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Title

1MHz超音波によるOHラジカル生成とHeLa細胞への影響

Author(s)

志田,裕美, 平岡,和佳子, 崔,博坤

Citation

電機情報通信学会技術研究所報告, 107(284): 39-43

URL

http://hdl.handle.net/10291/20888

Rights

CopyrightⒸ電子情報通信学会2007 本技術研究報告に

掲載された論文の著作権は（社）電子情報通信学会に

帰属します。

Issue Date

2007-10-19

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publisher

Type

Journal Article

DOI

社団法人 電子情報通信学会 THE INSTITUTE OF ELECTRONICS, INFORMATION AND COMMUNICATION ENGINEERS 信学技報 IEICE Technical Report US2007-73(2007-10)

1

MHz

超音波による

OH

ラジカル生成と

HeLa

細胞への影響

志 田 裕 美

平 岡 和 佳 子

雀 博 坤

t 明治大学理工学部〒214-8571神奈川県川崎市多摩区東三田 1-1-1 E-mail:

t

[email protected] あらまし 1 MHz超音波による細胞内での OHラジカル生成と付着性がん細胞 HeLaへの影響について調べた。 まず、連続波と Duty比 1:10のバースト波において、リン酸緩衝食塩水内の細胞が剥がれることについて調べた。 連続波では、空気飽和食塩水で 0.26MPa、脱気食塩水で 0.56MPa以上で細胞が剥がれることが分かった。これら の違いを OHラジカル生成量に注目してKI定量法で調べたところ、空気飽和と脱気食塩水での OHラジカル生成量 に大きな違いはみられなかった。これは、 OHラジカルが細胞を剥がす主な原因ではないことを示している。また、 細胞を剥がす原因として、固体境界面に存在する気泡によって発生するジェット流による衝撃の影響が考えられる。 次に、 HeLa細胞内での OHラジカル生成を調べるために、 OHラジカルと反応することで 488mnで励起し、 515mn の蛍光を出す aminophenylfluoresceinを細胞に導入し、蛍光顕微鏡観察を試みた。その結果、脱気食塩水内で 0.56MPa の連続波照射により蛍光を観察することが出来た。今後は細胞内で OHラジカルが生成されているかより詳しく検 討する必要がある。

キーワード 蛍光， aminophenyl fluorescein（蛍光試薬）， HeLa細胞， OHラジカル， 超音波

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SHIDA Wakako HIRAOKA a

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Pak-Kon CHOI

t

Department of Physics, School of Science and Technology, Meiji University

1-1-1 Higashimita, Tama-ku, Kawasaki-shi, Kanagawa, 214-8571 Japan E-mail:

t

[email protected]

Abstract We investigated the effects of ultrasound at the frequency of 1 M血 onthe adhesive property of HeLa cells which are typical cancer cells, and on the production of hydroxyl radicals in the HeLa cells. These cells are suitable for observation under microscope since they easily adhere to petri dish. The limiting amplitudes of ultrasonic pressure over which the cells were detached were determined in a continuous-wave mode and pulsed-wave mode with the duty ratio of 1: 10 in phosphate buffered saline solution. In the case of continuous-wave mode, the cells were detached above the pressure of0.26 MPa and 0.56 MPa in the air-saturated solution and in the degassed solution, respectively. To examine this difference in the limiting pressure amplitude, we evaluated the production of hydroxyl radicals by KI colorimetric procedure. The quantities of the hydroxyl radicals in the degassed solution and in the air-saturated solution. were approximately equal. This result indicates that hydroxyl radicals are not the major cause of the cell detachment. The number of cavitation bubbles is considerably large in air-saturated solution and bubbles existing near solid boundary may produce jet impact to the cells. To study the production of hydroxyl radicals in HeLa cells, we employed aminophenyl fluorescein which reacts with hydroxyl radicals and emits light of 515 nm after exciting with light of 488 nm. We observed fluorescence from the cells under microscope after the ultrasound at the pressure of 0.56 MPa was irradiated in degassed solution. If the fluorescence comes from inside of the cells, we can say that hydroxyl radicals are produced inside of the cells. However, we need to check that the fluorescence does not come from the surface of the cells where aminophenyl fluorescein may be adsorbed.

