定量生物チュートリアル資料 Simulation model 基生研 定量生物学研究部門

THE ^定

青木 一洋

京都大学大学院医学研究

時空間情報 ン 点

第４ ₊ ５回定 生物学 会 ュ

今日 容

• ^ン

• ^{生化学的 定}

– ^{ン 質濃度 簡単}

– ^散定数

– ^{解 定数}

– ^{反応速度定数 しい}

• ^{他 定 例}

ン 質濃度

C [M]

解 定数＆相互作用＇

K

[M]

酵素反応速度定数

k

[/M/sec] K

[M]

散定数

D [m

/sec]

生化学的

ン 質濃度 _/ 細胞

M ^{＆ ＇} = mol/L

molecules/L/cell

単 ：

／細胞あ 分子数

＆ _10^3 ～ _10^6 個＇

／細胞あ 体積

＆～ _pL ＇

少 い分子 _{1~10 nM}

多い分子 _{1~10 mM}

C [M]

ン 質濃度

生化学的 _> ン 質濃度

分子数 _/ 細胞 測定法 _-1

1. ^{ン ン}

質 精製

2. ^{濃度 測定＆} Bradford, BSA

準 _CBB 染色＇

3. ^{細胞 数 測定し＆} Cell

counter ^{＇ 決 細胞数}

細胞溶解液 準備

4. 2, 3 ^流し densitometry

定

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S1

ン 細胞溶解液

結構 しい

生化学的 _> ン 質濃度_>分子数 測定

ン 質 精製 い場合

1. ^ン Tag ^ン

質 精製

2. Tag ^{融合し ン 質}

細胞 発現 細胞溶

解液 作

3. ^{段 定}

Aoki, et al., JCB, 2007, Supplementary Figure S2

GST

5Myc

YFP

3HA

FLAG

／段 目

融合 ン

質 数 定

０段 目

定 し 融合

ン 質 在性

ン 質濃度 逆算

生化学的 _> ン 質濃度_>分子数 測定

余談： ン酸化 定

生化学的 _> ン 質濃度_>分子数 測定

1. ^ン

2. 100% ^ン酸化 Reference ^作

3. Phos-tag ( ^述 )

ン酸化抗体 _IP し

ン

＆ _100% ン酸化＇

Fujioka et al., JBC, 2006

Terai et al., EMBO Rep, 2006

細胞 体積 定

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S1

養細胞 ン し 球 し 計算

細胞体 ₊ 核 核

3

3

4 r

Volume _{ }

共焦点 測定し あ 変わ

生化学的 _> ン 質濃度_>体積 測定

ン 質 濃度測定あ

• Western blotting ^付

– ^ン

– ^当

– ^抗体＆ polyclonal or monoclonal ^＇

• ^体積

– ^細胞

 ^{細 い 気 し い！}

有効数 一桁 い 限界

生化学的 _> ン 質濃度

分子数 知 面白い

0.001 0.01 0.1 1 10

Huang et al.

Bhalla et al.

Schoeberl et al.

Sasagawa et al.

Brightman et al.

Hatakeyama et al.

ン 質濃度

ン 質濃度 _{[ [ m m M] M]}

Ras Ras

MAPKKK

MAPKKK

MAPKK

MAPKK

MAPK MAPK

々

生化学的 _> ン 質濃度

ン 将来展望

• ^{在性 分子 認識 抗体 必要 時間}

比較的簡単

 ^{質 分析 絶対定}

• ^{大多数 細胞 平均値 い}

 TALEN CRISPR ^{／細胞 在}

性分子 可視化

生化学的 _> ン 質濃度

ン 質濃度

C [M]

解 定数＆相互作用＇

K

[M]

酵素反応速度定数

k

[/M/sec] K

[M]

散定数

D [m

/sec]

生化学的

生化学的 _> 散速度

散定数

散定数

D [m

/sec]

散定数

散 早い分子＆細胞質＇ _{1~10 mm} ² _/sec

 ^{養細胞 あ ば 数 端 端 動}

 ^{従 細胞 反応 多 活性化 速＆× 散 速＇}

散 遅い分子＆細胞膜＇ _{0.01~0.1 mm} ² _/sec

核 核外

移行速度

k

, k

[/sec]

生化学的 _> 散速度＜ 散定数

Stokes-Einstein ^式

k

D

R

T

D k ^B



 6

T



R

散速度 _[m

_/sec]

