Wheat bran, hominy feed, soybean hulls, corn gluten feed, rice bran, brewers grains

Others 1 Molasses, calcium carbonate, salt, lactic acid bacteria, brewers yeast, butyric acid bacteria, saccharification bacteria, natural aluminum silicate, light silicic acid, galacto-oligosaccharide, glucose, zeolite, calcium propionate For finishing

beef cattle

Ingredient types Formula feed

types Ingredients

For breeding period chicken

For breeding period pigs

2.2

試

薬

1)

アセトンは残留農薬・

PCB

試験用を用いた．アセトニトリルはカラム処理には残留農薬・

PCB

試験用を用い，標準液及び

LC-MS/MS

溶離液には液体クロマトグラフ用を用いた．酢酸アンモニウムは高速液体クロマトグラフ用（

1 mol/L

溶液，和光純薬工業製）を用いた．水は

Millipore, DIRECT-Q UV 3

（Merck Millipore製）により精製した超純水（JIS K0211の

5218

に定義された超純水）を用いた．

2)

カルバリル標準原液

カルバリル標準品（純度

99.8 %，関東化学製）25 mg

を正確に量って

50 mL

の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線までアセトンを加えてカルバリル標準原液を調製した（この液

1 mL

は，カルバリルとして

0.5 mg

を含有する．）．

3)

カルボフラン標準原液

カルボフラン標準品（純度

99.8 %

，関東化学製）

25 mg

を正確に量って

50 mL

の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線までアセトンを加えてカルボフラン標準原液を調製した（この液

1 mL

は，カルボフランとして

0.5 mg

を含有する．）．

4)

フェノブカルブ標準原液

フェノブカルブ標準品（純度

98.4 %

，関東化学製）

25 mg

を正確に量って

50 mL

の全量フラスコに入れ，アセトンを加えて溶かし，更に標線までアセトンを加えてフェノブカルブ標準原液を調製した（この液

1 mL

は，フェノブカルブとして

0.5 mg

を含有する．）．

5)

混合標準液

各標準原液各

2 mL

を

100 mL

の全量フラスコに入れて混合し，更に標線までアセトンを加えて混合標準原液を調製した（この液

1 mL

は，カルバリル，カルボフラン及びフェノブカルブとして各

10 µg

を含有する．）．

使用に際して，混合標準原液の一定量を，アセトニトリル－水（3+2）で正確に希釈し，1

mL

中にカルバリル，カルボフラン及びフェノブカルブとして各

0.04

，

0.06

，

0.08

，

0.1

，

0.2

，

0.4

，

0.6

，

0.8

，

1

，

2

，

4

，

6

，

8

，

10

，

20

，

40

，

60

，

80

，

100

，

200

，

400

及び

600 ng

を含有する混合標準液を調製した．

2.3

装置及び器具

1)

粉砕機：

粉砕機

1

（乾牧草以外用）：

ZM 200 Retsch

製（

1 mm

スクリーン，使用時回転数

14000 rpm

）

粉砕機

2（乾牧草用）：SM 2000 Retsch

製（1 mmスクリーン，回転数（仕様）835 rpm）

2)

振とう機：MW-DRV 宮本理研工業製（使用時振とう数

300 rpm）

3)

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラム：

InertSep Slim-J C18-B

（充てん剤量

500 mg

）ジーエルサイエンス製にリザーバーを連結したもの

4) LC-MS/MS：

LC

部：ACQUITY UPLC System Waters製

MS/MS

部：

ACQUITY TQ Detector Waters

製

2.4

定量方法

1)

抽出

分析試料

10.0 g

を量って

300 mL

の共栓三角フラスコに入れ，水

20 mL（乾牧草は 30 mL）

を加え，

30

分間静置後，更にアセトン

100 mL

（乾牧草は

120 mL

）を加え，

30

分間振り混ぜて抽出した．

200 mL

の全量フラスコをブフナー漏斗の下に置き，抽出液をろ紙（

5

種

B

）で吸引ろ過した後，先の三角フラスコ及び残さを順次アセトン

50 mL

で洗浄し，同様に吸引ろ過した．更に全量フラスコの標線までアセトンを加えた．この液

2 mL（乾牧草については，

この液の一定量をアセトンで正確に

10

倍希釈した液

2 mL

）を

50 mL

のなす形フラスコに正確に入れ，水

20 mL

を加えて，カラム処理に供する試料溶液とした．

2)

カラム処理

オクタデシルシリル化シリカゲルミニカラムをアセトニトリル

5 mL

及び水

5 mL

で順次洗浄した．試料溶液をミニカラムに入れ，流速

1 mL/min

程度で吸引して液面が充てん剤の上端に達するまで流出させた．更に試料溶液の入っていたなす形フラスコを水－アセトニトリル

（9+1）5 mLずつで

2

回洗浄し，洗液を順次ミニカラムに加え，同様に流出させた．10 mLの全量フラスコをミニカラムの下に置き，アセトニトリル－水（3+2）9 mLをミニカラムに加え，

同様に吸引して各農薬成分を溶出させた．全量フラスコの標線まで同溶媒を加え，この液の一

定量を

5000×g

で

5

分間遠心分離し，上澄み液を

LC-MS/MS

による測定に供する試料溶液とし

た．

3) LC-MS/MS

による測定

試料溶液及び各混合標準液各

5 µL

を

LC-MS/MS

に注入し，選択反応検出（以下「

SRM

」という．）クロマトグラムを得た．測定条件を

Table 2

及び

3

に示した．

Table 2 Operating conditions of LC-MS/MS

Column ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1mm i.d. × 150 mm, 5 μm), Agilent Technologies Mobile phase 2 mmol/L ammonium acetate solution–acetonitrile (4:1)

→ 15 min → (1:9) (hold for 5 min)

Flow rate 0.2 mL/min

Column temperature 40 °C

Ionization Electrospray ionization (ESI)

Mode Positive

Source temperature 120 °C

Desolvation gas N

(650 L/h, 350 °C) Capillary voltage 1 kV

Cone gas N

(50 L/h)

Collision gas Ar (0.20 mL/h)

Table 3 MS/MS parameters

Precursor Cone Collision

ion Quantifier Qualifier voltage energy

(m /z ) (m /z ) (m /z ) (V) (eV)

145 － 22 12

－ 127 22 28

165 － 24 12

－ 123 24 23

95 － 24 16

－ 77 24 36

Product ion Target

Fenobucarb 208

Carbaryl 202

Carbofuran 222

4)

計

算

得られた

SRM

クロマトグラムからピーク面積及び高さを求めて検量線を作成し，試料中のカルバリル，カルボフラン及びフェノブカルブ量を算出した．