定量下限及び検出下限

本法の定量下限及び検出下限を確認するため，大麦，小麦，稲わら，

WCS

（風乾物）及びア ルファルファ乾草に

GLYP

を添加し，添加回収試験により得られるピークの

SN

比が

10

及び

3

となる濃度を求めた．その結果，SN比が

10

となる濃度は

0.04 mg/kg（乾牧草では 20 mg/kg），

SN

比が

3

となる濃度は

0.01 mg/kg（乾牧草では 6 mg/kg）であった．

同様に，大麦，小麦，とうもろこし，稲わら及び

WCS

（風乾物）に

GLUF

及び

MPPA

を添加 した試料並びに

NAG

を添加した試料について，添加回収試験により得られるピークの

SN

比が

10

及び

3

となる濃度を求めた．その結果，得られたピークの

SN

比が

10

以上となる濃度は

0.05

mg/kg

であった．また，SN比が

3

となる濃度はとうもろこしで

0.02 mg/kg

であった．

以上の結果から，本法の

GLYP

の定量下限は試料（

WCS

は風乾物）中で

0.04 mg/kg

（乾牧草

では

20 mg/kg

），検出下限は試料（

WCS

は風乾物）中で

0.01 mg/kg

（乾牧草では

6 mg/kg

）であ

った．GLUF，MPPA及び

NAG

の定量下限は試料（WCSは風乾物）中でいずれも

0.05 mg/kg，

検出下限は試料（WCSは風乾物）中でいずれも

0.02 mg/kg

であった．

3.8

共同試験

本法の室間再現精度を確認するため，濃度非通知，かつ非明示の

2

点反復で共通試料による共 同試験を実施した．

共通試料としては，大麦に

GLYP

として，20 mg/kg相当量（分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中 に

200 µg

を含有する標準液

1 mL

添加），

GLUF

及び

MPPA

として，それぞれ

0.5 mg/kg

相当量

（それぞれ分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に各

5 µg

を含有する標準液

1 mL

添加），とうもろ こしに

GLYP

として，1 mg/kg相当量（分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に

10 µg

を含有する標

準液

1 mL

添加），GLUF及び

MPPA

として，それぞれ

0.1 mg/kg

相当量（それぞれ分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に各

1 µg

を含有する標準液

1 mL

添加），稲わらに

GLYP

として，

0.2 mg/kg

相当量（分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に

2 µg

を含有する標準液

1 mL

添加），

GLUF

及び

MPPA

として，それぞれ

0.5 mg/kg

相当量（それぞれ分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に各

5 µg

を含有する標準液

1 mL

添加），WCSに原物換算して

GLYP

として，0.2 mg/kg相当量（分

析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に

4.5 µg

を含有する標準液

1 mL

添加），

GLUF

及び

MPPA

とし て，それぞれ

0.5 mg/kg

相当量（それぞれ分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に各

11.25 µg

を含有 する標準液

1 mL

添加），アルファルファ乾草に

GLYP

として，120 mg/kg相当量（分析用試料

10 g

に対して

1 mL

中に

1200 µg

を含有する標準液

1 mL

添加）を，各試験室にて分析開始の前

日に添加して調製した試料を用いた．参加試験室は，協同飼料株式会社研究所，全国農業協同組 合連合会飼料畜産中央研究所，一般財団法人日本食品分析センター多摩研究所，一般財団法人マ

穀類,乾牧草,稲わら及び稲発酵粗飼料中の含リンアミノ酸系農薬の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

85

イコトキシン検査協会，独立行政法人農林水産消費安全技術センター肥飼料安全検査部，同札幌 センター，同仙台センター，同名古屋センター，同神戸センター及び同福岡センター（計