ン定数 _[m

_{g sec}

_K

_]

絶対温度 _[K]

粘性係数 [g/m/sec]

流体力学的粒子半径 _[m]

ば ば 液体＆ _ 大＇ _ 散遅い

い分子＆ _R 大＇ _ 散遅い ＆ _R 分子 _{M 1/3} 乗＇

温度 あ 関係 い＆ _0~30 ℃＇

生化学的 _> 散速度＜ 散定数 Stokes-Einstein

う 測定 ：蛍光 ン

• FRAP ^＆ fluorescence recovery after photo-

bleaching ^{褪色 蛍光回復法＇} , FDAP

(fluorescence decay after photo-activation ^光

活性化 蛍光減衰法 ₎

– ^{散速度 い分子 測定 適し い}

• FCS ^＆ Fluorescence correlation spectroscopy ^蛍

光相関分光法＇

– ^{散速度 大 い分子 測定 適し い}

生化学的 _> 散速度＜測定方法

FRAP ^{褪色 蛍光回復}

J. Lippincott-Schwartz, Nature Rev Mol Cell Biol 2 (2001) 444

生細胞

ン

固定細胞

生化学的 _> 散速度＜_FRAP

Photo-bleaching by CLSM

Venus-KRasCT

形質膜 ン

生化学的 _> 散速度＜_FRAP

光活性化型蛍光 ン 質

Lukyanov KA, et al., 2005, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.

生化学的 _> 散速度＜_PA-FPs

Diffusion of PA-GFP in a cell and in PBS

生化学的 _> 散速度＜_PA-FPs

FRAP ^{散速度 定}

J. Lippincott-Schwartz, Nature Rev Mol Cell Biol 2 (2001) 444

時定数 _ 散時間 _t

D

生化学的 _> 散速度＜_FRAP 散速度 定

＆ _Non-linear ＇ _fitting う ＝

生化学的 _> 散定数>Fitting ^方法

Excel Solver ^{最適化 簡単}

実験 人 覚え 損 い

Kemmer and Kellar, Nat. Protoc., 2010, 5:267-81. PMID 20134427

論文参照し _↓

＆ 次元 散 ＇ 散速度 算出

D

D ^{4 } t

 2

Axelrod, et al., 1976, 16, 1055, Biophys. J.

 ^D

t

散速度 _[m

_/sec]

半径 _[m]

散時間 _[sec]

あ 次元 散 領域 褪色

適応 理論

• ^{細胞膜分子 散＆ 次元＇ 使え}

• ^{細胞質分子 散 式 使わ い い}

い 細胞形状 影響 ン し い

生化学的 _> 散速度>FRAP> ^{散速度 算出方法}

Time

Signal

฀

฀

Time

Signal

฀

฀

早い 散 早い揺

遅い 散 遅い揺

蛍光相関分光法 _FCS

http://www.mpip-mainz.mpg.de/62430/Fluorescence_Correlation_Spectroscopy

共焦点 顕微鏡

生化学的 _> 散速度_>FCS

自己相関関数

Time

Signal

฀

฀

Time

Signal

฀

฀

早い揺

遅い揺

自己相関関数

  ^{   } _{ }

t

F

t

F

t

G F

 ^{ t}

t   ^

    ^{t F t F}   ^t

F _{ }

 ^F   ^{t  平均値}

Lag time _฀ Gauto(฀)

฀

฀

時間 _t

い相関

残 い

自己相関関数 自力 求 _{Matlab R} 一瞬 計算可能

生化学的 _> 散速度>FCS>^{自己相関関数}

Time

Signal

Lag time_฀ Gauto(฀)

Time

Signal

Lag time_฀ Gauto(฀)

早い 散 早い揺 い 散時間

遅い 散 遅い揺 大 い 散時間

蛍光相関分光法 _FCS

自己相関関数

t

^散時間

生化学的 _> 散速度>FCS>^{自己相関関数}

3D ^{単純 散}

   

D

D

^k

G

G ^{t }  t t ¹  ¹

 t t

1

1

0 1

実効体積＆共焦点体積＇ _[m

_]

  V C

G

eff

0 _ 1

t

k

z xy

V

_

_

_



C ^{蛍光分子濃度} [molecules/m

]

散時間 _[sec]

構造定数＆ structure paraemter ^＇

= Z

/r

^～ 2-5

共焦点体積 中

蛍光分子数

D

D

 t

4

2





2



2

散速度 式

大体 _{~ fL} い 細胞 体積 _{~ pL}

~ 0.5 _mm

~ 2.0 _mm

生化学的 _> 散速度>FCS>^１D^{単純 散}

Rhodamine 6G _{ω, k} ^求

D

D

 t

4

2



6^G

 280

D

^[ mm

^/sec]

水溶液中 Rhodamine 6G ^散定数＆ 20 ^℃＇

分 い

0.

