1
実践的 ボ ー 析 ー
始 ボ ー 析
ESI 会編
β 4 版 2015.7.8
2
刊行
代謝物総体 学 情報 近接 精密表現
型解析技術 評価 困 複雑 定 的表現型 解析手段 期
い 解析 象 微生物 植物 動物 食品 多岐 わ 礎 学
献 疾患 索 病因解明 創薬支援 醗酵生産性
食品機能解析 幅広い応用 想定 い 解析戦略 概念 以外 単純
代謝物総体 解析 象 定 的表現型 相関関 解析
尽 現時 種々 究者 遀用 新 究
い う 究 果 い い 理 え
究 希望 究者 技術 適 提供出来 い い
技術 ン 析 学 ン
高 学 領域技術 特 析 学 ン 間 境界
領域 高 易 高い技術要素
実施 知識 経験 熟練技術者 品質管理 必要
高性能 析装置 必要性 強調 実 ン 整備
必要条件 部 過 現状 問 特 熟練技術者 確保
ン い 熟練 遀転 初 性能 揮
当 問 解決困 う ESI 会 手各
本出 究 立 慮 い 究者 問 解
決 提供 確信 ESI 会 各 多大 努力 敬
意 払う 本出 契機 究 祈念
2013.5.21 大阪大学大学院 学 究
教授 福崎英 郎
3
執筆者
馬場健 大阪大学大学院 学 究 bamba@bio.eng.osaka-u.ac.jp 生 大阪大学大学院 学 究 fmatsuda@bio.eng.osaka-u.ac.jp 川 山形大学農学部 oikawa@tds1.tr.yamagata-u.ac.jp 池 和貴 慶應義塾大学 端生 学 究所 kz-ikeda@ttck.keio.ac.jp
澤 理 学 究所環境資源 学 究 ン ysawada@psc.riken.jp 佐々木亮 理 学 究所環境資源 学 究 ン ryosuke.sasaki@riken.jp 津川裕 理 学 究所環境資源 学 究 ン hiroshi.tsugawa@riken.jp 飯島陽子 神奈川 大学応用 学部 iijima@bio.kanagawa-it.ac.jp 岡崎圭毅 農 機 洘遈農業 究 ン okazakik@affrc.go.jp
宮城敦子 埼玉大学大学院理 学 究 miyagi@mail.saitama-u.ac.jp 西洘信 神戸大学大学院 学 究 nishiums@med.kobe-u.ac.jp
和泉自泰 大阪大学大学院 学 究 yoshihiro_izumi@bio.eng.osaka-u.ac.jp 山本博之 fw_h_yama@ymail.plala.or.jp
宮川浩美 ン 株式会社 h.miyagawa@gls.co.jp
4
目
第1部 析 礎
1-1 析 礎 生 川 馬場健
1-2 学 究 析 和泉自泰 西洘信
1-3 食品 析 析 飯島陽子
第2部 代謝物 出法
2-1 ン ン ン 出法い い 生
2-2 GC-MS用茶葉 酵 血清 ン 調製法 大阪大学大学院 学 究 福崎 究室
2-3 CE-MS 析用 植物 農作物 出 川 佐々木亮
2-4 CE- MS用雑草 代謝物 出法 宮城敦子
2-5 農作物 ン ン 方法 計画法 岡崎圭毅
2-6 GC-MS LC-MS用出芽酵 大 菌 ン ン 出法 生
2-7 LC-MS用植物 代謝産物 出法 生
2-8 血漿 肝臓 酵 LC-MS 用 ン 調製法 馬場健
2-9 LC- MS 析用植物 ン ン 時 出法 飯島陽子
第3部 得 処理
3-1 GC-MS 概要 津川裕
3-2 GC-Q-MS 用い 親水性 子代謝物 ン 析 大阪大学 学 究
福崎 究室
3-3 GC-Q-MS 用い ワ 析 生
3-4 CE-MS 概要 川
3-5 CE-MS 植物 農作物 析 解析 川
3-6 CE-Q-MS 用い 雑草 代謝物 解析 宮城敦子
3-7 概要 池 和貴
3-8 LC- 型MS 用い 脂質 析法 馬場健
3-9 LC-MS 概要 生
3-10 ン LC-QqQ-MS 親水性代謝物 斉 析 大阪大学大学院
学 究 福崎 究室 神戸大学自然 学系 端融 究環近藤 究室
3-11 LC-Q-Tof 用い ン 析 生
3-12 LC-APCI-MS 用い 植物 ン ン 時 析方法 飯
島陽子
3-13 LC-QqQ-MS 用い ワ 析 澤
5
第4部 解析
4-1 AIoutput 用い GC-MS 解析 津川裕
4-2 索 和泉自泰 西洘信
4-3 代謝物 定法 生
4-4 VANTED 用い 覚 山本博之
4-5 定 関 議論 GC-MS 宮川浩美
第5部 付録
5-1 標準物質 型番
注意
謝辞
変更
6
本 集 う 方 想定 者
代謝物 析 行 い 析 興味 い 方
わ い
究室 活躍 い い GC-MS LC-MS 活用 い
ン 聞 CE-MS 入 い 出 々
い 相談 わ 装置 動 い
析 外注 何 何 わ い
析 山当 い
集 いう性 般的 機器 析 持 究者 想定 い
析 10 前 華々
析 輩 ン 10
間 大い 逭歩 々 究 大活躍 い 比
析 わ 偉い 生 講演 析 100
代謝物 検出 い ういう
GC LC CE TOF い い 法 検出方式 乱
立 結 装置 使え いい
う 析 究者 増え い
未知代謝物 造 う 決 いい
多 課 広 い 言い い状況
得 得 処理 代謝物情報 付 部 開
予測 逭 う わ 専用
いう側面 い 近 大阪大学大学院 学 究 福崎
究室 粘 強い技術開 果
ン 調製 島津製作所製 GC-MS 用い 得 公開 組
わ 処理 代謝物 定 多変 解析 知識 見
気通 実用的 固 入
究室 学 果 挙 実力 実証 い
国 析 場 CE-MS い 様々 蓄積
い LC-MS い 析 使い方 明
析 始
☆いまがチャンス☆
7
析 始 う 皆様 役 立 析法 紹
い 本 集 第1章 析 い 思わ
い 要素 い わ 解 学 第2章
生体試料 析用 ン 調製 集
い 第3章 出 ン 析装置 得 処理 解析用
出力 扱い 大阪大学福崎 開 GC-MS
気通 解 究
室 GC-MS 明 ン 変身 い
い CE-MS い え 2 並列 掲載い
見比 CE-MS 析 勘所 い い
究 逭的 技術開 逭 い
技術 現状 い 紹 食品中 健 植物 来 代謝産物
場 植物 代謝産物 多様性 捉え 捉え損 い LC-MS
い 方法 い 析法 築 考え方 実 ン 適用法 解
第4章 知識 見 便利 紹
本 執筆者 ン 国 究者
回集う ン 活躍 手 究者 中心 い 本 集
析 興味 持 実践 究者 増え 執筆者 期
い
2013 5 20
ESI 会
8
第 1 部 析 礎
1-1 析 礎
生 川 馬場 健
1.
