み る と側 鎖 の コ ンポ メ ー シ ョ ン等 につ い て もあ る程 度信 頼 度 の あ る解 析 を行 うた め に は最 低2∼2.OSAの 分 解 能 が 必 要 で あ る こ とが わ か る. 7.2温 度 因 子 タ ンパ ク質 結 晶 で は,Bは 非 常 に大 き く,10A2以 上 が 一 般 的 で あ る_{.温 度 因 子 は熱 振 動 の 平 均 自乗 変位 を示 す} パ ラ メ ー タで あ る が,タ ンパ ク質 結 晶 で は原 子 の 動 き易 さ を示 す パ ラ メ ー タで あ る と考 え る こ と もで き る.実 験 お よ び計 算 の 難 点 に 由 来 す る誤 差 が ほ とん どす べ て 温 度 因 子 に集 積 す る の で そ の定 量 的 解 析 は 難 しい が,精 度 を 上 げ て温 度 因 子 を詳 し く調 べ る こ とは構 造 と活 性 の 研 究 に極 め て 貴 重 な情 報 を提 供 して くれ る よ うで あ る.束 縛 が 小 さい 単 結 合 の ま わ りの 側 鎖 の 回 転,隣 接 した偶 数 の 側 鎖 が協 調 した フ リ ップ 運 動,基 質 等 の取 り込 み に必 要 な局 所 的 な呼 吸 運 動,さ らに この よ うな 運 動 に伴 う溶 媒 分 子 の 運 動 等 の 影 響 が す べ て温 度 因 子 に含 ま れ て くる. 活 性 中 心 周 辺 の熱 振 動 の 観 察 か ら活 性 に関 す る有 用 な情 報 が 得 られ る こ と も多 い. 7.3解 析 精 度 解 析 の 全 体 的 な精 度 はR因 子(freeRも 含 め る)で 判 定 す る.低 分 子 の 結 晶 解 析 とは 異 な り,タ ンパ ク 質結 晶 で は0.10∼0.20程 度 に しか な ら ない.R因 子 と分 解 能 に 対 して 原 子 の座 標 値 の平 均 誤 差 が 理 論 的 に計 算 され て い

て(Luzzati plot),一 例 を示 す と,2A分 解 能 でR=0.23

な らば 平均 誤 差 は約0.02A,R=0.12な ら誤 差 は約0.lAで あ る.精 度 の 評 価 の 一 つ の 目安 に で き よ う. 個 々の 原 子 の 座 標 値 の 精 度 は 分 子 内 の 原 子 の位 置 に よ る ば らつ きが 大 き い.分 子 内 部 の 原 子 の 熱 振 動 は小 さ く フー リエ 図 は 明 瞭 で 座 標 値 の 精 度 は 高 い,一 方,分 子 表 面 の 原 子 の 見 か け の温 度 因子 は 大 き く電 子 密 度 は小 さ く 精 度 は低 い,対 応 す る電 子 密 度 が ま った く現 れ ず位 置 が 決 め られ な い 原 子 も多 い.タ ンパ ク質 分 子 表 面 近 くにあ っ て,水 素 結 合 で 結 合 して い る溶 媒 分 子 も電 子 密 度 が 明 瞭 で あ れ ば信 頼 度 が 高 い.定 性 的 に は個 々 の原 子 座 標 の 精 度 は フ ー リエ 図 上 の電 子 密 度 の 高 さ に よ っ て定 ま る. 7.4構 造 の 整理 検 討 タ ンパ ク質 結 晶 で は,い ろ い ろ な 観 点 か らの結 果 の 整 理 が 必 要 で あ る.分 子 の作 図 は,全 原 子 を 図示 す る と複 雑 す ぎる の で い ろ い ろ な便 法 が 用 い られ る.最 も簡 単 で よ く用 い られ るの は全 ア ミノ酸 残 基 のCα を連 ね た主 鎖 構 造 の 図 で,ミ オ グ ロ ビ ン以 下 多 くの タ ンパ ク 質 で よ く用 い られ て き た もの で あ る.立 体 図 の 一 例 を 図8に 示 す. 二 次 構 造 は,主 鎖 の 内 部 回 転 角(φ Ψ),主 鎖 間 のN-H…0=C水 素 結 合 の パ タ ー ンお よび,Cα 間 距 離 等 を調 べ る こ と に よ り明 か に され る.構 造 の 図 示 に よ く用 い られ る コ ン ピ ュ ー タプ ロ グ ラ ム はORTEP,PLUTO等 の 初 期 の もの の 他 に,構 造 の 特 徴 を う ま く表 す 多 くの プ ロ グ ラ ムが 開発 され,利 用 され て い る. 得 られ た 構 造 の 検 討 に必 要 な 構 造 パ ラ メ ー タ ー につ い て述 べ て お き た い.束 縛 条 件 付 きの 精 密 化 を行 って い れ ば,結 合 距 離 が 同 種 の結 合 の 平 均 距 離 か ら有 意 にず れ る こ とは な い が,結 合 角 は 構 造 に よ り系 統 的 に か な り大 き くず れ る もの が あ る.中 で も主 鎖 の結 合 角 τ(NCαC)は 104° ∼117°。と広 く分 布 す る こ と に は注 意 が 必 要 で あ る. 主 鎖 の 内 部 回転 角(φ Ψ)のRamachandranプ ロ ッ トは, 二 次 構 造 の 頻 度 な どの 特 徴 の 他 に,主 鎖 構 造 の 精 度 を教 386

