原 著
Candida albicans
の形態変化に対する抗真菌薬効果
の検討―各種抗真菌薬における sub-MIC 効果―
橋本 佳祐
1)眞野 容子
2)古谷 信彦
1) 1) 文京学院大学大学院保健医療科学研究科（〒 113-0023 東京都文京区向丘 2-4-1） 2) 文京学院大学保健医療技術学部 要 旨 Candida albicansは二形性真菌であり，ヒトに対して病原性を発揮する際には菌糸形として存在する．しかし，現在臨 床現場で行われている C. albicans の薬剤感受性試験は酵母形を対象としたものであり，実際の人体内において病原性を発 揮する菌糸形の薬剤効果を反映したものとは異なると考えられる．このことから，今回我々は酵母，発芽管，菌糸各形態 最大時の C. albicans に対する抗真菌薬の効果について比較検討した．C. albicans は 2 時間培養した時点で発芽管細胞の割 合が約 80%と最大になり，4 時間培養した時点では菌糸形の割合が約 90%と最大になった．MIC の比較は形態による差は みられなかった．酵母形最大時における amphotericin B 添加では sub-MIC でも菌糸形への形態変化が抑制された．5-fluorocytosine（5-FC），fluconazole（FLCZ）は MIC のみ抑制された．しかし，発芽管あるいは菌糸最大時における添加で は 5-FC，FLCZ とも酵母への分裂に影響を及ぼさなかった．以上のことから薬剤添加時の C. albicans の形態によって薬剤 応答にも変化が生じる可能性が示唆された． キーワードCandida albicans，amphoterichin B，形態変化，sub-MIC
Candida albicansは，通常健常者の口腔，皮膚，咽 頭などの正常細菌叢に存在する二形性真菌である． 病原性を発揮する際には，酵母形から菌糸形へと形 態を変化させ，生体組織に定着，増殖し，標的とな る組織に傷害を与える．さらに感染の進行によって 真菌血症や全身感染を引き起こす1),2)．近年ではこの 菌糸形への形態変換能力が深在性真菌症における病 原性の重要な要因であると考えられている3)～5)． 現在の真菌症治療は，選択肢の幅こそ増加してい る．しかし，劇的な改善までには至らないのが現状 である．さらには，薬剤の副作用など適正投与に支 障をきたす問題も多い6)．
現 在 in vitro で 実 施 さ れ て い る Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）に基づく微量液 体希釈法 M27-A3 は酵母形を対象としたものであ り，菌糸形への効果を反映したものとは異なる．C.
albicansの組織侵入型が菌糸形であることを考慮す
ると，M27-A3 において対象となる菌の形態は菌糸 形であることが望ましいと考えられる．そこで今回 我々は M27-A3 に使用する RPMI 1640 broth の中で
C. albicansが形態変化を起こすのかを確認し，全真
菌細胞に対する酵母，発芽管，菌糸の各形態比が最 大となる時期に各種抗真菌薬を添加し，最少発育阻 止濃度 minimum inhibitory concentration（MIC）の比 較，形態変化に対する影響，について検討した．
I 方 法 1．使用菌株
C. albicans ATCC 90028株を対象とした．
2．使用薬剤
amphotericin B（AMPH-B, Merck KGaA, Darmstadt, Germany），5-fluorocytosine（5-FC, Sigma-Aldrich Co. LLC., Tokyo, Japan），fluconazole（FLCZ, Wako Pure
Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan）の 3 薬剤を使 用した． 各種抗真菌薬における MIC の設定濃度範囲は CLSIに基づき AMPH-B は 0.032～16 μg/mL，5-FC と FLCZ は 0.125～64 μg/mL とした． 3．培地の調整方法 使用培地は 1 mol/L NaOH で pH 7.0 ± 0.1 に調整し た 2%グルコースおよび 0.165 mol/L MOPS 添加 RPMI 1640 broth（L-グルタミン，フェノールレッド 含有，重炭酸非含有）（Sigma-Aldrich）を用いた． 4．C. albicans における各形態の経時的変化 ポテトデキストロース寒天培地（Eiken Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan）にて 35 ± 1℃で 24 時間培養 した被験菌株を滅菌生理食塩水にて McFarland No. 0.5に調製し，被験菌の形態が全て酵母形であること を鏡検にて確認した上で，RPMI 1640 broth を用いて 200倍希釈した．形態の観察は培養開始から 0，2， 4，6，24，48 時間経過した時点で無染染色標本を作 製し，光学顕微鏡を用いて経時的に行った．形態の 割合は（対象形態/総菌数）× 100 の式により算出し た．形態の判定として，楕円形のものを酵母．酵母 より発芽のみられたものを発芽管．