1.は じ め に 超 音 波 は 医 用 診 断 手 法 と し て 必 須 と な っ て い る が 、 最 近 で は 温 熱 治 療 や 薬 物 効 果 の 促 進 な ど 、 治 療 法 と し て の 超 音 波 利 用 が 期 待 さ れ て い る 。 し か し 、 超 音 波 は 低 侵 襲 で あ り な が ら 、 生 体 組 織 や 細 胞 な ど に ダ メ ー ジ を 与 え る こ と も 知られている。 [1-4]将 来 、 超 音 波 に よ る 治 療 法 を 確 立 す る た め に は よ り 多 く の 基 礎 実 験 が 必 要不可欠である。 本 研 究 で は 、 臨 床 で 使 わ れ る こ と が 多 い 高 周 波 の 超 音 波 に よ る 培 養 細 胞 へ の 影 響 に つ い て 、 基 礎 的 な 研 究 を 行 っ た 。 超 音 波 出 力 を 変 え な が ら 、 付 着 性 の ヒ ト 子 宮 頸 部 癌 細 胞 HeLaに 超 音 波 を 照 射 し た と き の 細 胞 へ の 影 響 、 な ら び に 活 性 酸 素 検 出 用 蛍 光 試 薬 を 細 胞 へ 導 入 し た と き の 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 の 結 果 に つ い て 報 告 す る 。 [5-7] 2.実 験 2.1．細胞の付着性観察 HeLa 細 胞 を 培 養 し た プ ラ ス チ ッ ク シ ャ ー レ (<J,60 mm)を リ ン 酸 緩 衝 食 塩 水 25ml で満たし、 斜 め 上 方 約 15m mから 1MHz超 音 波 を 入 射 し た。振動子への印加電圧は 20Vppから開始し、 100 Vppまで 1Vppずつ 10秒間隔で上げていく。 そ の 様 子 を 顕 微 鏡 (Axiovert35)で 観 察 し た 。 連 続 波 と バ ー ス ト 波 (Dutyratio 1: 10)、 空 気 飽 和 食 塩 水 と 脱 気 食 塩 水 な ど 、 実 験 条 件 を 変 え て 観 察 を行った。 音 圧 校 正 は ONDA1310 ハ イ ド ロ ホ ン を 用 い て行った。 2.2．細胞の生死への影響 超 音 波 に よ っ て シ ャ ー レ 底 面 か ら 剥 が れ た 細 胞 の 生 死 を 調 べ た 。 付 着 性 細 胞 を 培 養 す る 際 に 、 細 胞 を 剥 が す た め に 一 般 的 に 使 わ れ る 試 薬 (Trypsin EDTA)を用いて HeLa細 胞 を 剥 が す 場 合 と 、 空 気 飽 和 食 塩 水 中 で 連 続 波 0.26MPaを 10 秒 間 照 射 し て 剥 が し た 場 合 と で 生 死 の 違 い を 比 べ た 。 ま た 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー を 用 い て 細 胞 の 大 き さ と 細 胞 内 部 構 造 の 違 い か ら 細 胞の生死を判定した。更に、 AnnexinV-FITC（細 胞 膜 が 変 化 す る と 緑 色 蛍 光 を 発 す る 蛍 光 試 薬 ） とPI（細胞膜が破れることで細胞内部に入り込 み DNA と結合し赤色蛍光を発する蛍光試薬。 正 常 な 生 細 胞 膜 を 透 過 す る こ と が 出 来 な い た め、死細胞判定にしばしば使用される）で細胞を 二 重 染 色 し 、 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー で 蛍 光 強 度 を観察した。 FITCと PIの蛍光強度変化により、 細胞膜への影響を調べた。 2.3. K Iに よ る ラ ジ カ ル 定 量 超 音 波 照 射 に よ っ て 生 成 す る O Hラ ジ カ ル が 細 胞 を 剥 が す こ と に 関 与 し て い る か ど う か を調べた。 KI吸 光 度 法 を 用 い て O Hラ ジ カ ル 生 成量から関与を検討する。 2.1 と 同 様 の 食 塩 水 で 0.1 MのKI溶 液 を 作 成 し 、 空 気 飽 和 溶 液 と 脱 気 溶 液 を 準 備 す る 。 そ れ ぞ れ 、 細 胞 が 剥 が れ る 強 度 の 0.26MPaと 剥 が れ な い 強 度 の 0.56MPa で 照 射 し た 。 こ の と き 、 355.5nmに 現 れ る 特 徴 的な I3ーの光吸収ヒ゜ークを分光光度計で測定し た 。 照 射 時 間 経 過 に 対 す る I3ーの光吸収ピーク を測定することで、間接的に OHラ ジ カ ル の 生 成 量変化を測定できる。 2.4.蛍 光 試 薬 に よ る 細 胞 観 察 HeLa細 胞 の 蛍 光 銀 察 を 、 活 性 酸 素 検 出 用 蛍 光 試 薬Aminophenyl Fluorescein(APF)を 用 い て 行 った。 APFは 強 い 活 性 を も つ OHラ ジ カ ル を 他 の 活 性 酸 素 種 (H202,0ふNOなど）から区別して検 出 し 、 蛍 光 を 出 す 蛍 光 試 薬 で あ る 。 ま ず 、 空 気 飽 和 リ ン 酸 緩 衝 食 塩 水 で 15 倍 希 釈 し た APFを 連 続 波 で 10秒 間 照 射 し た 。 そ し て 、 蛍 光 分 光 光 度 計 で 超 音 波 強 度 に 対 す る 蛍 光 ス ペ ク ト ル を 得 る こ と で 、 超 音 波 由 来 の ラ ジ カ ル を 検 出 で きるかを調べた。 次に、 35m m <Pディッシュに培養した細胞を、 同 様 の 食 塩 水 で 100倍 希 釈 し た APFに 60分間 浸 す 。 細 胞 を 丁 寧 に 同 様 の 食 塩 水 で 洗 っ た あ と 、 4 mlの 脱 気 食 塩 水 で 満 た す 。 顕 微 鏡 で 超 音 波 照 射 前 後 の 蛍 光 観 察 を 行 い 、 細 胞 内 で OHラジカ ルができているかを調べた。 3.結 果 3.1.細 胞 の 付 着 性 観 察 結 果 顕 微 鏡 に よ る 細 胞 観 察 の 結 果 、 計 測 し た HeLa 細 胞 の 大 き さ は 19から 72μ mで 、 平 均 45.5士 26.5μ mで あ っ た 。 細 胞 数 は 1.4-l.8Xl