1. ^水溶液中 Rhodamine 6G FCS ^測定

Lag time _฀ Gauto(฀)

฀

฀

2. ^{得 自己相関関数 １} D ^{単純 散 ン し} _t

, k ^求

3. ^{散速度 式 代入し} _

^求

生化学的 _> 散速度>FCS>Rhodamine 6G ^ョン

FCS ^実例

細胞 環境 水 比べ _2-3 倍粘性 高い

-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0.01 0.1 1 10 100

Delay time (ms)

Normalized G(0)

実験値 Fitting 実験値 Fitting

D=19.6 _mm

/s

D=7.7 _mm

/s

PBS

細胞 GST-GFP: 45 kD

R

T

D k



 6

粘性

生化学的 _> 散速度>FCS>FCS^実例

FRAP vs FCS

FRAP FCS



2



2

~ 0.5 _mm

~ 2.0 _mm



^{大 い＆ ~ 1-10 mm ＇} 

^{い＆ ~ 0.5 mm ＇}

共焦点 顕微鏡 あ ば

共焦点 顕微鏡＋専用 装置

必要

~ _msec

~ msec

時間分解能 時間分解能

 ^散現象  ^散現象

生化学的 _> 散速度>FRAP vs FCS

異常 散 分子混 合い

t

D

D _

R

T

D k



 6

粘性

＆

物理定数＇

散 散

McGuffee SR, Elcock AH.

PLoS Comput Biol. 2010

^{Time t1 t2 t3}

生化学的 _> 散速度_>異常 散

FCS ^{異常 散 定}

Banks et al., 2004, 60(2), 131-139.

      ^{t G t t}

^k  ^{t t}



G ^  ¹  ¹



1

1

0 1



t

D

D _

Anomalous exponents

相関

隙間 早 散

相関

あ

混 合い分子 動

生化学的 _> 散速度_>FCS 異常 散 定

(1) YFP-ERK2-FKBP

(2) H1-FRB

共焦点顕微鏡 _;

HeLa ^細胞

(1) YFP-ERK2-FKBP

(2) FRB-NES

(1) YFP-MEK1-FKBP

(2) H1-FRB

核 移行速度 核外移行速度

生化学的 _> 散速度＜核 核外移行速度 定

核 核外移行速度 定

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S3

ン 将来展望

• ^{顕微鏡 高い 顕微鏡 えあ ば 蛍光 ン}

質 測定 比較的簡単

• ^{細胞質 局在 う ン 質 散}

速度 大 い 一瞬 細胞 端

端 動

• ^{細胞膜 細胞 局在 う}

ン 質 関し 散速度 測定

面白い 見え 思わ

生化学的 _> 散速度

ン 質濃度

C [M]

解 定数＆相互作用＇

K

[M]

酵素反応速度定数

k

[/M/sec] V

[M]

散定数

D [m

/sec]

生化学的

生化学的 _>解 定数

ン 質相互作用 解 定数

解 定数＆相互作用＇

K

[M]

[/sec]

f b

d

k

K _ k

[/M/sec] ^{ [M]}

単

ば い 強い結合力

~ nM: ^強い

~ _mM: ^{あ 強 い}

生化学的 _>解 定数

平衡状態近似 _Kd 計算式

  _{  k      A B  k AB  0}

dt

A

d

b f

  _{  k      A B  k AB  0}

dt

B

d

b f

  _{ k      A B  k AB  0}

dt

AB

d

b f

  

  ^{A AB B}

k K

k

d f

b

_{ }

辺

平衡状態

[A], [B]

結合し い い

A, B ^濃度

生化学的 _>解 定数

平衡状態近似 _Kd 計算式

  

  ^{AB B}

K

_ A

  ^{     }

d

free

K

B

AB

totalA

AB _ ^

  ^{AB totalA} _{K  } ^{ } _B ^B

d





[B

]

K

0

[AB]

[A

]

[A

]

2

生化学的 _>解 定数

Scatchard plot ^法

http://bsd.neuroinf.jp/wiki/ ^結合定数

生化学的 _>解 定数

ン 質間相互作用 検出法

• In vitro

– In vitro ^結合

– ^{表面 ン共鳴法}

• In vivo (in cellulo?)