析 目標 組織 ン 中 代謝産物 定
実現
疾患 代謝物 特定 病気 早期診 能
ン細胞 特徴的 代謝 応 見 創薬
食 含 体 良い
遺伝子組換え作物 代謝 変 い 実証 代謝物 組 生薬 産地 特定 偽装 防
代謝関連遺伝子 損株 生株 比較 未知遺伝子 機能 定 代謝 状態 調 用物質生産微生物 代謝 速部 特定
様々 応用 整理 析
以 3
1) ン A ン B 含 変 代謝物 索
患者vs健常者 遺伝子組換え作物vs 生株 変異体vs 生株 薬剤処理 vs ン
差 代謝物 索 象 広 析 強
疾患 遺伝子機能 薬剤 効果 議論
2) 明変数 ン 特性値 い 品質 産地
予測 作
高 形質 寄 代謝物 索 食品 品質 客観的 評価
3) 代謝 解析
代謝 計算機中 再現 い い 役立 う う
代謝 築 代謝機能 解析 用
析 特徴 生物 郿 ン ン
情報 関 う ン う 解析 実施出来
9 1
う 析 実現 ワ 技術 い い 役立 う
全代謝物 網羅的定 目指 技術開 10 前 活
1． ？
ー 解析や ー 解析 ，得 ー ー 遺
伝子や パ 質 前 ， 生物 情報 用い ．近年
PC 性能向 や ー ー 充実 ， ほ 労力 行う
． ，得 ー 相 性 高い ー ．例え ，
非 生物 ー 解析 得 パ 質 郿配
列 ， 情報 い 生物 ー ー 用い
相 性 検 索 行 い ． ， ー
At1g17290 78%相 いう ー 出 ．結構 相 性 ，
見 パ 質 ー ！ 一般的
わ ，実際 基質特異性や比活性 性質 異 ，場合 異 酵素
活性 持 い 場合 ， 確 実際 パ 質 精製 活性 確
認 必要 ．結構 労力 ． 場合，発見 パ 質
ー 似 様，的， ． ー
ー 解析 得 ー ，参照 生物 ー ー 塩基配列
郿配列 少 異 生物種間 完全 一致 無い う ，単純
比較 危険 伴い ．
一方， ボ ー 解析 得 ー 単純 ． う 生物
う ． 記 例 言え ， 含
含 全 ．大腸菌や 含
． いう 単純 比較 可能 ． 言う ボ
ー 解析 定義 ，混合物間 比較 可能 ．鶴見川 大和
川 水質や， ー ー 味 比較 ボ ー 解析技術 使用可能
！他 ー 解析 比べ 難 見え ボ ー 解析 ， 点 や い
言え う．
2. 第 期 果
全代謝物 網羅的定 い 夢 領域 理
問 1 代謝産物 い い い 析 い
解析 象 代謝産物 糖 機郿 補酵素 ン 郿 脂質 代謝物 多
岐 わ 物性 多様 検出 能 装置
10
析装置 能 限 広い範 う 析 行わ 析
装置 得意 得意 代謝物 析以前 程 種類
代謝物群 注目 いう 決 必要 え ン 中 含
い 測定法 得意 検出 い代謝物 解決法 い 装置
測定 金
問 2 代謝産物 濃 広 装置 ン 足 い
代謝産物 濃 範 幅広 mM pM 10 以
方 析装置 検出器 ン 多 場 2 5 い
従 析 測定 能 範 高 含 代謝物 測定
代謝 的 析法的 検出 ン
中 含 検出 い いう 起
問 3 測定 象 代謝産物 多 絶 定 い
定 いう ン 中 代謝物濃 (nmol/g fresh weight ) 求 絶 定 想像
析 測定 象代謝産物 多い 濃 値 求
行わ ン A B 検出 強 値 面積値
高 比較 倍 い いう半定 質 析装置 絶 定
行う 測定 象 安定 体 物 部標準物質 必要 網
羅的 析 い 利用 現実的 外部検 線 用い 定 能
ESI法 ン ン 問 山積 参考程
い う
問 4 生物中 含 代謝物 完璧 い
情報 生物 生物 来 mRNA 郿配列 完璧
作 方 代謝物 い 無理 生物 々 未 知 い代謝産物
生 い う 析 行う 検出
未知代謝物 定 得 必要 従来 析 いう作業
変更 必要
問 5 考え方 通 析 遊う 通常 定 析
1) 測定 象 物 決
2) 適 析 標準物質 析 検 線 作
3) 実 ン 析
4) 面積 得
5) 面積 濃 換算
6) 得 解釈
11
いう作業 行い う 方針 析 析 targeted analysis
方 網羅的 析 目指 析 情 前 析 象 決
出来
1) 実 ン 析
2) 検出 強 値
3) ン 代謝物 来 う う 整列 行列
作
4) 検出 個々 い 標準 物 照 行い 代謝物 定
い 造 定
5) 多変 解析 方法 解析 生物学的 意味 解釈
う 前 析 象 決 検出 代謝物情報 付
う 方針 析 ン 析 non-targeted analysis
第 期 析 技術開 ン 法 確立 努力 払わ
ン 解析 手 う
1) 実 ン 析
2) 検出 強 値
何 実行
3) ン 代謝物 来 う う 整列 行列
作
作 必要 [1-5]
4) 検出 個々 い 標準 物 照 行い 代謝物 定
い 造 定
い 自 使え 間 互換性 数 物規模 標準 物
いう い状態 作業 始
第 期 究 最大 果
1) GC-EI-MS い ン 析 容易 実行 能
[6,7].
2) ン 析 性 出 実行 能 示
時 誰 使え 技術 多 課 わ
課 以
12
問 6 整列 思 い
ン 代謝物 来 う う 整列 行列
作 複数開 い [1-5]
用い 保持時間 ン 間 変動 S/N比 大
い い 理想的 代謝物 来 い 自動的 認識
面積値 調 ン 間 整列 配列 出力
実 析 保持時間 動 S/N い
士 い
う 妥当 処理 開 未 い いえ
遈 習熟 調整 何 使い
気楽楽 確実 実行 処理 未
例外 GC-EI-MS GC 保持時間 再現性 高い 保持指標 (Retention index) 使え
いい ン 析 比較的 いい
ン 解析 簡単 実行 環境 整 い
問 7 析法 共通 逭展 い
代謝物 来 定 実測 代謝物 保持時間
条件 過去 得 標準物質
作業 い い 逭 実 ン 条件 析 標
準物質 集 い う
条件 析 標準 前提
析 用い 装置 う GC-EI-MS 標準 行わ
確 言う 析 互換性 高いGC
析条件 EI ン 条件 用い 実 標準物質 作
MassBank 努力 無償 公開 い わ わ
標準 方法 恩恵 [8] 方 装置
特 LC-MS 用い 析 間 標準 全 行わ
析屋 自 析法 作 大好 深 響 い
思わ 代謝物 定 礎作 各自自力
い 高い いえ
問 8 精密質 数 能 い, 造 決定 い
い い 精密質 数 MS/MS 数 物 ン PubChem
検索掛 物 定 簡単 いう都 伝 い
え 遺伝子配列 解析 配列 Blast検索 ○○遺伝子 非常
い P-value 相 性 機能 能性 高い いう う
簡単 主張 感 出来 い 思
い
13
実 精密質 数析
精密質 数 得 組 式 数 減 滅多 い
組 式 わ 数十 造異性体 い 情報 い
MS MS/MS
既知物質 類似 い 代謝物 類縁体 う
いう 定 物 造 細 定 代謝物標品
い 購入 標品 実測 法
初 定
遺伝子配列 検索 配列 類似性 確率 P-value 把握
確率 方法 実用 MS
似 い 精密質 数 矛盾 い い確 い いう客観的評
価 い
精密質 数 未知物質 定
う いい 決定打 定 追 作業 必須 い
う 現状
唯 例外 ン脂質 象
例え ン脂質 ン ン 極性 脂肪
郿 組 わ い 脂肪郿 ン 異 子
い 標準品 ン 等 定
能 特 徴 仮 想 築 能
LipidSearch 自動 定 提供 い
問 9 定性 定 時 無理
析 実施 飛行時間型 (TOF) 質 析装置 用い 飛行時間型 特徴
1) ン 感 いい ン 析 利
2) 精密質 数 利用 未知代謝物 造 定 利
3) ン い 代謝物 定 利
4. 大 い 数十MB～数 MB 生 作業 利
定性 造決定 定 犠牲 い いえ TOF
型装置 使 ン 析 実施
1) TOF ン 行い ン 析 3時間
い
2) 処理 大変 何 性 最終的 1ヶ 自力
ン 行
14
3) 標準物質 自力 得 利用 得 各
既知代謝物 情報 付
4) 大 増減 造未知 い 造 定 試 無理
5) 結 情報 付 既知代謝物質 議論 性 論文 [9]
いう 性 態 起 議論 いい
い 賢明 者 気 思い 態 特徴 TOF 使 物
定性 役 立 既知物質 定 質 ン
析 定性 定 時 う 心的 真価 揮
現時 相当 性 必要
ン 析 出来 い
代謝物 組 生薬 産地 特定 偽装 防 遺伝子組換え作物 代謝 変 い 実証
定 必要 い指紋 ン ン 析
疾患 代謝物 特定 病気 早期診 能
索 未知代謝物 中 見 要
未知代謝物質 造決定 然物 学的 手法 え 大変
能
方 考え 未知代謝物 半定 含 ン 析 う
必要 究 いう 多 多 場 述 析
足 う ン 析 う い
会社 外注 ン 優 い
え 本 集 大阪大学 学 究 福崎 究室 い 築 逭
い GC-EI-MS 用い ン 析法 実践的 第3章 紹