発芽管よりさら に伸長し，隔壁のみられたものを菌糸とした7)． 5．薬剤感受性試験 薬剤感受性試験は CLSI8)に準拠した微量液体希 釈法 M27-A3 に従い実施した．酵母，発芽管，菌糸 の 割 合 が 最 大 と な る 時 間 ま で 培 養 し た 菌 液 を McFarland No. 0.5に調製し，菌液の 1,000 倍希釈液 をマイクロプレートに 100 μL ずつ接種後，35 ± 1℃ で 24 時間，48 時間培養し，肉眼による濁度判定を 行った． MICの判定はウェル内の菌を均一になるように浮 遊させ，目視にて実施した．CLSI のスコア基準に従 い，AMPH-B の MIC はスコア 0 すなわち完全発育 阻止濃度とし，その他の抗真菌薬の MIC はスコア 2 以下，すなわち対象と比較して 50%程度の増殖抑制 が見られた最小濃度とした．すなわち，陽性コント ロール混濁液と陰性コントロール液を等量混合した 陽性コントロールの 50%濃度菌液（IC50）を設け， これと同等の混濁をスコア 2 と判定した． 6．抗真菌薬添加による形態変化への影響 各形態（酵母，発芽管，菌糸）の割合が最大とな る時間を各種抗真菌薬の接触開始時間（0 時間）と した．薬剤感受性試験より得られた酵母形の薬剤感 受性試験より得られた酵母形の MIC，および最終薬 液濃度を 1/4，1/8 MIC に調製した各種抗真菌薬を被 検菌液に添加し培養した．各培養開始直後から 6 時 間まで鏡検にて形態の観察を実施し，それぞれの全 真菌細胞における酵母の割合の経時的変化を観察し た．また，発芽管，菌糸においては接触開始時間で の形態の割合を一定にできないため今回の検討では， 全体での平均を開始時の割合として表記した． II 結 果 1．C. albicans における各形態の経時的変化 真菌細胞は培養開始直後の RPMI 1640 broth 内で は全て酵母形として存在した．2 時間培養後では発 芽管の形成が細胞全体の 79%に確認された．4 時間 培養では菌糸形が全体の 89%を占め，残りは発芽管 細胞として存在していた．6 時間培養以降では菌糸 からの分裂，拡散により酵母形の増加が顕著にみら れ，48 時間では全体の 89%が酵母形として存在した （Table 1）． 2．各形態での MIC の比較 AMPH-B，5-FC，FLCZ の 3 薬剤における MIC は 酵母最大時に薬剤を添加した場合を基準として発芽 管最大時及び，菌糸最大時と比較検討した．いずれ の形態が最大時であっても，AMPH-B，5-FC，FLCZ の MIC の差は 1 管差以内にとどまった（Table 2）． The proportion of yeast form of Candida albicans as the culture time
Form 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h 10 h 24 h 48 h
Yeast 100% 21% 0% 26% 57% 64% 75% 89%
Germ tube 0% 79% 11% 11% 0% 0% 1% 1%
Hyphae 0% 0% 89% 63% 43% 36% 24% 10%
Table 1
MICs (μg/mL) determined by broth microdilution against the respective dominant form of Candida albicans ATCC 90028
Agent Referance range Yeast Germ tube Hyphae
AMPH-B 0.5–2 1 2 2
5-FC 0.5–2 0.5 0.5 1
FLCZ 0.25–1 0.25 0.5 0.5
AMPH-B, amphoterichin B; 5-FC, 5-fluorocytosine; FLCZ, fluconazole
3．各種抗真菌薬添加による形態変化の検討 被検菌液が全て酵母形の時に MIC に調整した AMPH-Bを添加すると，酵母から菌糸への形態変化 は顕著に抑制され，ほとんどが酵母形のまま存在し た．1/4，1/8 MIC 添加においても形態変化の抑制は controlに比べ顕著に抑制された．5-FC，FLCZ では， MIC添加により control に比べ高い形態変化の抑制 がみられたが，1/4，1/8 MIC 添加時では control とほ とんど差がみられなかった（Table 3）． 発芽管の割合が最大を占めている場合では，MIC 添加において AMPH-B は control と比べて，24 時間， 48時間での酵母形への分裂が抑制された．しかし， 5-FC，FLCZ を添加した場合，control と同様 24 時 間，48 時間培養での全真菌細胞の 80%が酵母形と なった．各種抗真菌薬の 1/4，1/8 MIC 添加時におい ても同様の傾向がみられた（Table 4）． 菌糸形の割合が最大を占めている場合では，MIC 添加において AMPH-B は菌糸形から酵母形への分裂 を強く抑制したが，1/4，1/8 MIC 添加時では，形態 変化の遅延はみられたが，24 時間，48 時間経過後で は新たに出現した酵母形が大半を占めていた．5-FC，FLCZ では MIC，1/4，1/8 MIC いずれにおいて も形態変化に対する顕著な抑制効果はみられなかっ た（Table 5）． III 考 察 C. albicansにおける酵母から菌糸への形態の変化 は最も議論されている問題の一つである．各形態は， 感染の進行状況に応じて定着，侵入，傷害，播種， 免疫回避などの異なる機能を持つ2)．特に酵母は播 種に，菌糸は侵入，傷害に関与している1)～3)．Lo
