はじめに
脳梗塞に対する治療は，急性期の閉塞動脈の再灌流 療法と，慢性期の再発予防療法および機能回復を目指 した治療に大別される．再灌流療法として，血栓溶解 療法が行われおり，著者らは，これまで再灌流療法に 伴う出血合併症を抑制し，その治療適応患者の増加を 目指す研究を行ってきた1~4）．一方，慢性期の治療とし ての機能回復を目指したリハビリテーションでは，半 数が障害を残し5），ほかに有効な後遺症改善を促進す る治療もないため，新しい治療の開発が期待されて いる． 脳梗塞の機能回復を目指す戦略の一つとして，梗塞 部位の血管新生を促進するという考えがある6）．血管 新生を促進する成長因子（血管・組織リモデリング因 子）の一つとして，血管内皮増殖因子（VEGF）があり， VEGFの全身投与で，血管新生と機能予後の改善が ラット一過性局所脳虚血（tMCAO）モデルで示されて いる7）．しかし，全身投与により，低血圧・頻脈の副 作用8）や，急性期では脳浮腫・出血合併が生じうる7）． また，脳には血液脳関門（BBB）があり，とくに蛋白製 剤は脳内に届かず，作用しない恐れもある．つまり， 血管新生を促進する治療として，副作用がないこと， 脳内に有効に到達することが求められる． 近年，脳梗塞の亜急性期以降に，複数の治療標的に 作用する多面的な保護効果を期待する幹細胞療法がい くつか報告されてきた9~13）．骨髄由来間葉系幹細胞が 代表であり，細胞投与後，脳梗塞病変において VEGF などの成長因子を分泌し，血管新生を促進することで 機能を回復する12, 13）．期待される治療法である一方， 骨髄由来の細胞であり，脳梗塞後の抗血小板療法，抗 凝固療法下で採取が困難であること，十分な細胞数を 得るため専用の細胞調整センターを要することが，臨 床応用の普及の妨げになっている． 以上の状況を踏まえ，我々はミクログリアを用いた 新しい細胞療法について検討を行った．ミクログリア に着目した理由は，1. VEGF，トランスフォーミング 増殖因子（TGF）-β，マトリックス・メタロプロテナー ゼ（MMP）-9 といったリモデリング因子の分泌源とな ること，2. 脳梗塞後に病変辺縁に集まる性質があるこ 新潟大学脳研究所神経内科 ＊〒 951-8585 新潟県新潟市中央区旭町通 1-757 TEL: 025-227-0666 FAX: 025-223-6646 E-mail: masa2 bri.niigata-u.ac.jp doi: 10.16977/cbfm.28.2_315● 新評議員
脳梗塞後の機能回復を目指したミクログリアによる細胞療法
金澤 雅人
＊，高橋 哲哉，小野寺 理，下畑 享良
要 旨 脳梗塞後遺症の機能を回復させる治療法の確立が望まれている．ミクログリアを保護的ミクログリア（M2） に変化させる低酸素低糖刺激（OGD）の条件を決定し，M2-like ミクログリアを亜急性期に投与することで，脳 虚血後の機能予後を改善させることが可能かを検証した．初代ミクログリアの培養上清を試料として，血管内 皮増殖因子（VEGF），トランスフォーミング増殖因子（TGF-β），およびマトリックス・メタロプロテナーゼ （MMP）-9 活性を測定したところ，18 時間の OGD 後，M2 極性となっていることがわかった．さらに，ラット 一過性局所脳虚血モデルに対し，虚血 7 日後，M2-like ミクログリアを投与したところ，虚血中心の辺縁部に おける VEGF，TGF-β，MMP-9 の発現は増加し，さらに同部位の血管新生，ペナンブラにおける軸索伸展は， 非投与群と比べて促進され，虚血 4 週間後の機能を回復させた．OGD により M2 化したミクログリアを用い た細胞療法は，従来にない治療戦略になるものと考えられる． （脳循環代謝 28：315∼320，2017） キーワード : ミクログリア，M2 化，血管新生，軸索伸展，脳梗塞と14, 15），3. M2-like ミクログリアという保護的な性質を 持つタイプも存在することにより16, 17），有効な効果が 期待できるためである．検討の結果，薬剤を使用せ ず，適度の低酸素低糖刺激（OGD）により，ミクログリ アを M2 化できること，そしてラット tMCAO モデル において，そのミクログリアを亜急性期に投与するこ とで，機能予後を改善できることを明らかにした18）． 本稿では，脳梗塞後の機能回復を目指した OGD 刺激 後の M2-like ミクログリア細胞療法について概説する．