装置 用い ン 析法 い 概要 解
必要 ン 調製法 い 第2章 集 い
3. 第 期
析 実施 目的 中 ン 析 必 必要 い
多
細胞 特徴的 代謝 応 見 創薬
代謝 状態 調 用物質生産微生物 代謝 速部 特定
代謝 要 代謝物質 100 200種程 網羅 い いい
15
う 測定 象 物 数 多い 前 決 い 方 象 物
い 微 定 出来 高感 い
数 50～100以 増 析法 開 最近活
い う 考え方 析 い ワ 析
第 期 技術 わ わ 捉え い 通 析
熟 逭 汎用 四 極型 GC-MS LC-MS/MS 高感
利用 網羅的 解析 標榜 初期 目標 大幅
見え え 用い ン 解析 測定
象 遺伝子 前 決 い 解析 いえ
数 増 い 網羅性 い う いう考え方
析 ン 析 技術的 課
整列 装置付属 能
析法 共通 出来 い 50-100 個 い 標準 物 自力
能
高 解能質 析 関 い
定性 定 時 無理 定性 捨
析 析 延長線 捉え 出来
遈 実施 容易 強い いう 50-100 個 い 標準 物
い 代謝産物 保持時間 検出 用
い 質 電荷比 (m/z) 各 四 極型 装置 最適 MRM
系列 利用 能 標準 物 持 い 程 経験 積
析屋 試 析 実施
本 集 GC-Q-MS, LC-MS/MS 用い 析
積極的 録
4. 解析
析 結果 言う 代謝 投
表 いう 思い浮 書 結 大変
生物学的 要 知見 得 心 え 持 多変 解析
ン 実施 必要 比較的楽 実施 手
法 い 本 集
未知代謝物 定 い 本気 感
いう 掲載
16
析 技術 全体的 未 完 いえ い状態 GC-EI-MS う
開 逭 買い得 領域 出 本 集 代わ
析 気軽 利用い 析 い う確
い 知恵 拝借 希望い
参考文献
[1] Codrea, M. C., Jimenez, C. R., Heringa, J. and Marchiori, E.: Tools for computational processing of LC-MS datasets: a user's perspective, Comput Methods Programs Biomed, 86, 281-290 (2007). [2] Katajamaa, M. and Oresic, M.: Data processing for mass spectrometry-based metabolomics, J
Chromatogr A, 1158, 318-328 (2007).
[3] Hiller, K., Hangebrauk, J., Jager, C., Spura, J., Schreiber, K. and Schomburg, D.:
MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis, Anal Chem, 81, 3429-3439 (2009).
[4] Lommen, A.: MetAlign: interface-driven, versatile metabolomics tool for hyphenated full-scan mass spectrometry data preprocessing, Anal Chem, 81, 3079-3086 (2009).
[5] Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A. and Oresic, M.: MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data, BMC Bioinformatics, 11, 395 (2009).
[6] Tsugawa, H., Bamba, T., Shinohara, M., Nishiumi, S., Yoshida, M. and Fukusaki, E.: Practical non-targeted gas chromatography/mass spectrometry-based metabolomics platform for metabolic phenotype analysis, J Biosci Bioeng, 112, 292-298 (2011).
[7] Tsugawa, H., Tsujimoto, Y., Arita, M., Bamba, T. and Fukusaki, E.: GC/MS based metabolomics: development of a data mining system for metabolite identification by using soft independent modeling of class analogy (SIMCA), BMC Bioinformatics, 12, 131 (2011).
[8] Horai, H., Arita, M., Kanaya, S., Nihei, Y., Ikeda, T., Suwa, K., Ojima, Y., Tanaka, K., Tanaka, S., Aoshima, K. et al: MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences, J Mass Spectrom, 45, 703-714 (2010).
[9] Matsuda, F., Hirai, M. Y., Sasaki, E., Akiyama, K., Yonekura-Sakakibara, K., Provart, N. J., Sakurai, T., Shimada, Y. and Saito, K.: AtMetExpress development: a phytochemical atlas of Arabidopsis development, Plant Physiol, 152, 566-578 (2010).
17
1-2 学 究 析
和泉 自泰 西洘 信
1.
近 学 究 い 解析技術 要性 認識
索 代謝 究 急速 応用 う 学 究
利 い手法 包 的 観測 解析 象物 数 限
定的 代謝物数 3,000 高解像 疾患 表現型 示
種差 い 動物実験 結果 臨床 究 外挿 い 挙
10 質 析計 技術革新 GC-MS LC-MS CE-MS MALDI-MS 急速
展 遂 複 的 用い 学 代謝物 網羅的 定 的
析 能 [1]
厚生労働省 人 動態統計 22 死 原因 1 悪性新生物
3割 (353,499人) 2 心臓病 (189,324人) 3 脳 中 (123,478人)
4 肺炎 (118,928 人) 5 老衰 (45,372人) 死 原因1 昭和56
以降 死因 1 数 昇 い 国民
大 脅威 克服 社会的 極 高い 国
要 策 い 生 洙潤 抑え 子機序 解明
子 標的 薬剤 開 予防 療 生 学 究 最
要課 挙 本章 学 究 中心
解析 動 紹
2. 細胞 代謝 究
体細胞変異 積 生 病気 考え 変異 原因
関 遺伝子 関連遺伝子 遺伝子 抑 遺伝子 い 細胞 複
数 関連遺伝子 変異 起 細胞 伝遉系異常 引 起 結果
的 細胞 優勢的 増殖 方 症 逭展 生活習慣 環境要因 深
関わ い 示唆 い 例え 肺 最大 険因子 喫煙 考え
胃 場 菌 菌 感染 大 近 食
生活習慣 欧米 険因子 要 い う 症 関
連遺伝子 変異 環境要因 多 的 原因 整 起 考え い
細 い 明 多い
究 第 人者 D.Hanahan R.A.Weinberg 2000 細胞 生物学
的特性 1) 増殖因子 自給自足 2) 増殖 逸脱 3) 組織洙潤 転移能
4) 再活性 無限 複製能 5) 持 的 血管新生 6) 回
避 提唱 10 間 究 果 2011 6 特性
え 7) 代謝異常 ン 8) 免疫破壊 回避 9) 安
定性 変異 10) 炎症 逭性 4 目 付 え [2] 新 追 目 中
18
7) 10) 関 代謝異常 関連 強 示唆 目 細
胞 組 細 理解 代謝 究 う 見直 必要 う
新 い解析技術 用い 代謝 究 い 思い
い大 見 い 以 解析 大
胃 代謝 究 関 貴 報告例 紹
山 CE-MS 用い 大 胃 患者 来
組織 常組織 行い 細胞 異常増殖 必要
ATP 産生 注目 [3] 組織中 常組織 比較
大 10 1 胃 3 1 組織 解糖系 中
間代謝物 常組織 比較 等 以 増 い 解析結果
組織 解糖系 逭 郿 的 ン郿 用い 少 い いうワ
効果 (Warburg effect) い 大 TCA回路 半 代謝物
郿 郿 ン 郿 意 増 い 嫌気性微生物 回虫 嫌気的条
件 郿 代謝 ATP 産生 知 い 大 郿