10

試 験室）であった．結果の解析については国際的にハーモナイズされた共同試験に関する手順 ^7)，

8) を参考に，Cochran検定，外れ値

1

個の

Grubbs

検定及び外れ値

2

個の

Grubbs

検定を行い，外 れ値の有無を確認した上で平均回収率，繰返し精度（RSD_r）及び室間再現精度（RSD_R）を算出 し，得られた

RSD

Rから，修正

Horwitz

式⁹⁾を用いて

HorRat

を求めた．

GLYP

の結果は

Table 8

のとおりであり，大麦，とうもろこし，稲わら，

WCS

及びアルファル

ファ乾草について，平均回収率は

75.4，79.7，88.7，81.7

及び

77.9 %，RSD

rは

10，5.1，18，12

及び

10 %，RSD

Rは

22，20，32，23

及び

12 %，HorRat

は

2.0，1.2，1.6，1.1

及び

1.5

であった．

GLUF

の結果は

Table 9

のとおりであり，大麦，とうもろこし，稲わら及び

WCS

について，平

均回収率は

99.3

，

98.3

，

96.8

及び

89.1 %

，

RSD

rは

11

，

8.1

，

6.5

及び

8.0 %

，

RSD

Rは

15

，

21

，

17

及び

15 %，HorRat

は

0.84，0.96，0.93

及び

0.85

であった．

MPPA

の結果は

Table 10

のとおりであり，大麦，とうもろこし，稲わら及び

WCS

について，

平均回収率は

91.1

，

90.5

，

91.1

及び

86.2 %

，

RSD

rは

10

，

13

，

6.3

及び

5.7 %

，

RSD

Rは

14

，

33

，

13

及び

17 %

，

HorRat

は

0.77

，

1.5

，

0.71

及び

0.93

であった．

参考のため，各試験室で使用した

LC-MS/MS

の機種等を

Table 11

に示した．

Table 8 Collaborative study results of GLYP

1 15.2 12.6 0.872 0.854 0.160 0.240 0.163 0.154 97.7 72.0

2 18.9 18.3 0.985 0.984 0.205 0.200 0.219 0.263 114 108

3 15.3 15.2 0.747 0.755 0.181 0.226 0.170 0.156 95.5 84.1

4 19.6 15.7 1.00

^a)

0.740

^a)

0.186 0.245 0.170 0.166 99.1 97.3

5 14.7 12.8 0.564 0.615 0.140 0.149 0.165 0.166 88.0 92.0

6 12.2 9.07 0.548 0.640 0.0906 0.113 0.108 0.159 73.4

^a)

128

^a)

7 8.37 11.6 0.569 0.701 0.0889 0.0571 0.114 0.106 15.0

^b)

13.4

^b)

8 19.1 19.0 0.957 0.989 0.214 0.184 0.133 0.173 87.7 85.2

9 16.5 16.8 0.850 0.867 0.264 0.196 0.180 0.212 85.9 89.2

10 15.6 15.1 0.920 0.930 0.219 0.190 0.150 0.140 88.1 112.0

Spiked level (mg/kg) Mean value

^c)

(mg/kg)

Recovery (%) RSD

rd)

(%) RSD

Re)

(%) PRSD

Rf)

(%) HorRat Laboratory No.

Feed types

2.0 1.2 1.6 1.1 1.5

11 17 21 21 8

22 20 32 23 12

10 5.1 18 12 10

75.4 79.7 88.7 81.7 77.9

15.1 0.797 0.177 0.163 93.5

20 1 0.2 0.2 120

(mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)

Barley Corn Rice straw

Whole-crop rice silage

Alfalfa hay

a) Data excluded by Cochran test b) Data excluded by single Grubbs test

c) Corn: n=18; Barley: n=20 ; Rice straw: n=20; WCS: n=20; Alfalfa hay: n=16 d) Relative standard deviation of repeatability within laboratory

e) Relative standard deviation of reproducibility between laboratories

f) Predicted relative standard deviation of reproducibility between laboratories calculated from the

modified Horwitz equation

Table 9 Collaborative study results of GLUF

1 0.502 0.442 0.100 0.114 0.490 0.553 0.438 0.388

2 0.612 0.583 0.111 0.103 0.546 0.544 0.540 0.614

3 0.583 0.566 0.0875 0.0869 0.438 0.472 0.466 0.473

4 0.536 0.436 0.152 0.132 0.466 0.512 0.467 0.423

5 0.463 0.457 0.0815 0.0834 0.438 0.410 0.438 0.428

6 0.433 0.352 0.0642 0.0688 0.356 0.354 0.402 0.452

7 0.618 0.435 0.0883 0.0911 0.435 0.378 0.346 0.346

8 0.479 0.510 0.105 0.105 0.530 0.447 0.362 0.473

9 0.528 0.545 0.111 0.0868 0.601 0.636 0.507 0.525

10 0.440 0.407 0.0986 0.0963 0.532 0.545 0.406 0.419

Spiked level (mg/kg) Mean value

^c)

