• 検索結果がありません。

Analytical procedure for phthalide in rice straw, whole-crop rice silage and paddy rice for feed by GC-MS

ドキュメント内 全体版 (Full version) PDF (ページ 99-102)

2.5 GC-ECD

による測定

2.2

3)

に従い調製した

20 µg/mL

標準液の一定量をヘキサンで正確に希釈し,

1 mL

中にフサ

ライドとして

0.005

0.01

0.025

0.05

0.1

及び

0.25 µg

を含有する各標準液を調製した.各標

準液

1 µL

GC-ECD

に注入し,クロマトグラムを得た.測定条件を

Table 2

に示した.

Table 2 Operating conditions of GC-ECD Column DB-1701 (0.25 mm i.d.×30 m, 0.25 µm film thickness),

Agilent Technologies

Column temperature 70 °C (hold for 2 min) → ramp 20 °C/min → 280 °C (hold for 10 min) Injection mode Splitless (120 s)

Injection port temperature 250 °C

Carrier gas He 1.0 mL/min

Make-up gas N

2

60 mL/min

Detector temperature 300 °C

2.6

カラム処理

I

に係る検討方法

稲わらを用い,

2.4

1)

に従い調製した試料溶液にフサライドとして

65 mg/kg

相当量(最終試

92

飼料研究報告 Vol. 41 (2016)

料溶液中で

0.052 µg/mL

相当濃度)を添加し,水

5 mL

又は飽和塩化ナトリウム溶液

10 mL(直

後の操作で多孔性ケイソウ土カラム(

20 mL

保持用)を用いた場合は

20 mL

)を加えた.この液 を多孔性ケイソウ土カラム(

10 mL

保持用又は

20 mL

保持用)に入れ,

10

分間静置し,以下

2.4

2)以降に従いフサライドを定量した.

2.7 GPC

による精製操作を追加した定量方法

籾米を用い,

2.4

1)

及び

2)

に従い操作して得られたカラム処理

I

の溶出液を

40 °C

以下の水 浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後,窒素ガスを送って乾固した.シクロヘキサン-アセ トン(4+1)10 mL を正確に加えて残留物を溶かし,メンブランフィルターでろ過した.この液

5.0 mL

GPC

に注入し,フサライドが溶出する画分を

200 mL

のなす形フラスコに分取し,

40 °C

以下の水浴でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後,窒素ガスを送って乾固した.なお,

GPC

の条件を

Table 3

に示した.

ヘキサン

2 mL

を加えて残留物を溶かし,2.4の

3)に従い操作した.

Table 3 Operating condition of GPC

Column Shodex CLNpak EV-2000 AC (20 mm i.d.×300 mm, 15 µm), Showa Denko Guard column Shodex CLNpak EV-G AC (20 mm i.d.×100 mm, 15 µm), Showa Denko Eluent Cyclohexane - acetone (4:1)

Flow rate 5 mL/min

Fraction volume 110~135 mL

2.8 GPC

による精製操作の省略の可否に係る検討方法

フサライドとして籾米に

10 mg/kg

相当量(最終試料溶液中で

GPC

による精製を省略した場合

0.1 µg/mL

相当量,省略しない場合は

0.05 µg/mL

相当量)を添加し,2.4 及び

2.7

に従い操作

して得られた試料溶液を

GC-MS

に注入し,回収率を比較した.

3 結果及び考察

3.1 GC-ECD

による検討

2.5

に従い調製したフサライド標準液各

1 µL

GC-ECD

に注入し,得られたクロマトグラム

からフサライドのピーク面積及び高さを用いて検量線を作成した.その結果,

Fig. 2

のとおり,

フサライドは

0.005~0.25 µg/mL(注入量として 0.005~0.25 ng

相当量)の範囲で決定係数

0.99

以 上の直線の検量線が得られたものの,低濃度ではその直線から下に外れる結果となった.この検 量線を用いた場合,低濃度ではフサライドの定量値が低く見積もられることから,筆者らが用い

GC-ECD

による定量は困難であると判断した.

Fig. 2 Calibration curves of phthalide by peak area (left) and peak height (right) for GC-ECD

3.2 GC-MS

による検討

1)

モニターイオンの検討

2.2

3)

に従い調製したフサライド標準液を用いて,本法の測定条件によりスキャンモード

で測定したところ,

Fig. 3

に示すマススペクトルが得られた.この結果から,モニターイオン として

m/z 243

を定量イオンに,m/z 272を確認イオンに設定した.

Fig. 3 Mass spectrum of phthalide standard solution

2)

希釈溶媒の検討

JFRL

法では,希釈溶媒にヘキサンを用いることから,同溶媒を用いて標準液を調製し

GC-MS

に注入したところ,低濃度になるに従いフサライドのピークのテーリングが大きくなり,

良好な検量線を作成することができなかった.

このことを解消するため,ヘキサンに

PEG

0.005 v/v%相当量添加した希釈溶媒を用いて

標準液を調製し

GC-MS

に注入したところ,テーリングが改善され,ピーク形状が良好となっ た.このことから,本法では希釈溶媒として

0.005 v/v%

相当量の

PEG

を添加したヘキサンを 使用することとした.

y = 8189363 x + 107198 R² = 0.9936

0.0E+00 5.0E+05 1.0E+06 1.5E+06 2.0E+06

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Concentraion of phthalide/ [μg/mL]

Pe ak h ei gh t/ a rb . u ni ts

y = 2145207 x + 30365 R² = 0.9934

0.0E+00 1.0E+05 2.0E+05 3.0E+05 4.0E+05 5.0E+05 6.0E+05

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Concentraion of phthalide/ [μg/mL]

Pe ak a re a/ a rb . u ni ts

94

飼料研究報告 Vol. 41 (2016)

参考として,希釈溶媒の違いによるフサライド標準液の

SIM

クロマトグラムを

Fig. 4

に示 した.

Fig. 4 Selected ion monitoring chromatograms of phthalide standard solution (0.05 µg/mL) (Arrows indicate the retention time of phthalide.)

A: Standard solution prepared with hexane

B: Standard solution prepared with 0.005 % PEG-added hexane

3.3

検量線

2.2

3)に従い調製した各フサライド標準液各 2 µL

GC-MS

に注入し,得られた

SIM

クロマ

トグラムからピーク面積及びピーク高さを用いて検量線を作成した.その結果,Fig. 5 のとおり,

ピーク面積の場合,フサライドは

0.002~0.2 µg/mL

(注入量として

0.004~0.4 ng

相当量)の範囲 で直線性を示した.ピーク高さはピーク面積よりも決定係数が悪かったため,ピーク面積で定量 することとした.

Fig. 5 Calibration curves of phthalide by peak area (left) and peak height (right) for GC-MS

3.4

カラム処理

I

に係る検討

JFRL

法では保持容量が

20 mL

InertSep K-solute

を用いているが,供試液量が約

6 mL

である

ことを考慮すると容量が大きいと考えられた.また,

JFRL

法における稲わらでの検討結果が回

-500 1000 2500 4000 5500 7000

10 11 12 13

In te ns ity / a rb . u ni ts

ドキュメント内 全体版 (Full version) PDF (ページ 99-102)