– ^{蛍光共鳴 移動 FRET}

– ^{蛍光相関分光法 FCCS}

– ^{分子蛍光相補 BiFC}

– …

生化学的 _>解 定数_>

In vitro ^結合

1. ^{結合 ン 質 精製 ＆結構 しい＇}

2. ^{ュ 混 共沈}

3. Western blotting ^定

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

生化学的 _>解 定数>In vitro>In vitro^結合

表面 ン共鳴法 _BIACORE

1. ^{結合 ン 質 精製 ＆結構 しい＇}

2. ^{片方 固定}

3. ^{う片方 ン 質 流し} RU ^＆ Response unit ^{＇ 測定}

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

：結合速度定数＆ _kf ＇ 解 速度定数＆ _kb ＇ 測定

生化学的 _>解 定数>In vitro>^{表面 ン共鳴法}

In vitro In vivo ^違い

in vitro

in vivo

ive

0.5 1

0

in vitro Kd

[AB]/[Total B]

[Total A] - [AB]

0.5 1

0

in vivo Kd

[Total A] - [AB]

[AB]/[Total B]

A ₊ B AB

C AC

A ₊ B AB +

D BD

+

0.5 1

0

in vivo K^d

[Total A] - [AB]

[AB]/[Total B]

A ₊ B AB

In vivo Kd

> In vitro Kd

In vivo Kd

< In vitro Kd

競合阻害

分子混雑

生化学的 _>解 定数>In vitro in vivo ^違い

蛍光共鳴 移動 _FRET

B

k

k

A ^＋ A B

FRET

1. ^細胞 CFP, YFP ^{融合 ン 質 数}

2. FRET ^補正＆ Cross-excitation, Bleed-

through, FRET ^効率 Quantum efficiency)

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET

HeLa/CFP-MEK1

 9.2 x 10

CFP / cell

蛍光 ン 発現細胞 ン 取

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^{細胞 蛍光 ン 質 数}

4.0E+11

Recombinant tag protein (molecules)

2.0E+11 1.0E+11 5.0E+10 5.0E+4 2.5E+4 1.25E+4

Blot: anti-GFP

(MBL)

HeLa/ m1C-xMEK1

(cells)

50 75 KD

1. ^{蛍光 ン 質遺伝子}

入 ＆ _/ ン

ン ン 線形 _DNA

＇

2. ^{ン ン ＆限}

界希釈法＇

3. ^{取 ン 対し}

蛍光 ン 質 発現 定

4. ^{ン 条件 固定し}

蛍光 ン 数 _/ 蛍光強度質

算出

蛍光 ン 発現細胞 ン 取

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^{細胞 蛍光 ン 質 数}

1. ^{蛍光 ン 質遺伝子}

入 ＆ _/ ン

ン ン 線形 _DNA

＇

2. ^{ン ン ＆限}

界希釈法＇

3. ^{取 ン 対し}

蛍光 ン 質 発現 定

4. ^{ン 条件 固定し}

蛍光 ン 数 _/ 蛍光強度質

算出

HeLa/mVenus-MEK1

 6.2 x 10 ⁶ YFP / cell

50 75

KD _4.0E+11

Recombinant tag protein (molecules)

2.0E+11 1.0E+11 5.0E+10 5.0E+4 2.5E+4 1.25E+4

Blot: anti-GFP

(MBL)

HeLa/ m1V-xMEK1

(cells)

CFP beads

 f = 100 nm)

9.2 x 10

[CFP / cell]

 6.9 x 10

[CFP / bead]

7.2 x 10

[intensity / cell]

Microscopy: IX-71

x60, ND 0, bin 8, Glass Dichro, c-c 100 ms

 130 [CFP / intensity]

5.4 x 10

[intensity / bead]

/

=

130 [CFP / intensity]

x

=

ョン用

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^{細胞 蛍光 ン 質 数}

HeLa/

mVenus-MEK1

一度 ョンし し えば 実験 加え 蛍光強度 測

定 ば細胞 蛍光 ン 質分子数 分

YFP beads

 f ^{= 5} mm)

6.2 x 10

[YFP / cell]

 3.9 x 10

[YFP / bead]

2.8 x 10

[intensity / cell]