Effect of 3 antifungal agents to the yeast in Candida albicans which the yeast form dominate
Time Control AMPH-B 5-FC FLCZ
MIC 1/4 1/8 MIC 1/4 1/8 MIC 1/4 1/8
0 h 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 2 h 21% 100% 83% 83% 77% 24% 18% 96% 38% 15% 4 h 0% 92% 85% 76% 48% 18% 12% 74% 17% 8% 6 h 26% 100% 95% 78% 35% 43% 29% 73% 24% 7% 24 h 75% 98% 87% 59% 87% 83% 79% 87% 73% 70% 48 h 89% 100% 74% 70% 83% 88% 81% 87% 76% 55% Table 3
Effect of 3 antifungal agents to the yeast in Candida albicans which the germ tube form dominate
Time Control AMPH-B 5-FC FLCZ
MIC 1/4 1/8 MIC 1/4 1/8 MIC 1/4 1/8
0 h 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 25% 2 h 0% 18% 0% 35% 16% 0% 0% 7% 4% 29% 4 h 26% 38% 13% 0% 13% 17% 16% 17% 14% 27% 6 h 57% 20% 0% 23% 24% 12% 4% 50% 0% 48% 24 h 85% 54% 61% 41% 88% 74% 76% 83% 77% 72% 48 h 72% 64% 47% 68% 84% 88% 79% 91% 65% 79% Table 4
Effect of 3 antifungal agents to the yeast in Candida albicans which the hyphae form dominate
Time Control AMPH-B 5-FC FLCZ
MIC 1/4 1/8 MIC 1/4 1/8 MIC 1/4 1/8
0 h 12% 12% 12% 12% 12% 12% 12% 12% 12% 12% 2 h 26% 0% 5% 0% 26% 0% 13% 20% 0% 3% 4 h 57% 7% 0% 26% 29% 14% 41% 42% 3% 15% 6 h 64% 4% 0% 37% 30% 21% 28% 68% 18% 39% 24 h 85% 4% 64% 78% 82% 85% 77% 85% 64% 59% 48 h 77% 6% 75% 70% 85% 77% 85% 89% 74% 67% Table 5
ら4)によると菌糸形への変換能力を持つ C. albicans 標準株と変換能力を失った C. albicans 変異株の病原 性の比較を行ったところ，標準株に対し，変異株で は極度の毒性の減衰がみられたと報告されている． このことから菌糸形への形態変化が病原性に深く関 与していることが考えられており，近年では形態変 化の抑制が新たな治療戦略として研究が行われて いる5)． 今回の検討では福松，小笠原らの検討と同様 C. albicansの形態変化は培養開始より 3 時間後に菌糸 形が出現，増加し，4 時間後に割合が最大となり， 最も病原性の強い時期であると考えられた9),10)．C. albicansは組織内にて病原性を示す場合には菌糸形 が主であるとされているが，現在臨床で用いられて いる薬剤感受性試験では酵母形を対象としているこ とから，本来の MIC とは異なることが示唆される． このことから実際にカンジダ症治療の際にはこれら の形態による変化を念頭において菌糸形に対する MICを決定する必要がある．我々は各形態が最大と なる時期に薬剤を添加し，MIC を測定したが，ほと んど差はみられず，接種菌の形態による MIC の差は 考慮しなくてもよいものと考えられた． 形態変化への抗真菌薬の影響については，5-FC と FLCZでは，発芽管，菌糸最大時とも，いかなる濃 度で薬剤を添加しても control とほぼ同じ形態変化の パターンを示した．しかし，酵母最大時での MIC 添 加では形態変化の抑制が確認されたことから，酵母 形に対して抑制効果が高いと考えられた．