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/mm2で あ っ た 。 ま た 、 超 音 波 照 射 に よ り 細 胞 剥 が れ が 観 察 さ れ た 。 バ ー ス ト 波 照 射 に よ る 細 胞 剥 が れ の 結 果 を Fig.1 に 示 す 。 横 軸 は Duty比を 1: 10 固 定 に し た と き の ON時 間 で あ る 。 空 気 飽 和 食 塩 水 中 へ の 超 音 波 照 射 で は 、 連 続 波 で 0.26 MPa以 上 で 細 胞 が 剥 が れ 、 バ ー ス ト 波 で ON時間 75μ s(50波）以上から約 0.35 MPa以 上 で 剥 が れ

た。このことから、バースト波は ON時間 75μ s 以上で連続波の約 1.4倍の音圧であれば、細胞 を 剥 が す こ と に 関 し て 連 続 波 と 同 等 の 効 果 を 示すことが分かる。また、脱気食塩水中への超 音 波 照 射 で は 0.56 MPaでも細胞剥がれは起こ らなかった。 , F t"t> が

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1 , 10 20 30 40 Time [min] Fig.3 Ratio of the number of living and dead cells treated by Ultrasound. Continuous waves at 0.26 MPa were irradiated. これは、超音波照射によって剥がれた細胞がダ メージを受けていることを示唆している。した がって、超音波によって剥がれることは細胞が 死ぬこととほぼ同等であるといえる。 また、 AnnexinV-FITCとPIの蛍光強度と細胞 数について Fig.4と 5にそれぞれ示す。横軸は 蛍光強度、縦軸は細胞数を表す。グラフより、 超音波処理した場合の方が、死細胞における蛍 光 強 度 が そ れ ぞ れ 著 し く 増 加 し て い る こ と が 確認できた。FITCの蛍光強度増加は細胞死の初 期段階である細胞膜の部分的な変化を示し、 PI の 蛍 光 強 度 増 加 は 細 胞 膜 が 破 れ て い る こ と を 示す。また、細胞の形状変化から求めた生死判 定は、 AnnexinV-FITCとPIの蛍光増強と一致し ていることから、細胞膜が破断して細胞の形状 が変化し細胞が死に至ることが分かった。 (a) Trypsin EDTA Dead cells 63 - 9 9ローLivingcells 巫0-Deadcells 50 (b) Ultrasound Living cells

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_{20 初 60 80} Time [min] 100 120 Fig.2 Ratio of the number of living and dead cells treated with Trypsin EDTA. 10° 101 102 103

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101 Fig.4 FITC fluorescence intensities (Excitation wavelength is 488 nm) for HeLa cells treated by Trypsin EDTA(a) and 1 MHz-ultrasound(b). at 60 102 530 103 nm