素 胃 比 5 1 いう報告 実 大 組織
郿 ATP 産生 い い 結論 い
3. 質 顕微鏡法 代謝物 組織 解析
MALDI-MS 用い 解析 顕微鏡 代謝物 解析 使用
質 顕微鏡 瀬藤 浦 手法 急速 学応用 [4,5]
手法 組織 特定 子 い 病因 析 組織 薬物動態 析
用 高解像 画像 得 能 多 用 見 報告
い 検体 前処理方法 網羅性 高感 開 課
MALDI-MS 用い ン 細胞機能 評価
用 考え い
4. 索 現状
現 解析 生 学 究 応用例 大半 索
病態 病気 関連 細胞 組織 い 酵素 ン 質 代謝
変動 起 疾患特 代謝物 ン 変 血液 中 映
予想 代謝物 流 集大 考
え 解析 代謝経路 微 変動 表現型 現 前 生体
状態 検出 い 理 比較的非侵襲的 血液
唾液 活用 疾患 診 応用 う 動 活
い
杉本 CE-MS 腔 乳 膵臓 患者 唾液 行
[6] 比較的早期 患者 健常者 唾液 ン 来 代謝物 比較解析 結果 3種類
19
患者 健常者 大 変動 - ン ン 57種類 代謝物
決定 う 数個 代謝物 使 ROC曲線 (receiver operating characteristic curve) 解析 腔 87% 乳 97% 膵臓 99% 確率 見
示 唾液 早期 見 能性 示唆 [6]
A.Sreekmar LC-MS GC-MS 用い 悪性/良性 前立
患者 血液 組織 計262 ン 解析 [7] 結果 転移/非転移性 組
織 比較 ン 子 逭行 相関 確認 洙潤 前
立 養細胞 い 良性 来 比較 ン 増 見
ン ン 転換 酵素 洙潤
見 結果 ン 増 前立 逭行 関 い
結論 [7]
々 究 膵 肺 大 様々 象 血清
解析 逭 [8] 解析 使用 測定 GC-MS 選択
理 GC-MS 手技 比較的容易 え GC-MS 代謝物
豊富 最 析 堅牢性
GC-MS 保持時間 再現性 比 遥 優 い
多検体試料 測定結果 解析 大変 要 保持時間 再現性
検出 ン 精 定 信 性 高 処理時間 改善
々 GC-MS 用い 100例以 大 患者血清 大規模
解析 実施 大 索 大 逭行 考慮
入 系統誤差 限 除 う 実験 ン 行 細 4-3
索 参照 い 統計学的評価 ワ ‐多
回 析 選定 4 種類 代謝物 信 性 高い大
診 予測式 築 予測式 早期大 80 以 感
見 明 [9]
5. 索
現 疾患 象 世界各国 解析
索 実施 い 将来的 実用 考え うえ 検討
い 課
試験 使用 検体 質 信 性 高い 代謝物 見
当然 疾患特異性 逭行 症 細 検体 集 必須
師 究者 多 時間 労力 要 質 高い検
体 用い 解析 実施例 思い 少 い 現状 索 究
速 う 思う い 各種 析系 検出 代謝物 偽陽性 偽陰性
問 変動 間変動 評価 十 い 文献 数少 い 現状
20
高質 精 確 質 析計 結果 精密質 情報
物 定 能 いう迷信 信 込 究者 絶 い
方 問 大防 明確 準 う いう動
Human Serum Metabolome (HUSERMET) Consortium LC-MS GC-MS
解析 患者血清 血漿検体 用い 大規模試験 注意 奨 方法 提
唱 い [10] え 検体 適 方法 検体 保 使用方法 い
GC-MS 代謝物 析 い う 厳密 確認段階
経 用 候補 見出 考え
最 臨床現場 求 い 診 技術 う 議論 い
索 用い 検体 入手 い問
逭行性 患者 検体 健常者 逭行 ン 結果 比
較 確 候補 見 い 逭行
見 臨床的意味 う 例え 近 増 傾 大
ン 節転移 認 い 鏡 外 的 除 早期 確実 治療
能 3 4 い 逭行性大 手術 施
能性 般的 早期大 自覚症状 い 初診
患者 大半 逭行性大 い 多い 大 診 い 使用
い 鏡検査 比較的早期 診 能 優 検査法 侵襲的 検査
念 ン 法 全国民 行う 困 従来 簡便 大
検査法 糞便 免疫学的潜血 応検査 血液検査 腫瘍 診 挙
検査 陰性 大 症 否定 早期
見 能性 わ い 大 検査 使用 腫瘍 大
特異的 胃 膵 肺 症 い 変動 わ 大
早期 精確 見 血液 見 い い 現状
臨床現場 治療 原理原則 早期 見 早期治療 抑え
早期 見 治療 選択性 持 克服 う いう 現実的
効 策 考え 臨床現場 実用的 治療 い
解析 期 い 超早期 診 見
早期 様々 種 能 療 革新的 診 技術
考え
6. わ
療 逭歩 本 均 世界最長 女性 86 男性
79 い 誇 い 方 厚生労働省 国民 療 概況
22 国民 療 36 67億 人 人当 国民 療 28 2400
国民 療 国 総生産 (GDP) 比率 7.60% 国民所得 (NI) 比率
10.61% 遉 元 比 20 間 国民 療 2倍 膨
因 高 治療 必要 患者 増 就業人
21
齢 間 ン ン 逭 国民 療 問 深 最終的 解
決 糸 う う 解析技術 用い
代謝 究 画期的 超早期診 法 開 逭 本書 手
手 究者 学 究 興味 抱 躍逭 期 い
参考文献
[1] Nicholson JK, Holmes E, Kinross JM, Darzi AW, Takats Z, et al. (2012) Metabolic phenotyping inclinical and surgical environments. Nature 491: 384-392.
[2] Hanahan D, Weinberg RA (2011) Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144: 646-674. [3] Hirayama A, Kami K, Sugimoto M, Sugawara M, Toki N, et al. (2009) Quantitative metabolome
profiling of colon and stomach cancer microenvironment by capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry. Cancer research 69: 4918-4925.
[4] Setou M, Kurabe N (2011) Mass microscopy: high-resolution imaging mass spectrometry. Journal of electron microscopy 60: 47-56.
[5] Miura D, Fujimura Y, Wariishi H (2012) In situ metabolomic mass spectrometry imaging: Recent advances and difficulties. Journal of Proteomics.
[6] Sugimoto M, Wong DT, Hirayama A, Soga T, Tomita M (2010) Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics 6: 78-95.
[7] Sreekumar A, Poisson LM, Rajendiran TM, Khan AP, Cao Q, et al. (2009) Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression. Nature 457: 910-914.
[8] Yoshida M, Hatano N, Nishiumi S, Irino Y, Izumi Y, et al. (2012) Diagnosis of gastroenterological diseases by metabolome analysis using gas chromatography–mass spectrometry. Journal of gastroenterology: 1-12.
[9] Nishiumi S, Kobayashi T, Ikeda A, Yoshie T, Kibi M, et al. (2012) A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostic Approach for Colorectal Cancer. PloS one 7: e40459.
[10] Dunn WB, Broadhurst D, Begley P, Zelena E, Francis-McIntyre S, et al. (2011) Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols 6: 1060-1083.