タ ンパ ク質 結 晶構 造 解 析 入 門 図8.Cα 原 子 を結 ん で 描 い た(立 体)分 子 図 の 一 例. え て くれ る.Gly以 外 で(φ Ψ)が 許 容 領 域 か ら大 き くず れ る もの は構 造 の慎 重 な 検 討 が必 要 で あ る.ペ プ チ ド結 合 は トラ ンス(T)で,内 部 回転 角 ω が180。 か ら15。 以 上 ず れ る こ と は ほ と ん どな い.た だ し,Proの ペ プ チ ド結 合 で は シス 型 もほ ぼ5%の 確 率 で 見 ら れ る.内 部 回 転 角 x'(N-Ca-CR-CY)は,側 鎖 の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン を示 す が,G+,T,G-の 頻 度 の比 は ほ ぼ(1:2:3)で あ る. そ の 理 想 値60。,180。,300。 か ら の ず れ が 大 きい 構 造 は よ く再 検 討 す る必 要 が あ る.ア ミ ノ酸 残 基 ご との 温 度 因 子,水 素 結 合,露 出 表 面 積 の 見 積,溶 媒 分 子 の 構 造, 等 の情 報 も構 造 の理 解 に必 須 で あ る. 解 析 に用 い られ た す べ て の 観 測 値,詳 細 な構 造 パ ラ メ