虚血後の血管新生の詳細な部位
脳梗塞後，梗塞の辺縁部に血管新生が生じること は，様々な報告で示されているが7, 10, 11），その局在の 詳細を検討するため，血管新生マーカー CD31，神経 胞体と樹状突起マーカー MAP2，神経軸索マーカー SMI31に 対 す る 1 次 抗 体 を 用 い て，2 つ の ラ ッ ト tMCAOモデルの脳切片に対する免疫染色を行った． 局在の詳細を検討するため，虚血病変部位を虚血中心 と虚血ペナンブラに分けて定義した．実験虚血での虚 血性ペナンブラの定義として，再灌流後に，MAP2 の 染色性が保たれている領域としているものが一般的で ある19, 20）．一方，染色性が消失している領域を虚血中 心としている．経時的に，梗塞域はダイナミックに変 化するため，本検討では虚血実験で広く用いられる MAP2の染色性の有無に従った．共焦点レーザー顕微 鏡の観察で，虚血ペナンブラの新生血管は，虚血 14 日まで増加は認めなかったが，興味深いことに，虚血 中心の辺縁部で，虚血 7 日目後から，軽度の血管新生 を認めた．すなわち虚血後の血管新生部位は，MAP2 陰性の虚血中心の辺縁部であることが明らかとなった （Fig. 1）18）．その一方で，虚血中心，ペナンブラ領域の いずれにおいても，神経軸索，神経樹状突起の伸展は 認めなかった．初代ミクログリアに対する OGD 刺激の効果
脳梗塞後，ミクログリアは炎症を惹起し，梗塞病変 拡大に作用すると考えられてきた16, 21）．一方，抗炎症 や修復に関与するミクログリアの存在も知られるよう になった．炎症に作用するミクログリアは M1-like ミ クログリア，抗炎症，血管新生，神経保護に作用する ミクログリアは M2-like ミクログリアと呼ばれてい る16, 17, 22）．脳梗塞に対しても，M2-like ミクログリアは Fig. 1．脳梗塞後の血管新生の経時変化（文 献 18 より修正引用） （A）神経血管マーカー CD31（緑）/神経マー カー MAP2（赤）/核染色 DAPI（青）の三重染 色．虚血前，虚血 3 日，14 日後の大脳皮 質の代表的な画像．スケールバー 15 μm. （B）単位体積（μm3）あたりの CD31 陽性体積 （μm3）の経時変化．虚血前（sham），虚血 1 日（D1），3 日（D3），7 日（D7），14 日 （D14）．＊P<0.05, ＊＊P<0.01, ＃＃P<0.01 versus sham-operated rats.ミクログリアによる脳梗塞細胞療法 梗塞病変縮小や機能予後改善に作用することが示され ている16, 17）．脳梗塞後 10 時間後から M2-like ミクログ リアが一過性に増加し，24 時間をピークとして，以 後，M2-like ミクログリアは減少する．一方，M1-like ミクログリアは，脳梗塞 24 時間から増加し，2 日後か らは M1-like ミクログリアが主体となることが示され ている17）．以上の知見から，短時間の虚血刺激が，初 代ミクログリアを M2 化すると仮説を立て，検討を 行った．OGD 刺激を 24 時間行うと，細胞死が生じる ため3, 23），18 時間の刺激を行った．M2-like ミクログリ アが分泌する TGF-β と M1-like ミクログリアが分泌す る腫瘍壊死因子（TNF）-α の培養液中の定量を ELISA にて行い，M2/M1 極性を TGF-β/TNF-α 比を指標とし て評価したところ24），刺激前と比べて，刺激後には 5 倍に増加し（P<0.001），M2 極性となっていることがわ かった．また，M2-like ミクログリアが分泌する血管 新生・神経軸索伸展に作用する VEGF，TGF-β は著増 していた（P<0.001） （Fig. 2）18）．
M2-like ミクログリア投与による
慢性期脳梗塞治療効果