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● 1cl'101 1cf- 1o' Fig.5 PI fluorescence intensities at 620 nm (Excitation wavelength is 488 nm) for HeLa cells treated by Trypsin EDTA(a) and 1 MHz-ultrasound(b). 3.3.ラジカル定量結果 KI定 量 法 に よ る ラ ジ カ ル 量 測 定 結 果 を Fig.6 に示す。空気飽和 KI溶 液 に 連 続 波 0.26MPaを 照 射 し た 吸 光 度 と 、 脱 気 KI溶 液 に 連 続 波 0.56 MPaを照射した吸光度を比べている。ここで、 0.26 MPaは 空 気 飽 和 食 塩 水 に 超 音 波 照 射 し た とき細胞が剥がれる条件であり、 0.56MPaは脱 気 食 塩 水 に 超 音 波 照 射 し た と き 細 胞 が 剥 が れ ない条件である。どちらの場合も 355.5nmの吸 光 度 に 大 き な 差 は 見 ら れ な い た め 、 ラ ジ カ ル 量 に 大 き な 差 は な い こ と が 分 か っ た 。 こ の こ と か ら、ラジカルが細胞を剥がす主な原因であると は 考 え に く い 。 ほ か の 超 音 波 作 用 と し て 、 機 械 的 作 用 を 生 む キ ャ ビ テ ー シ ョ ン 崩 壊 時 の 衝 撃 波 と マ イ ク ロ ジ ェ ッ ト 流 が 考 え ら れ る 。 特 に HeLa細胞はシャーレ底面に付着しているため、 固 体 境 界 面 に 存 在 し て い る 。 よ っ て 細 胞 剥 が れ は マ イ ク ロ ジ ェ ッ ト 流 に よ る 影 響 が 大 き い と 考える。 3.4．蛍光試薬による細胞観察結果 超 音 波 照 射 し た 活 性 酸 素 検 出 用 蛍 光 試 薬 APFの 規 格 化 し た 蛍 光 ス ペ ク ト ル を Fig.7に示 す 。 超 音 波 照 射 を し て い な い controlに対して、 10秒間照射すると 0.18MPaで約 2倍、0.45MPa 以上で約 10倍 の 蛍 光 強 度 が 確 認 で き た 。 こ れ は 超 音 波 照 射 に よ っ て 生 成 し た ラ ジ カ ル が APFと反応し、蛍光を発したと考えられる。ま た今回の反応溶液において、 0.45MPa以 上 の 超 音波強度で 10秒 間 照 射 す る と 反 応 溶 液 は ほ ぼ 最 大 蛍 光 強 度 を 発 す る 。 ま た 0.18MPaで30秒 間 照 射 す る こ と で も 、 反 応 溶 液 の ほ ぼ 最 大 蛍 光 強度が銀察された。 0 degassed solution irradiated with 0.56 MPa

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増 加 し て い る の は 、 超 音 波 照 射 に よ り 細 胞 内 で ラジカルが生成したためと考えられる。ただし、 蛍 光 が 細 胞 内 か ら 発 さ れ て い る か 確 認 す る 必 要 が あ り 、 蛍 光 強 度 に つ い て も 更 に 詳 し く 検 討 していく必要がある。 4.まとめ 1 MHz超 音 波 に お い て 、 連 続 波 で は 空 気 飽 和 食 塩 水 で 0.26 MPa、 脱 気 食 塩 水 で 0.56 MPa 以上で細胞が剥がれることが分かった。 KI定 量 法により OHラ ジ カ ル が 細 胞 を 剥 が す 主 な 原 因 で は な い こ と が 考 え ら れ 、 固 体 境 界 面 で 発 生 す る ジ ェ ッ ト 流 が 主 な 原 因 と し て 考 え ら れ る 。 顕 微鏡観察では、 OH ラ ジ カ ル が 細 胞 内 で 発 生 し たことによる APF の 蛍 光 強 度 増 加 は 観 察 で き た が 、 蛍 光 強 度 の 更 な る 検 討 と 、 試 薬 が 細 胞 内 に あ る か 確 認 す る こ と が 必 要 で あ る 。 そ し て 、 細 胞 内 で OHラ ジ カ ル が 生 成 さ れ て い る こ と を さらに確実にしていく必要がある。 (i) (ii) (iii) Fig.8 Phase-contrast image (i) and fluorescence images of HeLa cells with aminophenyl fluorescein before (ii)and after (iii) ultrasoundirradiation.

文 献

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