22
1-3 食品 析 析
飯島 陽子
1.
食品 い 生物代謝物 “食品 ” 認識 い 食品 機能
栄養素 機能 嗜好性 関わ 機能 生体調節維持 関わ
大 組 わ 各食品 価値 特性 決
機能 明 未知 多 調理 酵 的
生 多 食品 組 非常 複雑 食品 析 品質管理
変 知 うえ 多 ン 間 遊い 統計解析 覚
解析手法 用い [1] 香気 析 郿 析 複数
時 析 手法 比 逭 的 行
究手法 技術 い 馴染 いえ
近 健 食生活 多品目 食品 ン 摂 奨
食 安全 いう 常摂 食品 情報 意味 大 い い
特 最近 Foodomics いわ
中心 omics技術 食品自体 栄養 評価 確認 食品 機能 い 新
い知見 得 う 動 強 い [2-4] 質 析計 NMR 中心 機器 析技
術 展 ン 解析技術 確立
益 手段 栄養 食品 析 い 期 大 い
最近 食品 栄養 主 応用 い 紹 い
2. 食品 生体 代謝
栄養 健 面 食品 生体 代謝 響 い 関心 高い 個々 栄養素
代謝 究 依然 近 特定 食品 引 起
体 代謝変動 ン い 解
析例 多 報告 い 動物 象 食品 食
短期的 的 摂 う 代謝物 変動 ン
析測定 効果 調 [5-8] 糖質 ン 質
脂質 ン 主要栄養素 報告 [9-10] 析 ン
血液 血清 場 肝臓 臓器 象 場 析手法
代謝物 い GC-MS CE-MS 析 例 多 析 簡便性 NMR
析例 多い 揮 性 中性物質 LC-MS 析 行わ
い 体 代謝変動 い 解糖系 ン郿回路 既知 代謝 代謝物
網羅的 定 手法 結果 食品 機能 揮 関わ
ン 食品 機能効果 い 多変 解析 用い 覚 例
報告 い omics 相
関 融 益々 展 予想
23
3. 食品 品質
食品製造 食品 網羅的 析 場 熱 的生 象
純粋 生体代謝物 象 言え い い
貯蔵 変 食 生産 食品製造 品質評価 い 手法
活用幅 非常 大 い 貯蔵 起 要因物質等
ン 食品製造 関 食品 検出 応用 特 食品
特徴的 食品 性質 い 食感 郿 性 食品
関 解明 食品 ン 用い 性質予測 用い 産地
品種 用 う 面 応用 食品産業界 注目
茶 [11] [12] ワ ン [13] 本酒 [14] 嗜好飲料 中心 報告例
食品 析 い 注意 ン 扱い 実
析 糖 郿 いわ 中心代謝物 いわ
香気 食品 ン 析 象 異 析手段 目的
多様 般 食品 ン 生体 ン 比 呈味性 強い 糖
類 塩類 般的 生体代謝物 倒的 多 含 意味 質 析計 い
糖類 ン源 汚 原因 塩類 機器 大 感
析 前処理 十 考慮 い う
部 突出 多い 解析 い 結果 響 え
析 象食品 得方法 い 十 検討 必要
解析 い 多変 解析 ン 差 寄
ン い 例 多い 主 析 (PCA) PLS (Partial least squares) 用い
ン 間 遊い 覚 ン
寄 ン ン 差 要因 見出 能
食品 組 官能評価 食品性質 示 数値 用い PLS回
PLS-DA 予測 築 能 う 解析 複雑 食品
組 品質 性質 真 関わ 見出 食品 新 評価法 能
4. 食品安全
農薬 微生物 混入 GM作物 食 安全評価 い 用
農薬 微生物 問 い 付着 来 検出 安全 準 う
目的 多 高感 析 定 性 求 特
ng～ g/kg 問 多 象 効率的 出方法 築 要
農薬 物情報 明 場 析 行わ 揮 性
GC-MS 析 揮 性 LC-QqQ MRM 析 高感 検出 行わ
方 象物質 明 場 ン 析 行う 農薬 微生物 処理 ン
未処理 ン 得 比較 差 解析 volcano plot S-plot
24
混入物 ン 造 明 汚染
利用 能 [15]
GM作物 評価 応用 近 報告 い GM作物 非Ｇ
作物 代謝物 比較 用 増減 評価 行わ 網羅的
析 統計解析 実質的 等性 評価 い [16-17]
益 評価手法 考え 食品 関 応
用 考え
象 代謝物 生物生 現象 い 最 流
食品 い 植物 動物 来 生体代謝物 修 解 物 組 直接的
価値 栄養 品質 安全 直結 い 析機器 感 新 い
解析方法 築等 食品 析 応用範 益々広
い う
参考文献
[1] 相島鉄郎(2001), 食品 析 , , 15-22
[2] Cifuentes A. (2009), Food analysis and foodomics, J Chromatogr A, 7109
[3] Herrero M, Simó C, García-Cañas V, Ibáñez E, Cifuentes A.(2012), Foodomics: MS-based strategies in modern food science and nutrition., Mass Spectrom Rev., 49-69
[4] García-Cañas V, Simó C, Herrero M, Ibáñez E, Cifuentes A. (2012), Present and future challenges in food analysis: foodomics. Anal Chem., 84, 10150-10159.
[5] Rasmussen LG, Winning H, Savorani F, Toft H, Larsen TM, Dragsted LO, Astrup A, Engelsen SB. (2012), Assessment of the effect of high or low protein diet on the human urine metabolome as measured by NMR., Nutrients, 4, 112-31.
[6] O'Sullivan A, Gibney MJ, Brennan L. (2011), Dietary intake patterns are reflected in metabolomic profiles: potential role in dietary assessment studies., 93, 314-321.
[7] Lloyd AJ, Favé G, Beckmann M, Lin W, Tailliart K, Xie L, Mathers JC, Draper J. (2011), Use of mass spectrometry fingerprinting to identify urinary metabolites after consumption of specific foods., Am J Clin Nutr. 94, 981-991.
[8] Llorach R, Urpi-Sarda M, Jauregui O, Monagas M, Andres-Lacueva C. (2009), An LC-MS-based metabolomics approach for exploring urinary metabolome modifications after cocoa consumption., J Proteome Res. 8, 5060-5068.
[9] Llorach R, Garcia-Aloy M, Tulipani S, Vazquez-Fresno R, Andres-Lacueva C. (2012), Nutrimetabolomic strategies to develop new biomarkers of intake and health effects., J Agric Food Chem., 60, 8797-8808.
[10] Hedrick VE, Dietrich AM, Estabrooks PA, Savla J, Serrano E, Davy BM. (2012), Dietary biomarkers: advances, limitations and future directions., Nutr J., 11:109, doi: 10.1186/1475-2891-11-109.
[11] Pongsuwan W, Fukusaki E, Bamba T, Yonetani T, Yamahara T, Kobayashi A. (2007), Prediction of
25
Japanese green tea ranking by gas chromatography/mass spectrometry-based hydrophilic metabolite fingerprinting., J Agric Food Chem. , 55, 231-236.
[12] Wei F, Furihata K, Koda M, Hu F, Kato R, Miyakawa T, Tanokura M. (2012), 13C NMR-Based Metabolomics for the Classification of Green Coffee Beans According to Variety and Origin. J Agric Food Chem., in press.
[13] Cuadros-Inostroza A, Giavalisco P, Hummel J, Eckardt A, Willmitzer L, Peña-Cortés H.(2010), Discrimination of wine attributes by metabolome analysis., Anal Chem. 82, 3573-3580.
[14] Sugimoto M, Koseki T, Hirayama A, Abe S, Sano T, Tomita M, Soga T. (2010), Correlation between sensory evaluation scores of Japanese sake and metabolome profiles., 58, 374-383.