ー タは論 文 発 表 と同 時 に ”Protein Data Bank” に登 録 さ

れ る. 8.タ ン パ ク 質 結 晶 学 の 歴 史 タ ンパ ク質 の結 晶 が 初 め て得 られ た の は1927年 の酵 素 ウ レアー ゼ(分 子 量483K)の 結 晶 で あ る.続 い て,1930 年 代 前 半 にペ プ シ ン,ト リプ シ ン,キ モ トリプ シ ン,ヘ モ グ ロ ビ ン,イ ン シ ュ リ ン,タ バ コ ・モ ザ イ ク ・ウ ィル ス な どが 結 晶 化 され て い る. タ ンパ ク 質 結 晶 のX線 に よ る研 究 は1934年Bernal とCrowfoot(後 のHodgkinで,イ ン シ ュ リ ン を解 析 し た)が ペ プ シ ンの 結 晶 のX線 結 晶 回 折 写 真 を撮 っ て 始 ま っ た.結 晶 内 で タ ンパ ク 質 分 子 が,一 定 の 立 体 分 子 構 造 を持 ち,規 則 正 しい 三次 元 結 晶 格 子 を作 っ て い る こ とが 明 らか に され た.ま た,結 晶 が 多 量 の水 を含 ん で い て,空 気 中 で は 容 易 に乾 燥 し結 晶 格 子 が 壊 れ る こ と,と こ ろが 結 晶 を母 液 を加 え た封 管 中 に入 れ て お け ば 結 晶 は壊 れ ず, シ ャー プ な 回折 線 が 得 られ る こ と も明 か に した.タ ンパ ク質結 晶 の 重 要 な 有 用 な性 質 が 最 初 の 実 験 で 明 らか に さ れ た の で あ る.Pemtzが ケ ンブ リ ッジ で ヘ モ グ ロ ビ ンの 構 造 解 析 を開 始 した の は1937年 で あ る. 1951年,PaulingとCoreyは ア ミノ酸 や 小 さいペ プ チ ド の 結 晶 構 造 解 析 か ら,ペ プ チ ド鎖 の 局 部 的 な構 造 お よび 主 鎖 間 水 素 結 合 の ル ー ル 等 を定 め,さ ら に繊 維 状 タ ンパ ク質 の 規 則 構 造 と して α らせ ん お よび βシ ー トの モ デ ル を提 案 した.こ の 二 つ は球 状 タ ンパ ク 質 中 で も最 も多 く 見 られ るペ プ チ ド鎖 の 規 則 的 な構 造(二 次 構 造)で あ る. WatsonとCrickがX線 繊 維 写 真 の 解 析 か らDNAの 二 重 らせ ん 構 造 を提 案 し,分 子 生 物 学 の 発 展 の 緒 口 を作 った の も この 頃(1953年)で あ る.多 くの 生 体 高 分 子 の 中で, 立 体 構 造 が 解 析 さ れ て 生 物 科 学 に 最 大 の イ ンパ ク トを与 え た の は こ のDNAの2重 らせ ん 構 造 の 提 案 で あ ろ う. DNAは 長 い 二 重 らせ ん で あ り,延 伸 す る と分 子 自体 が1 次 元 の 周期 構 造 を もつ 結 晶 で あ る と見做 す こ とが で き,質 の 高 いX線 繊 維 写 真 を与 え,構 造 が 決 定 され たの で あ る. 1940年 代 後 半 にKendrewがPerutzの グ ル ー プ に 加 わ り,ヘ モ グ ロ ビ ン と類 縁 の ミオ グ ロ ビ ンの 研 究 を開 始 し た.こ の グ ル ー プ は1950年 す ぎか ら と くに重 原 子 同型 置 換 法 の 開発 を始 め,1954年 にPerutzは 重 原 子 同型 置 換 法 が タ ンパ ク質 結 晶 の 回 折X線 の位 相 角 決 定 に有 効 で あ る こ と を示 した.こ の 方 法 を用 い て,Kendrew等 は1958年 に ミオ グ ロ ビ ンの06Aの 解 析 を,1960年 に2.8Aの 解 析 を 報 告 し,Perutz等 は1960年 にヘ モ グ ロ ビ ンの5.OSAの 解 析 を 報 告 した.Perutzは そ の 後 も長 く種 々 の ヘ モ グ ロ ビ ン の研 究 を続 け,そ の 複 雑 な しか し極 め て 合 目的 的 な生 物 学 的機 能 を原 子 レベ ルで ほぼ 解 明 した と考 え られ て い る. この 頃 か ら欧 米 の 数 カ所 で 酵 素 タ ンパ ク質 の 結 晶解 析 が 始 ま り,数 年 後 に リ ゾチ ー ム,キ モ トリ プ シ ン,リ ボ ヌ ク レ アー ゼ,カ ル ボ キ シペ プチ ダ ー ゼ な どの解 析 が 続 き, 徐 々 に解 析 例 が 増 加 した.こ こで,酵 素 機 能 の本 質 の 理 解 に立 体 構 造 が 不 可 欠 な重 要 な情 報 で あ る こ とが 明 らか に さ れ た.し か し なが ら,当 時 は結 晶 解 析 の成 果 は 高 く 評 価 され なが ら も,ま だ ご く一 部 の 専 門家 だ け の もの で あ る とい う よ う に見 られ て い た. 1980年 代 に な っ て 放 射 光X線 光 源,X線 回折 機 器,お よ び解 析 計 算 の コ ン ピュ ー ター と ソ フ トウエ ア の 発 展 に よ り,構 造 解 析 も格 段 に 容 易 に,速 く,か つ 精 度 が 高 く な り,質 量 と も に 大 き く発 展 した.一 方,遺 伝 子 工 学, タ ンパ ク 質工 学 が 発 展 し,タ ンパ ク 質(お よび 核 酸)の 一 次 構 造 の 決 定 が 容 易 にか つ 正 確 に な り ,さ らに部分 的 に ア ミノ酸 残 基 を変 換 し た人 工 変 異 タ ンパ ク質 も作 れ る よ う に な っ た.こ の よ う な 解 析 法 と生 物 科 学 の 進 展 で, タ ンパ ク 質 結 晶 構 造 解 析 の 必 要 性 が 広 い 分 野 で 認 識 され る よ う に な り,大 学 の み な らず 民 間 で も,研 究 者 が 急 激 に 増 加 して きた. この 分 野 で,Sumner,Pauling,Perutz,Kendrew,Watson, Crick,Wilkins,Hodgkin,Lipscomb,Huber,Deisenhofer, Michelが ノ ー ベ ル 賞 を受 賞 して い る.こ の 狭 い 分 野 に こ れ だ け多 くの 受 賞 者 が 出 た こ とは,こ の 分 野 が そ れ だ け 重 要 で 注 目 され て い る こ と を示 して い る. わ が 国 で は,1965年 に大 阪 大 学 タ ンパ ク質研 究 所 角 戸 研 究 室 で チ トク ロ ー ムcの 結 晶 化 が 始 ま り,4A分 解 能 の 解 析 が1969年 に,続 い て2.03Aの 解 析 が1972年 に完 成 した.そ の後 名 古 屋 大 学 の 坂 部 の 高 分 解 能 の イ ン シ ュ リ 日本 結 晶 学 会 誌 第38巻 第6号(1996) 387