Microscopy: IX-71

x60, ND 0, bin 8, Glass Dichro, y-y 100 ms

 22 [YFP / intensity]

1.8 x 10

[intensity / bead]

/

=

22 [YFP / intensity]

x

=

ョン用

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^{細胞 蛍光 ン 質 数}

HeLa/

mCFP-MEK1

一度 ョンし し えば 実験 加え 蛍光強度 測

定 ば細胞 蛍光 ン 質分子数 分

分子間 _FRET 必要 補正

350 400 450 500 550 600

0

50

100

波長 _(nm)

励起 し 蛍光 (%)

350 400 450 500 550 600

0

50

100

波長 _(nm)

440

±

₂₀

480

±

₃₀

535

±

₂₆

440

±

₂₀

505

±

₁₀

535

±

₂₆

CFP Bleed Through YFP Cross Excitation

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>Cross-excitation, Bleed-through ^補正

Bleed Through, Cross Excitation ^補正

y = 0.0887x R 2 = 0.9991

0.E+00 1.E+05 2.E+05 3.E+05

0.E+00 1.E+06 2.E+06 3.E+06

Ex. 505 / Em. 535

Ex . 440 / Em. 535

y = 0.5462x R 2 = 1

0.E+00 2.E+05 4.E+05 6.E+05

0.E+00 5.E+05 1.E+06

Ex. 440 / Em. 480

Ex . 440 / Em. 535

CFP 54.6% ^蛍光

FRET ^ン

YFP 8.9% ^蛍光

FRET ^ン

注意： 顕微鏡 値 異 _!

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>Cross-excitation, Bleed-through ^補正

Corrected FRET (cFRET) ^計算

cFRET = FRET – (Bleed Through) – (Cross Excitation)

= FRET – 54.6 x CFP – 8.9 x YFP

350 400 450 500 550 600

波長 _(nm)

本来の _FRET シグナル

cross-excitation

bleed-through

蛍光強度 (% )

  ^{cFRET cFRET}

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>Cross-excitation, Bleed-through ^補正

MEK1WT-m1v + m1c-ERK2WT

m1v-MEKWT + m1c-ERK2WT

FRET

ch.

YFP

ch.

CFP

ch. ^cFRET

- 0.089* - 0.55* =

C - Y Y - Y C - C

YFP-MEK1

CFP-ERK2

CFP-ERK2

MEK1-YFP

Epi;

HeLa cell

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>Cross-excitation, Bleed-through ^補正

最適 蛍光 ン 質

Before

photo-bleach

After

photo-bleach

YFP-MEK1

( ^大過剰 )

CFP-ERK2

( ^{発現 少} )

0 20 40 60 80 100 120

Before PB After PB )o% (ecnecsreluN fPF Ydelizarmo YFP

90 100 110 120 130

Before PB After PB )o% (ecnecsreluN fPF Cdelizarmo CFP

FRET efficiency = 15.6 ^± 2.6 %

Epi;

HeLa (Italy) cell

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^最大 FRET^{効率 算出}

最大 _FRET 効率 算出

Q

16 %

1. ^各細胞 [YFP-MEK1]

, [CFP-ERK2]

,

[cFRET] ^{蛍光 算出}

2. [MEK1-ERK2] ^{以 計算式 算出}

[MEK1-ERK2] = [cFRET] *

FRET

1 1

*

MEK

ERK

CFP

fluorescence

100 _{ 84 %}

YFP

excitation

16 %

YFP

fluorescence

10 %

Q

~ 0.6

3. [ERK2]

^{以 計算式}

[ERK2]

= [ERK2]

– [MEK1-ERK2]

4. ^ン Kd ^求

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^実際 Kd^{測定 手順}

実際 解析手順

YFP ch. CFP ch. cFRET cFRET/YFP

YFP- :

MEK1

CFP-

ERK2

:

9 1

:

3 1

:

1 1

:

1 3

:

1 9

FRET MEK-ERK ^{結合 可視化}

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>^生

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 10 20 30 40

Free ERK (uM)

Bound MEK/Total MEK

Fitting M:E=1:9 M:E=1:3 M:E=1:1 M:E=3:1 M:E=9:1

K _d = 2.0 ^± 0.2 _mM

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

0 2 4 6 8 10

Free ERK (uM)