[15] Shepherd LV, Fraser P, Stewart D. (2011), Metabolomics: a second-generation platform for crop and food analysis., Bioanalysis., 3, 1143-1159.
[16] Kusano M, Redestig H, Hirai T, Oikawa A, Matsuda F, Fukushima A, Arita M, Watanabe S, Yano M, Hiwasa-Tanase K, Ezura H, Saito K. (2011), Covering chemical diversity of genetically-modified tomatoes using metabolomics for objective substantial equivalence assessment., PLoS One. 6, e16989.
[17] Picone G, Mezzetti B, Babini E, Capocasa F, Placucci G, Capozzi F. (2011), Unsupervised principal component analysis of NMR metabolic profiles for the assessment of substantial equivalence of transgenic grapes (Vitis vinifera)., J Agric Food Chem., 59, 9271-9279.
26
第 2 部 代謝物 出法
2-1 ン ン ン 出法い い
生
析 最大 特徴 情報 生物 等
得 ン 析
析 持 味 出 持 味 生 生体試料 代謝
出 ン ン 法 ン 法 検討 必要
ン ン ン 析 象 ン 集 ン ン ン
代謝 停 ン 方法
生体組織 部 回
組織 代謝 停 ン
必要 ン 外部 洗浄
必要 凍結乾燥
凍結保
過程 指 ン ン 法 ン 法 課 微生物
象 析 微生物 中心代謝 単 変動 知 い
ン 行 代謝 動 い 菌体
組 響 え 菌体外 付着 養液 洗浄 必要 技
術的 わ 困 植物 析 う 問 起
ン 大 果実 い 花粉 ン ン
い 動物 い 血清 臓器 い ン 状態
析結果 大 響 え う
方 出
凍結保 ン
出溶媒 出 部 精製 乾固 濃縮 析 ン
行い 機器 析 ン 作 作業
通常 析 測定 数種 物 100 回 率 出
以外 代謝産物 除去 方法 理想的 効率的 出条件
精製条件 索 析屋 見 所 方 析 理想的
代謝産物 100% 回 率 出 方法 望 い 特
測定 象 解 防 要 析 代謝産物
27
溶解 ― ―水法 能法 利用 本法
い 大 問 指摘 析 象 物群
異 方法 使わ い 本節 ン ン 出法 紹
比較 各手法 問 認識 必要 応 使い い 析
28
2-2 GC-MS用茶葉 酵 血清 ン 調製法
大阪大学大学院 学 究 福崎 究室
析法 狙い 適用範
GC-MS 析 供 茶葉 酵 血清 ン 代謝物 出 手法 紹
い 水― 法 い 得 水溶性画 乾固 本法 得
出物 第3部 GC-MS 析法 使用
原理
当 手法 Oliver Fiehn 開 手法 [1] 実用 含 福崎 究室
自 考案 [2]
準備 試薬
Ribitol (Wako 特 N0.018-00943)
MeOH Mixsolvent用 学 高速液体 用 N0.140-48663)
H2O Mixsolvent用 出用 Wako 高速液体 用 N0.042-16973)
CHCl3 Mixsolvent用, 学 高速液体 用 N0.140-16013)
器
2.0 mL容 (Eppendorf N0.95170)
(φγ㎜, ワン N0.YTZ-3)
装置
(MM301, Retsch)
温振 う機 (Thermomixer comfort, Eppendorf)
遠心濃縮器 (Spin Dryer Standard VC-96R ULVAC Dry Vacuum Pump DTC-41 TAITEC Freeze Trap VA-500R , TAITEC)
遠心 器
1 試料調製 出操作 茶葉 ン 場 [3]
1) 2.0 mL容 (Eppendorf社製) 15 mg (±1%) 乾燥試料
2) (φγ㎜, ワン) 1個 入 液体窒素 入
凍結
3) (MM301, Retsch) 用い 破 (20 Hz 5 min)
4) 要時調製 Mix solvent (MeOH/H2O/CHCl3=5:2:2) 混 溶液1000 µL え
20 間 混和
29
5) 0.2 mg/mL Ribitol水溶液 60 µL え 混 20 間 混和
温振 う機 (Thermomixer comfort, Eppendorf) 37 ℃ 1200 rpm
30 間振 う
6) 16000 rpm 4℃ 3 間遠心 清900 µL 新 い1.5 mL容
移
7) 清 400 µL 蒸留水 え 16000 rpm 4℃ 3 間遠心 相
新 い1.5 mL容 清 水 800 µL 移
8) 遠心濃縮中 ン 飛散防 穴 開
蓋 遠 心 濃 縮 器 (Spin Dryer Standard VC-96R ULVAC Dry Vacuum Pump DTC-41 TAITEC Freeze Trap VA-500R , TAITEC) 用い 2時間
室温 濃縮
9) 遠心濃縮器 出 液体窒素 凍結 晩凍結乾燥器
(FREEZE DRYER VD-800F, TAITEC) 供 誘 体 応 水 嫌う 水
乾燥 誘 体 応直前 乾燥状態 保 う
GC/MS試料調製 出操作 茶葉 ン 場
2 試料調製 出操作 酵 ン 場 [4]
1) OD600×Sampling volume =5 う 養液 回 決定
2) ン ン ン , 直 25 mm, , 0.45 µm
用い 引濾過 行う
30
3) 養液 濾過終了 回 養液 蒸留水 (4°C) 濾過 菌体 洗
浄 行う
4) 2.0 mL 容 (Eppendorf社製) 入
液体窒素 入 凍結 穴 開 蓋
晩凍結乾燥機 (FREEZE DRYER VD-800F, TAITEC) 供
5) 凍結乾燥 (φγ㎜, ワン) 2個入
液体窒素 入 凍結
6) (MM301, Retsch) 用い 破 20 Hz 5 min
7) 要時調製 Mix solvent (MeOH/H2O/CHCl3=5:2:2) 混 溶液1000 µL え
20 間 混和
8) 0.2 mg/mL Ribitol水溶液 60 µL え 混 20 間 混和
温振 う機 (Thermomixer comfort, Eppendorf) 37 ℃ 12,000 rpm
30 間振 う
9) 16,000×g 4℃ 3 間遠心 清800 µL 新 い1.5 mL容
移
10) 清 400 µL 蒸留水 え 16000 rcf 4℃ 3 間遠心 相 新
い1.5 mL容 清 水 ７00 µL 移
11) 遠心濃縮中 ン 飛散防 穴 開
蓋 遠心濃縮器 (Spin Dryer Standard VC-96R ULVAC Dry Vacuum Pump DTC-41
TAITEC Freeze Trap VA-500R , TAITEC) 用い 2時間 室温
濃縮
12) 遠心濃縮器 出 液体窒素 凍結 晩凍結乾 燥器
(FREEZE DRYER VD-800F, TAITEC) 供 誘 体 応 水 嫌う 水
乾燥 誘 体 応直前 乾燥状態 保 う
3 試料調製 出操作 血清 血漿 ン 場 [5]
1) 血清 血漿50 L 用意
2) 要時調製 Mix solvent (MeOH/H2O/CHCl3=5:2:2) 混 溶液250 µL え 混和
3) 部標準物質 0.5 mg/mL 2-isopropylmalic acid 10 L え
4) 温振 う機 (Thermomixer comfort, Eppendorf) 37 ℃ 1,200 rpm 30 間振
う 間 遠心濃縮機 電源 入
5) 16,000 ×g 4℃ 3 間遠心 清225 µL 新 い1.5 mL容
移
6) 清 200 µL 蒸留水 え 16,000 ×g 4℃ 3 間遠心 相 新
い1.5 mL容 清 水 250 µL 移
7) 遠心濃縮中 ン 飛散防 穴 開
31
蓋 遠心濃縮器 (Spin Dryer Standard VC-96R ULVAC Dry Vacuum Pump DTC-41
TAITEC Freeze Trap VA-500R , TAITEC) 用い 2時間 室温
濃縮 間 凍結乾燥 入 冷
ン
酵 ン 地 来 高 ン 起 い
場 実験目的 考慮 能 養時間 調整 菌体 洗浄回数 増
等 必要 菌体 洗浄回数 増 場 代謝物 能性 増え
考慮 必要
参考文献
[1] Fiehn, O.; Kopka, J.; Trethewey, R. N.; Willmitzer, L. Analytical chemistry 2000, 72, 3573–80. [2] Fukusaki, E.; Jumtee, K.; Bamba, T.; Yamaji, T.; Kobayashi, A. Zeitschrift für Naturforschung. C,
Journal of biosciences 2006, 61, 267–72.