OGD 刺激後の M2-like ミクログリア投与による治療 効果を検討するため，ラット tMCAO モデルを作成 し，虚血 7 日後に細胞を経頸動脈投与した．慢性期ま で評価可能な運動感覚機能評価として，コーナーテス トを行った25）．術前は左右同等に三角コーナーから脱 出するが，脳虚血後は麻痺と感覚障害を反映して，一 方に傾いた脱出を認めるテストである．虚血 28 日目 まで観察しても，治療介入しない群では，機能改善は 20％までにとどまったが，OGD 刺激後の M2-like ミク ログリアを虚血 7 日後に投与した群では，90％まで回 復を認めた（Fig. 3）18）． OGD 刺激後の M2-like ミクログリアが BBB を通過 Fig. 2．低酸素低糖刺激（OGD）後のミクログリアの極性（文献 18 より修正引用） （A）トランスフォーミング増殖因子（TGF）-β と腫瘍壊死因子（TNF）-α の比 norm：通常状態 OGD：刺激後 （B）抗炎症性サイトカイン TGF-β 値．＊＊P<0.01. Fig. 3．OGD 刺激後の M2-like ミクログリア投与による機能回復（文献 18 より修正引用） OGD-M2-likeミクログリア（micro）投与群は，OGD 刺激アストロサイト群（細胞対照群， astro）（＃＃P<0.01）と非細胞治療介入群（no cell, ＊＊P<0.01）と比べて，コーナーテストによし，脳梗塞病変の辺縁に集まるかを検討するため， GFPマウス26）由来の初代ミクログリアを OGD 刺激後 に投与したところ，脳梗塞病変周辺に GFP の蛍光を 認め，脳内に移行していることがわかった．一方， OGD刺激していない GFP マウス由来の初代ミクログ リア投与では，脳内への移行を認めなかった．さら に，OGD 刺激後の M2-like ミクログリア投与により， 脳内で M2 化の極性を維持されているかを確認するた め，M2-like ミクログリアが分泌するリモデリング因 子である VEGF，TGF-β，MMP-9 の脳内での発現を検 討した．虚血 28 日後には，投与なし群では，これら の発現を認めなかったが，OGD 刺激後の M2-like ミク ログリアを投与した群では，MAP2 陰性の虚血コアか らペナンブラ域における発現を認めた． また，血管新生や軸索伸展効果については，前述の CD31，SMI31 を用いた免疫染色による評価で，OGD 刺激後の M2-like ミクログリア投与群では，無治療， 対照細胞のアストロサイト投与群と比べて，虚血 28 日後の血管新生は，虚血ペナンブラでは認めないもの の，虚血コアの辺縁部で有意に増加し，虚血ペナンブ ラで神経軸索の有意な伸展を認めた（Fig. 4）18）．なお， 肉眼的，顕微鏡的出血の合併は認めず，全例生存 した．
OGD 刺激後の
M2-like ミクログリア細胞療法の可能性
我々は，OGD 刺激後の M2-like ミクログリア投与 は，慢性期の機能回復を促進する新しい治療法として 有望である可能性を示した．さらに MAP2 陰性の虚血 コアと考えられている部位で，血管新生が生じている ことを初めて示した．現在，これらの知見を臨床応用 することを目指して研究を進めている． 著者は日本脳循環代謝学会への COI 自己申告を完了 しており，本論文の発表に関して，著者が開示すべきFig. 4．OGD 刺激後の M2-like ミクログリア投与による血管新生と軸索伸展 OGD 刺激ミク
ログリア（microglia），OGD 刺激アストロサイト群（細胞対照群，astrocyte）と非細胞治療介入 群（no cell）の代表的な画像（文献 18 より修正引用） （A）虚血 28 日目（細胞投与 21 日後）の CD31 陽性新生血管．神経血管マーカー CD31（緑）/核 染色 DAPI（青）の二重染色．スケールバー 15 μm. （B）虚血 28 日目（細胞投与 21 日後）の SMI31 陽性軸索．神経軸索マーカー SMI31（緑）/核染 色 DAPI（青）の二重染色．スケールバー 7 μm.
ミクログリアによる脳梗塞細胞療法
COIは，以下のとおりである．
下畑享良：ShimoJani LLC biotech company のアカデ ミックアドバイザー
金澤雅人：武田科学振興財団 医学系研究奨励，循環 器病研究振興財団 バイエル循環器病研究助成
それ以外の著者に，開示すべき COI はなし．
文 献
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