(mg/kg)

Recovery (%) RSD

rd)

(%) RSD

Re)

(%) PRSD

Rf)

(%) HorRat

Feed types

0.84 0.96 0.93 0.85

18 22 18 18

15 21 17 15

11 8.1 6.5 8.0

0.496 0.0983 0.484 0.446

99.3 98.3 96.8 89.1

0.5 0.1 0.5 0.5

(mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)

Barley Corn Rice straw Whole-crop rice silage

Laboratory No.

a) n=20

b) Relative standard deviation of repeatability within laboratory c) Relative standard deviation of reproducibility between laboratories

d) Predicted relative standard deviation of reproducibility between laboratories calculated from the

modified Horwitz equation

穀類,乾牧草,稲わら及び稲発酵粗飼料中の含リンアミノ酸系農薬の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

87 Table 10 Collaborative study results of MPPA

1 0.463 0.357 0.105 0.0900 0.390 0.312 0.400 0.421

2 0.581 0.550 0.109 0.101 0.452 0.449 0.574 0.586

3 0.429 0.426 0.0838 0.0849 0.551 0.495 0.393 0.409

4 0.922

^b)

0.579

^b)

2.43

^a)

0.741

^a)

0.529

^b)

0.901

^b)

0.376 0.382

5 0.433 0.477 0.0997 0.0881 0.409 0.434 0.347 0.347

6 0.512 0.377 0.308

^b)

0.414

^b)

0.422 0.420 0.393

^b)

0.547

^b)

7 0.416 0.375 0.0257 0.0354 0.454 0.422 0.443 0.395

8 0.521 0.502 0.107 0.142 0.488 0.481 0.440 0.506

9 0.445 0.482 0.0901 0.105 0.519 0.512 0.456 0.512

10 0.458 0.393 1.93

^a)

2.58

^a)

0.524 0.463 0.393 0.377

Spiked level (mg/kg) Mean value

^c)

(mg/kg)

Recovery (%) RSD

rd)

(%) RSD

Re)

(%) PRSD

Rf)

(%) HorRat

Feed types

0.77 1.5 0.71 0.93

18 22 18 18

14 33 13 17

10 13 6.3 5.7

0.455 0.0905 0.455 0.431

91.1 90.5 91.1 86.2

0.5 0.1 0.5 0.5

(mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) (mg/kg)

Barley Corn Rice straw Whole-crop rice silage

Laboratory No.

a) Data excluded for concern for carry-over of MPPA from standard solution b) Data excluded by Cochran test

c) Corn: n=14; Barley: n=18; Rice straw: n=18; WCS: n=18 d) Relative standard deviation of repeatability within laboratory e) Relative standard deviation of reproducibility between laboratories

f) Predicted relative standard deviation of reproducibility between laboratories calculated from the

modified Horwitz equation

Table 11 Instruments used in the collaborative study LC column (i.d.×length, particle size) LC: ACQUITY UPLC, Waters XBridge C18, Waters

MS/MS: Quattro premier XE, Waters (2.1 mm×150 mm, 5 µm) LC: ACQUITY UPLC, Waters ZORBAX Eclipse XDB-C18, MS/MS: ACQUITY TQD, Waters Agilent Technologies

(2.1 mm×150 mm, 5 µm) LC: ACQUITY UPLC, Waters ZORBAX Eclipse XDB-C18, MS/MS: ACQUITY TQD, Waters Agilent Technologies

(2.1 mm×150 mm, 5 µm) LC: 1200, Agilent Technologies ZORBAX Eclipse XDB-C18, MS/MS: 6410 Triple Quad LC/MS, Agilent Technologies

Agilent Technologies (2.1 mm×150 mm, 5 µm)