[3] Pongsuwan, W.; Fukusaki, E.; Bamba, T.; Yonetani, T.; Yamahara, T.; Kobayashi, A. Journal of agricultural and food chemistry 2007, 55, 231–6.
[4] Yoshida, R.; Tamura, T.; Takaoka, C.; Harada, K.; Kobayashi, A.; Mukai, Y.; Fukusaki, E. Aging cell 2010, 9, 616–25.
[5] Tsugawa, H.; Bamba, T.; Shinohara, M.; Nishiumi, S.; Yoshida, M.; Fukusaki, E. Journal of bioscience and bioengineering 2011, 112, 292–8.
32
2-3 CE-MS 析用 植物 農作物 出
川 佐々木 亮
CE-MS 析 ン 調製
原理
CE-MS 通 電気泳動 行う 泳動 溶解 い脂溶性 高 子
物 析前 除去 必要 多 実験 ン 来 出物
液 限外濾過 脂溶性 高 子物質 除去 い
理 行 い 様々 農作物 含 植物 出 前処理方法 述 [1]
準備 試薬
LC-MS
出用水 LC-MS
特
部標準物質 IS1 ン ン ン -10- ン郿 IS2 3-
ン ン郿 1
器
2.0 mL ン ン
φ 5 mm
CE-MS用 11 mm pp vial (Agilent)
限外濾過 Ultrafree-MC 5000NMWL filter Unit, Millipore 装置
MixerMill (Retsch MM301)
遠心濃縮機 Savant SPD2010,ThermoElactron MicroMixer E-36, TAITEC 超音泅洗浄機 Yamato 5510, 学
出2
1) 50 mg 植物 ン φ 5 mm 1個 共 2.0 mL ン ン
入 液体窒素 凍結
2) 用 冷凍庫 冷 ン ン
MixerMill (Retsch MM301) 用い 27 Hz 1 間3粉
3) ン 新鮮 20倍容4 8 M IS1 含 冷MeOH え MixerMill
1 Human Metabolome Technologies Inc. IS混 液 販売 い
2
水溶液 ン 場 前処理 逭
3 ン 2-3 間 粉 時間 要 場 試料 融解 注意
4 ン 含 物濃 変更 場
33 用い 27Hz 1 間撹拌
4) ン 15,000 g, 3 min, 4 °C 遠心 5 清 出液
前処理
1) 清500 L 1.5 mL ン ン 出液 水
= 5:2:5 う 水200 L 500 L え 出液 500 L
い場 IS1入 足 比率 う え 水
減 ン 水溶液 場 ン 200 L IS1入
500 L え
2) 撹拌 (MicroMixer E-36, TAITEC) 3 間 混和
3) 15,000 g, 3 min, 4℃ 遠心 水 出来 回 液 500 L 目安
1.5 mL ン ン 移 6
4) 開 遠心濃縮機 Savant SPD2010,ThermoElactron 30 間 45 °C
濃縮 行う 操作 水 溶解 い 揮 溶解 い
現 多 場 再 2 7
5) 全 限外濾過 Ultrafree-MC 5000NMWL filter Unit, Millipore 移 9,100
g, 120 min, 4 °C ン ン 8
6) 濾液 遠心濃縮機 乾固 120 min. 45°C 9 7) 200 M IS2 含 水 20 L添 溶解
8) 3 間 必要 応 超音泅洗浄機 Yamato 5510, 学 用
い 溶解 CE-MS 析 ン
9) CE-MS 析 ン CE-MS用 2本 9 L 注
付 ン ン 析 用い 10
5 多数 ン 処理 TOMY MX 便利 選択 1.5
2 mL 最大72本 時 処理
6 境界面 中間 ン 質 多糖類 凝集 い
い う 注意 操作 再 液 行う 多少混 良い
7 ン 状態 2 い場 場 全 用い
8 移 ( ) 凝集 ン 質等 回 い う
注意 ン ン 廃棄 ン 目
濾過 い場 場 引 時間 用い
濾過 行 方 早い 多い
9 析 行わ い場 終了 段階 -80℃ い 保
10 CE-MS
用 部 状 ン 溶液 底部 落 必要
ン 数 少 い 場 手 振 応 ン 場
KUBOTA製 PlateSpin ン 用 用い
楽 ン ン ン
34 ン
植物体 比較的破 出 易 い場
適用 以 う 農作物 ン 中 方法 破 い
1) ン 大 100 mg以 ン ン 困 100 mg 大 い
ン 用い い場 例 大 葉 接種 葉全体
2) 水 含 多 凍結 氷塊 う 破 い場 例 果実 水 多
い 菜
3) 維質 破 い場 例 部 木皮
処方法 以 通
1) 大容 前章 述 用い
勧 粉 用 数 大 種類 ン 検討 必要
使え い場 大 ン 用い 時 乳鉢 乳棒 凍結
ン 粉 場 析誤差 大
い 注意 連 析 1) 大 乳鉢 用い 2) 操
作 え 力 粉 要 時間 行う 3) 実験者 行う 望 い 2) 大型 粉 器 用い 液体窒素中 粉 凍結乾燥 勧 前者
株 本精機製作所 ン 用い 状
ン 得 出来 粉 中 移 ン 融解 防
素早い操作 予冷 必要 ン 融解 予期 酵素 応
代謝物 郿 引 起 細心 注意 払わ い 者 凍結乾
燥 い 様 理 ン ン 凍結乾燥 効率 ン 包
細 凍結乾燥機 出来 素早 行う必要
能 凍結乾燥瓶 予冷 望 い 凍結乾燥 ン 粉
容易 粉 物 混 ン 均 利 常温 扱え
ン 保 再 注 適 い 方 凍結乾燥 代謝物 検出濃
変動 報告 [1] 必要 応 予備実験 検出 物 い
確認 良い
3) 本的 乳鉢 乳棒 用い 破 行う 条件 特
種類 数 粉 部 凍結乾燥 粉 状
態 維 場 多い 場 無 溶媒 出 逭
溶媒 出 性 粉 木皮 感想 ン
凍結融解 心配 い 時間 磨 わ い
多糖類 多い洘藻 限外濾過
目 電気泳動 物理的 阻害 起
う 農作物 出 前処理 様々 困 伴う 多い 2
35
出 析 行 い ン 場 予備実験 行 望
い
2．最凶
様々 析 ，中 出以前 粉砕 困難 直面
．粉砕 い いえ う 思い浮
？ 硬い 大 い う ．確 問題 ．良 ，水 多
含 臓器や果実 凍結粉砕 う 思 液体窒素 入 氷 塊
い ！ 硬 壊 い ， いう例 ．乳鉢 ぶ う
， 氷 塊 ，特 大 ，腕力 vs.乳鉢 い
戦い ， 勝 不毛 結果 残 ． 時間
融解 う ，繰 返 液体窒素 乳鉢 入 い 乳鉢 冷え
え 苦労 い う ？ 対 ， 細 化
5 mm ，専用 粉砕器 ー や ー 用い ，無
駄 体力 有 余 い 学生 や ， ． ，繊維質 多
い 粉砕 苦労 ， 粉砕 条件 ー 粉砕 ー 選択
う い 思い ． 対 ，
凍結乾燥 行 粉砕 非常 容易 ．水
，簡単 粉砕 ． 融解 恐 ，得 粉 注
可能 ． ，凍結乾燥 代謝物含量 響 ，気
方 確認 行 方 良い [1]．
当 や い 思い ？私 出会 中
最凶 干 柿 ．液体窒素 入 石 う ．中身 詰
い い ，氷 硬 石 ．多 凶器 ．無理 乳棒 殴
い い 割 ，小石 ． 乳鉢 格闘 腱鞘炎
思うほ 腕 郾使 ． ，食べ 方 思い
，干 柿 弾力 ． 凍結 前や凍結後融解 乳棒
や ぶ ぶ 粉 ー 全 湧 ．凍結
乾燥機 い 前 無力 ．元々水 抜 い 干 柿 ，凍結乾燥後
ぶ ぶ ．私 根性 粉砕 ，他 う 完全 粉砕
い ．恐 ，強力 ーや ー 用い う 思
い …．誰 良い方法 是非 一報 い…．
引用文献
[1] Oikawa A, Otsuka T, Jikumaru Y, Yamaguchi S, Matsuda F, Nakabayashi R, Takashina T, Isuzugawa K, Saito K, Shiratake K. J Sep Sci. 2011 Dec;34(24):3561-7.