Bound MEK/Total MEK

Fitting M:E=1:9 M:E=1:3 M:E=1:1 M:E=3:1 M:E=9:1

Fitting Kd ^算出

生化学的 _>解 定数>in vivo>FRET>Fitting

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

蛍光相互相関分光法 _Kd 測定

生化学的 _>解 定数>in vivo>FCCS

分子間 _{FRET Kd} 測定 い

 ^{蛍光相関分光法＆ FCS ＇ 蛍光相互相関分光法＆ FCCS ＇}

細胞 _Kd 測定法 開発

解 定数定 ： ン 将来展望

• In vitro ^{ン 精製 面倒 In vivo 定}

的 蛍光 ン 質 測定 面倒

 FCS, FCCS ^{改善 網羅的 Kd}

測定 現時点 しい

• In vivo ^{場合 細胞質 結合 測定}

可能

 ^{形質膜 分子 Kd 測定 今}

課題

生化学的 _>解 定数

ン 質濃度

C [M]

解 定数＆相互作用＇

K

[M]

酵素反応速度定数

k

[/M/sec] K

[M]

散定数

D [m

/sec]

生化学的

生化学的 _>酵素反応速度定数

- ^{ン ン}

酵素反応速度定数

k

[/M/sec] K

[M]

k _b

k _{f k}

cat

v : velocity of reaction

[S] : substrate concentration

K

: Michaealis constant

V

: Maximal velocity

  

  ^S

K

S

E

v k

m cat





d f

cat b

m

^K

k

k

K _ k ^ ~

  ^E

k

V

_

生化学的 _>酵素反応速度定数_> ン ン

う 測定

1. ^{酵素 質 ン 質 精製}

2. ^{試験管 反応 初速度 測定}

3. Lineweaver-Burke plot K _m V _max ^求

In vitro

 

max 0

1

1

1

V

S

V

K

v

m

_



ン ン式

線形化し い

生化学的 _>酵素反応速度定数_>測定法

し し

非線形 ン 求 い い い＝

生化学的 _>酵素反応速度定数_>測定法

実例 _{: MEK ERK} ン酸化速度

pY

ERK

pT pY

pT pY

ERK

ERK

MEK

Enzyme

MEK1

ERK2

Substrate

ATP

Mg

NaCl,

Tris Buffer,

etc,,,

室温

Stop kinase

reaction by adding

2 x sample buffer

Incubate

生化学的 _>酵素反応速度定数_>実例

ン酸化 分

P

P

P

P 生化学的 _>酵素反応速度定数>Phos-tag

MEK in vitro ERK ^ン酸化

Blot: anti-ERK1/2

In vitro kinase reaction

GST-xERK2 K57R

12His-Flag- xMEK1-SDSE

+

0 5 sec 1 min 3 min 5 min 10 min 30 min 60 min10 sec 30 sec ^KD

47 93 120

anti-pTpY- ERK1/2

Red: ERK Green: pTpY-ERK

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

生化学的 _>酵素反応速度定数_>MEK in vitro ERK ^ン酸化

何割 ン酸化 入

定 的 分

MEK in vitro ERK ^ン酸化

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

生化学的 _>酵素反応速度定数_>MEK in vitro ERK ^ン酸化

2uM 1uM 0.5uM

0.25uM 0.125uM 0.0625uM

0 0.5 1 1.5

0 200 400 600

Time after incubation (sec)

ERK concentration (uM)

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0 200 400 600

Time after incubation (sec)

ERK concentration (uM)

0 0.1 0.2 0.3 0.4

0 200 400 600

Time after incubation (sec)

ERK concentration (uM)

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

0 200 400 600

Time after incubation (sec)

ERK concentration (uM)

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

0 200 400 600

Time after incubation (sec)

ERK concentration (uM)

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

0 200 400 600

Time after incubation (sec)

ERK concentration (uM)

MEK ERK ^{ン酸化 初速度}

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

生化学的 _>酵素反応速度定数_>MEK in vitro ERK ^ン酸化

MEK ERK ^{ン酸化 初速度}

Linear?

0 0.005 0.01 0.015 0.02

0 0.5 1.0 1.5

GST-ERK [uM] Initial velocity of pY-phosphorylation [uM/sec]

v / [S]

ERK ^{ン ン酸化 初速度}

First-order

kinetics

Zero-order

kinetics

[S] >> K

v = const.