近年では， カンジダ症患者における治療の遅延による死亡率の 増加が報告されているが11)～13)，我々の検討からは 5-FCや FLCZ は酵母から菌糸形への形態変化を抑制 するので，カンジダ症においては早期投与がより効 果を高めるものと思われた． AMPH-Bでは，MIC において形態を問わず抑制効 果が得られ，酵母形に対しては sub-MIC でも形態の 抑 制 効 果 が み ら れ た ． Lewis ら14)は sub-MIC の AMPH-Bによって，バイオフィルムの形成が阻害可 能であると報告されている．さらに我々の研究では sub-MICの AMPH-B が形態変化を抑制することが明 らかになった．よって AMPH-B は sub-MIC でも C. albicansに抗真菌活性を示すことが示唆された． 各形態最大時での薬剤添加による形態変化は発芽 管，菌糸最大時に比べ酵母最大時に高い抑制効果が みられた．これは，酵母形最大時，すなわち培養開 始直後ではシグナル伝達系の誘導が開始されてお らず15),16)，この時点で抗真菌薬を添加すれば形態の 変換機構に影響が生じて発芽管，菌糸への誘導が抑 制されると考えられる．一方，発芽管，菌糸最大時 ではすでに菌糸誘導が開始されており，この時点で 抗真菌薬を添加しても薬剤の効果は弱く誘導を抑制 することは難しいと考えられた．以上のことから薬 剤添加時の C. albicans の形態によって薬剤応答にも 変化が生じる可能性が示唆された． IV 結 語 C. albicansの形態変化に対する抗真菌薬の影響に ついて検討した．薬剤添加による形態変化は発芽管 や菌糸最大時に比べ酵母最大時では低濃度での AMPH-B添加でも高い抑制効果がみられた．このこ とから C. albicans は形態の違いによって薬剤応答に も変化が生じる可能性が考えられる．さらに C. albicansが酵母形であれば低濃度での抗真菌薬でも 病原性の抑制が可能と考えられ，抗真菌薬において 問題となっている副作用の軽減が期待されることが 示唆された． ■文献
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Effects of antifungal agents on morphological transition of
Candida
albicans
ATCC 90028—sub–MIC effect of antifungal agents—
Keisuke HASHIMOTO1) Yoko MANO2) Nobuhiko FURUYA1)
1)Health Care Science, Graduate School of Bunkyo Gakuin University(2-4-1, Mukogaoka, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0023, Japan)
2)Faculty of Health Science Technology, Bunkyo Gakuin University
Summary
Candida albicans is a dimorphic fungus. When pathogenic, C. albicans is in the hyphal form. However, drug
susceptibility tests are performed against the yeast form rather than the hyphal form. Therefore, we compared the effects of an antifungal drug on both forms. After 2 hours of incubation, 80% of C. albicans was in the germ tube form. After 4 hours of incubation, 90% of C. albicans was in the hyphal form. No difference in MIC due to the form was observed. When amphotericin B was added when the yeast form was dominant, the switch to the hyphal form was suppressed at all concentrations below the MIC, whereas 5-fluorocytosine(5-FC) and fluconazole(FLCZ) suppressed the switch only at the MIC. However, when 5-FC or FLCZ was added when the germ tube, hyphal form was dominant, the switch to the yeast form was not suppressed at MIC. These findings demonstrate that the drug response depends on the form of C. albicans when the antifungal agents are added.
Key words: Candida albicans, amphoterichin B, morhological transition, sub-MIC