36
2-4 CE-MS用雑草 代謝物 出法
宮城 敦子
析法 狙い 適用範
当 究室 Agilent社 CE-Q-MS 用い 主 植物試料 代謝物 機郿 ン郿
物 郿 解析 行 い 溶性 郿 経路特定
料 当 究室 用い 場
い 紹 [1,2]
代謝物 解析
原理
ン ン 出 限外濾過
供 高 子 除去 い
準備 試薬
部標準液 100 M PIPES 陰 ン用 100 M MES水溶液 陽 ン用 400 M PIPES 1, 4- piperazine diethane sulfonic acid 溶液
1 ml 400 M MES Methionine sulfone 溶液
1 ml MilliQ水
2 ml 100
器
乳鉢 乳棒
1.5 ml ン
限外 過用 ン Amicon 3 kDa cut off filter付 型番 UFC5003
液体窒素
氷
1) 遠心機 電源ON
2) 乳鉢 乳棒 氷 液体窒素 用意
3) ン 測定 出液中含 試料 生 測定
4) 乳鉢 乳棒 液体窒素 冷 予 液体窒素 凍 葉 -80℃ 保管 液体窒素
ン 中 入
5) 氷 ン 置
37
6) ン 500 l弱 い 50-100 mg 移
7) ン 入 ン 液体窒素中
8) ン 液体窒素 出 開 ン
9) ン 液体窒素 戻 開 氷 戻
10) 100 え ン 質 活 11
11) 部標準液 え 冷 5 間
12) 4℃ 15000 rpm 5 間遠心
13) 限外 過 ン 付
14) 限外 過 ン 清 移
15) 4℃ 12000 rpm 30 間遠心
16) ン 部 外
17) 出液 入 ン CE-MS 泳動 80℃ 保管
ン
部 異 代謝物 ン 異 ex 葉身 葉柄 代謝物 ン 大 異
前 試料 大 い場 実験 目的 容 試料
部 程 使用 検討 出来 ン 回 前 予 必要部
良い
参考文献
[1] Miyagi et al. (2011) Fate of 13C in metabolic pathways and effects of high CO2 on the alteration of metabolites in Rumex obtusifolius L. Metabolomics, 7 (4), 524-535.
[2] 宮城 2011 雑草 究 1 − 植物種間比較解析− 農業 園芸 第86巻10 1062-1066
11
ン え 出液 ン 応 適 変更 植物試料 葉 場 50 mg
200 µl え 必 部標準液 う
38
2-5 農作物 ン ン 方法 計画法
岡崎 圭毅
本 狙い 適用範
外 場 ン 析 行う 計画 ン ン う
い 留意
外 場 植物 ン ン ン 法
準備 包
ARS 選定鋏
設備
場 屋外 ン 様
凍結乾燥機 EYELA FD-550
1) 象作物 植密 わ 播種設計 立 株間5～60 cm × 畝間40～70 cm 10
～20株 ×3回程 ン ン 1 150～200株程 確保 う
2) ン ン 決 時間 行う ン ン 場所 試験 全体 見渡
均的 生育 部 行う 境界 株 前回 ン ン 2株 象
外 株数 6～20 い
3) 速 調査室 移動 部 茎 葉 子実
新鮮 測定 均 う 混 50～100 g程 秤
袋 入 冷凍庫 30℃ 保
4) 凍 結 試 料 速 凍 結 乾 燥 乾 物 測 定 振 動 粉 器 CMT 社
TI-100 等 用い 微粉 糖含 多い ン 型粉 器 ワンSM-
用い 1213
12
大 菜 ン ン 場 中心線 通 う 1/8程 面
銀 型 う 5 mm程 厚 水 含 高い ン
袋 中 袋 作 中 ン 入 液 袋 外 漏 い う
13
微粉 ン 均 要 粉 前 試料 良 混 試料 半
以 粉 用い う
39
○ ○ ○ ○ ○ ○
○ × × × × ○
○ × × × × ○
○ × × × × ○
○ ○ ○ ○ ○ ○
○ ○ ○ ○ ○ ○
○ ● ● ● ● ○
○ ● ● ● ● ○
○ ● ● ● ● ○
○ ○ ○ ○ ○ ○
○ ○ ○ ○ ○ ○
境界 外す
前回 サン プ ン ２株以上離す 前回 サン
プ ン 跡
ン
ン 以 3
植物体中 均 い 認識
部 ン ン 行う
全体 映 縮 法 考え
植物 比較 大 個体 扱う 多 個体 試料
ン 用い 葉 決 ン ン 方法
大 処理間差 然 い 最初 ン
ン 法 勧
40
2-6 GC-MS LC-MS用出芽酵 大 菌 ン ン 出法
生
本 狙い 適用範
出芽酵 酵 用い 用微生物 大 菌 用物質生産
宿主 近 様々 活用 い 両者 生物
究 料 い
本 酵 大 菌 中心代謝産物 GC-MS, LC-QqQ-MS 析 用
い 方法 紹 微生物 ン ン 法 部 代謝 応 早 停
菌体外 地 除去 問 軽減 代
謝物 出法 夜改良 え い [1,2] 回 全 異 考え方 2
紹
原理
法 -80℃ 冷 水溶液 菌体 液体
地 懸 細胞 部 代謝 停 細胞外 地 除去 菌
体 遠心 回 機溶媒中 細胞 懸 無 い 細胞 代謝産
物 流出 いわ い 程 高い 養液 い 利用
い 操作 再現性 い 抱え い 酵 中心代謝産物 出法
用い い
法 濾過 微生物細胞 液体 地 凍結 い
冷 洙漬 ン 行う方法 時 洗浄 え 細
胞外部 洗浄 い 考え い ン ン 開始 ン
早 数十 必要 間 代謝物組 変 析結果 映
OD い 養液 菌体 ン ン
ン 設備 必要 高価
法 酵 細胞 80℃ 75% 水溶液中 数 ン
出液 濃縮 析 供 方法 簡便 い回 率示
報告 い LC-MS/MS 析 ン源 著 汚染 夾雑物 多
含 出物 調製 要 除 い 菌体 顕著 着色 い
地 酵 機 多 含 場 機器 析 支 出 能性
注意 必要
水法 微生物 析 出法 実績
絶 文 言わ い ン 冷 中 微生物細胞 破
得 出液 水 え 2 水相 回 減 乾固
析 供 本法 疎水性 液液 配 除去 析時 装置 汚染
軽減 方 液液 配時 代謝物 回 率 減少 考え い
大 菌 細胞壁 酵 比 ン 時 代謝物 起