場合 _Fitting 信頼 _Km 求 い

生化学的 _>酵素反応速度定数_>MEK in vitro ERK ^ン酸化

数式的 解釈

 First-order kinetics

[S] << K

Michaelis-Menten ^式

First-order

kinetics

Zero-order

kinetics

[S] >> K

v = const.

v ^∝ [S]

[S] << K

  

  ^S

K

S

E

v k

m cat





   ^{E S}

K

v k

m

~

 Zer-order kinetics

[S] >> K

  ^E

k

v ~

生化学的 _>酵素反応速度定数_>／次近似

線形化し 逐次反応式

= - k

* [ERK]

dt

d[ERK]

dt

d[pY-ERK]

= k

* [ERK] _{– k}

* [pY-ERK]

dt

d[pTpY-ERK]

= k

* [pY-ERK]

pY

ERK

pT pY

pT pY

ERK

ERK

MEK

k

k

 ^{場合 解析解 得}

生化学的 _>酵素反応速度定数_>／次近似 逐次反応

ン

k

= 0.0088 [/sec]

ERK

pY-ERK

pTpY-ERK

Experiments

ERK

pY-ERK

pTpY-ERK

Fitting

k

= 0.016 [/sec]

生化学的 _>酵素反応速度定数_>／次近似 逐次反応

余談：定 し わ

Nick I. Markevich, Jan B. Hoek, and Boris N. Kholodenko. J. Cell Biol. 2004, 164, (3), 353

K

k

K

k

>

<<

々 結果

Kholodenko ^結果

K

k

K

k

生化学的 _>酵素反応速度定数_>余談

In vivo ^＝

ン酸化 い _MEK 脱 ン酸化速度

仮定／： _{in vivo K}

m

^{S 十分大 い}

仮定 ₂ ：脱 ン酸化酵素活性 一定

生化学的 _>酵素反応速度定数>In vivo

Aoki, et al., PNAS, 2011, Supplementary Figure S2

簡便 ： _FRET い

FRET

Linker

CF

P

475 nm

433 nm

433 nm ^{530 nm}

Y F

P

Ligand

Sensor

k

[/M/sec]

K

[M]

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

／分子型＆分子 ＇ _FRET ン

• ^{高感度 画像補正 必要 い 遺伝子 入 簡便}

／分子型 _FRET ン

• ^{開発 最適化 ン}

FRET

Linker

CF

P

475 nm

433 nm

433 nm ^{530 nm}

Y F

P

Ligand

Sensor

／分子型 _FRET ン

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

1. ^{間 距} 2. ^角度

: ^{遷移 ン}

FRET ^{寄与 因子：距 角度}

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

旧 ョン

FRET ^ン

新 ョン

FRET ^ン

戦略 _: 完全 距 依 型 一分子型 _FRET

ン 作製 最適化

(^～5 aa)