ン の 解 析 が 続 い た が,国 内 の 研 究 者 の 数 は し ば ら く は 極 め て 少 数 で あ っ た.1980年 代 に な っ て,放 射 光 と い う 超 強 力 なX線 源 と イ メ ー ジ ン グ プ レ ー トと い う 強 力 な2次 元 検 出 器 の 助 っ 人 を 得 て,ハ ー ド面 が 大 い に 発 展 し て き た.と く に,高 エ ネ ル ギ ー 物 理 学 研 究 所 放 射 光 実 験 施 設 の 坂 部 の ス ク リ ー ン レ ス ・ワ イ セ ン ベ ル グ カ メ ラ は 世 界 中 か ら 利 用 希 望 者 が 集 ま り,世 界 で 最 も 多 く の 質 の 良 い デ ー タ を 供 給 し て い る.一 方,研 究 者 も 徐 々 に 増 加 し, 解 析 の 成 果 の 数 も 増 え て き た.つ い 最 近(1995年),チ ト ク ロ ー ムcオ キ シ ダ ー ゼ 複 合 体 の2.8A分 解 能 の 解 析 が 月 原 ら に よ っ て 報 告 さ れ た.こ れ は 総 分 子 量 が50万 に 近 い 膜 タ ン パ ク 質 で,分 解 能 の 高 い 解 析 は 困 難 で は な い か と見 ら れ て い た も の で あ る が,精 度 の 高 い 解 析 が 成 功 し た.10年 に 近 い,と く に 結 晶 化 の 努 力 の 結 果 得 ら れ た こ の 成 果 は 意 義 が 大 き く,画 期 的 な イ ン パ ル ス を 与 え た. こ の よ う に 世 界 を リ ー ドす る 成 果 も 現 れ る よ う に な っ て き た.Spring8も い よ い よ稼 働 を 始 め よ う と し て お り,研 究 環 境 も さ ら に 改 善 さ れ よ う と し て い る. 9.付 録 一 タ ン パ ク 質 構 造 の 専 門 用 語 原 子,内 部 回 転 角 命 名 法 タ ン パ ク 質 ペ プ チ ド鎖 を 図 9に 示 す.iは ア ミ ノ 酸 残 基 の 序 数.側 鎖 の 原 子 は 主 鎖 の Caに 結 合 して い るCβ か ら 順 にCY(0γ),Cδ,と 呼 ば れ る.詳 し く は 命 名 法[IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Mol. Biol.52,1-17(1970)]