: ^{遷移 ン}

距 依 型 ン 開発

Komatsu, et al., MBoC, 2011

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

Sensor

domain

Ligand

domain

SECFP

YPet

Localization

signal

EV linker

Optional

domain

Extension of enhanced visualization by evading extra-FRET

Eevee ^：

• ^{体化し い蛍光 ン 質}

• ^{最適 ン 長}

Komatsu, et al., MBoC, 2011

FRET ^{ン 合理的骨格}

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

FRET _{ン 効率的 開発}

Komatsu, et al., MBoC, 2011

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

ERK PKA JNK

RSK S6K PKC Akt

EGFR

Komatsu, et al., MBoC, 2011

FRET _{ン 効率的 開発}

生化学的 _>酵素反応速度定数_>FRET

FRET ^{在性分子 相関}

Aoki, et al., Mol. Cell, 2013, Supplementary Figure S1

酵素反応： ン 将来展望

• In vitro ^{ン 精製 面倒 in}

vitro ^{条件 ン 質 精製度 依}

In vivo ^{測定 方 生理的}

わ

 FRET ^{改善 網羅的 酵素}

反応速度 測定 現時点 しい

ン酸化 質 分析 絶対定

手法 開発 必要

生化学的 _>酵素反応速度定数

今日 容

• ^ン

• ^{生化学的 定}

– ^{ン 質濃度}

– ^散定数

– ^{解 定数}

– ^{反応速度定数}

• ^{他 定 例}

生化学的 _> 他 定 例

TarckMate Tracking

http://goo.gl/N3OaBW

• Fiji (ImageJ) plugin TrackMate

• ^{日本語 ュ 作 し} ↓

• Tracking

Jaqaman, Nature Methods,

2008 LAP Tracker ^使え

• Split, Merge, Gap close ^対

応

• Tracking ^{結果 CSV, Text 出}

力可能

Tracking

他 定 例

• ^{ば 度合い 比較し い}

• ^{ン 分布}

• ^{振動系＝興奮系＝単 揺 ＝ 知 い}

• ^{細胞運動 定 化し い}

 ^{統計 知識 時系列解析 数理生物 知識}

あ ば定 的 示 多い

 ^{適当 統計 ば自分 定 用}

index ^{作 し う}

使え う 統計

平均 _m ：

標準偏差 _SD ；分散 ^1/2: ば 広

男性： ₆₀ ± _{12 kg,} 女性： ₄₀ ± _{10 kg}

変動係数 _{CV = m /SD}

女性 う 男性 _CV 大 い

生物 多 平均 大 ば標準

偏差 大

ョ 標準偏差；平均 ^1/2

使え う 統計 知識

• ^{変換 自己相関}

– ^{時系列 周期的 信号 定し}

使え

  ^S   ^{f e df}

R _{t  }

  ^{f R}   ^{t e}

^{d t}

S _{ }

ン ン 定理

自己相関

変換

実験 人 ういう 知 い 今 _{Matlab R} 簡単 計算

し 分 ば ＆次 演者 ＇ 聞 ば い

X ^{軸 時間} _t

X ^{軸 周波数} f

細胞運動関係

生化学的 _> 他 定 例

HT-1080 ^細胞

Rac1

FRET

ン

Cdc42

FRET

ン

3.4

2.1

活性

高い

い

Kunida, et al., JCS, 2012

細胞膜伸展速度 定

Kunida, et al., JCS, 2012

自己相関関数 ン抽出

Maeda et al., PLoS One, 2008; Kunida, et al., JCS, 2012

  ^{  } _{ }

^

,

,

, ,

t

x

F

t

t

x

x

F

t

x

t F

x

ACF ^{   }  ^{    }

    ^{x t F x t F}   ^{x t}

F , _ , _ ,

 ^F _{ } ^{x , t}  ^平均値

自己相関関数 ン抽出

ΔTime (min) Oscillatory

1.0

-0.5

0 60

-60 0 100

-100^Δ

Window no. Δ Window no. Δ Window no.

Auto-correlation coefficient Auto-correlation coefficient Auto-correlation coefficient Auto-correlation coefficient Wave-like

1.0

-0.5

0 60

-60 0 100

-100^Δ

Window no.

ΔTime (min)

Non-classifiable

1.0

-0.5

0 60

-60 0 100

-100

ΔTime (min) Directional

1.0

-0.5

0 60

-60 0 100

-100

ΔTime (min)

42% 6% 32% 20%

相互相関関数 相関解析

細胞周囲

膜伸展速度＆

^関数

F(x,t)

^関数 G(x,t+ _t)

細胞周囲

細胞膜 伸展速度

Rac1 ^分子活性

時間＆分＇ 時間＆分＇

  ^{   }

  ^,

  ^,

,

, ,

t

x

G

t

x

F

t

t

x

x

G

t

x

t F

x

CCF







    







    ^{x t F x t F}   ^{x t}

F , _ , _ ,

 ^F _{ } ^{x , t}  ^平均値

相互相関関数 相関解析

細胞周囲

膜伸展速度＆

^関数

F(x,t)

^関数 G(x,t+ _t)

細胞周囲

細胞膜 伸展速度

Rac1 ^分子活性

時間＆分＇ 時間＆分＇

－ ₂ 分 _!

!?

進展

Rac1, Cdc42

活性化

時間遅

t

Rac1, Cdc42

活性化

進展

時間遅

2 ^分

Tsukada et al., PLoS Comput. Biol., 2008; Kunida et al., JCS, 2012

自分 _index

path

migration

total

nt

displaceme

d



Directionality

進

time

path

migration

total

v _ 

Velocity

動い

最 ：困 人 聞

• ^{ン ：笠井 新井 奥 鈴木団}

• ^{細胞生物 生化学：日比 松林 広井 青木}

• ^{発生 生物：藤森 杉村 木村暁 鈴木誉保 澤}

井

• ^{神経：寺前}

• ^{合 生物 , MEMS ：戎家 前多 木村啓志}

• ^{統計 数理生物：大羽 石原 林 高木}

• ^{画像解析： 田 塚田 尾崎}

• ^{ン ： 堂 入江}

• ^{計算 学：舟橋}

し