を 参 照 の こ と.側 鎖 の 内 部 回 転 角(捩 れ 角)は 順 に,x' (N-Cα-Cβ-CY),x2(Cα-Cβ-Lr-Cδ),で 表 さ れ る.一 般 に 内 部 回 転 角,0=0°,60°,180°,300°(=-60°)が そ れ ぞ れ,シ ス,ゴ ー シ ュ(G+),ト ラ ン ス(T),ゴ ー シ ュ(G-)に 対 応 す る.ペ プ チ ド結 合 は40%程 度 の 二 重 結 合 性 を 持 ち,ω(Ca-C'-N-Ca)は トラ ン ス で,4個 の 原 図9.(a)タ ン パ ク 質 ペ プ チ ド鎖 の 原 子 お よ び 内 部 回 転 角 命 名 法.Tは ア ミ ノ 酸 残 基 番 号(b)内 部 回 転 角,A-B-GDと 結 合 し て い る と き に,結 合B-Cの 内 部 回 転 角 は,B(手 前)とCを 重 ね て 投 影 し(Newmann投 影),Aを 基 点 に して 時 計 方 向 にDま で の 角 を 測 る. 図10全20種 の ア ミ ノ酸 側 鎖Cβ か ら示 さ れ て い る. 子 は ほ ぼ 平 面 状 で あ る.し た が っ て(φ,Ψ)が 分 子 の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン を 決 定 す る. ア ミ ノ 酸 側 鎖 図10に 示 す. 文 献

I) T.L.Blundell & L.N.Johnson: Protein Crystallography, Academic

Press, (1976) (古いが,数 少 ない ま とまった成 書)

2) H.W.Wyckoff, C.H.W.Hirs & S.N.Timasheff ed.: Diffraction Methods for Biological Macromolecules (Methods in Enzymology, Vols.

114&115),AcademicPress,(1985).(古 い が,方 法 が 詳 しい) 3) 芦 田 玉 一,田 中 信 夬:新 実 験 化 学 講 座,基 礎 技 術5,構 造 解 析, pp.257-303,丸 善(1977).(古 い が,邦 文 の ま と ま っ た 解 説) 4)日 本 結 晶 学 会 誌,vol.38,No.1.(1996)(特 集 号-タ ン パ ク 質 結 晶 学 と構 造 生 物 学,国 内 研 究 者 に よ る 最 近 の 成 果 と動 向 の 解 説) プ ロ フ ィ ー ル 芦 田 玉 一TamaichiASHIDA 連 絡 先:〒465名 古 屋 市 名 東 区 大 針1-299 1-299 Oobari,Meito-ku,Nagoya 465,Japan Tel.Fax.052-703-2046 最 終 学 歴:大 阪 大 学 理 学 部 化 学 科 専 門 分 野:X線 結 晶 学,構 造 化 学 現 在 の 研 究 テ ー マ:タ ンパ ク質 構 造 化 学 趣 味:読 書,囲 碁,ゴ ル フ,草 花 栽 培