LC: Shimadzu LC-20AD Mightysil RP-18 GP, Kanto Chemical MS/MS: API-3200 Q TRAP, AB Sciex (2.0 mm×150 mm, 5 µm)

LC: ACQUITY UPLC, Waters ACQUITY UPLC BEH C18, Waters MS/MS: ACQUITY TQD, Waters (2.1 mm×150 mm, 1.7 µm) LC: UFLC XR, Shimadzu Inertsil ODS-SP, GL Sciences MS/MS: TSQ Quantam Ultra , (2.1 mm×150 mm, 5 µm)

Thermo Scientific

LC: LC-30AD, Shimadzu ZORBAX Eclipse XDB-C18, MS/MS: LCMS-8040, Shimadzu Agilent Technologies

(2.1 mm×150 mm, 3.5 µm) LC: ACQUITY UPLC, Waters ZORBAX Eclipse XDB-C18, MS/MS: ACQUITY TQD, Waters Agilent Technologies

(2.1 mm×150 mm, 5 µm) LC: ACQUITY UPLC, Waters ZORBAX Eclipse XDB-C18, MS/MS: ACQUITY TQD, Waters Agilent Technologies

(2.1 mm×150 mm, 5 µm) 8

9

10 5 6 7 2

3

4

Lab. No. LC-MS/MS

1

4 まとめ

穀類，乾牧草，稲わら及び

WCS

中の

GLYP，GLUF，MPPA

及び

NAG

の同時定量法として

GLYP

法の適用の可否について検討したところ，以下の結果が得られ，穀類，稲わら及び

WCS

は 適用が可能であると考えられた．また，乾牧草については，

GLYP

法により抽出した後，遠心分離 した試料溶液に希釈操作を追加することで以下の結果が得られ

GLYP

の単成分分析法としての適 用が可能であると考えられた．

1) GLYP

，

GLUF

及び

MPPA

の各検量線は，

0.3~300 ng/mL

相当量（注入量として

0.0015~1.5 ng

相当量）の範囲で直線性を示した．

なお，当該検量線における各マトリックスの添加回収試験の設定濃度は，GLYP においては，

大麦で

200

及び

0.4 ng/mL

相当濃度，小麦で

50

及び

5 ng/mL

相当濃度，とうもろこしで

10

及び

1 ng/mL

相当濃度，稲わらで

2

及び

0.4 ng/mL

相当濃度，

WCS

で

4.5

及び

0.9 ng/mL

相当濃度，

穀類,乾牧草,稲わら及び稲発酵粗飼料中の含リンアミノ酸系農薬の液体クロマトグラフタンデム型質量分析計による同時定量法

89

アルファルファ乾草で

2.4

及び

0.4 ng/mL

相当濃度とした．GLUF 及び

MPPA

においては，大麦 でそれぞれ

5

及び

0.5 ng/mL

相当濃度，小麦でそれぞれ

2

及び

0.5 ng/mL

相当濃度，とうもろこ しでそれぞれ

1

及び

0.5 ng/mL

相当濃度，稲わらでそれぞれ

5

及び

0.5 ng/mL

相当濃度，

WCS

で

それぞれ

11.25

及び

1.125 ng/mL

相当濃度とした．NAG においては，GLUF として大麦で

4.440

及び

0.444 ng/mL

相当濃度，小麦でそれぞれ

1.78

及び

0.444 ng/mL

相当濃度，とうもろこしでそ

れぞれ

0.888

及び

0.444 ng/mL

相当濃度，稲わらでそれぞれ

4.44

及び

0.444 ng/mL

相当濃度，

WCS

でそれぞれ

9.99

及び

0.999 ng/mL

相当濃度とした．

2) 乾牧草については，GLYP

法に対して希釈操作を追加したところ，分析対象成分が

GLYP

のみ

であれば良好な結果が得られ適用が可能であると考えられた．一方，GLUF，MPPA 及び

NAG

は本法の適用除外とすることにした．また，籾米については，全ての分析対象成分が本法への適 用が困難であったことから，適用除外とすることにした．

3) 本法に従い得られる試料溶液についてマトリックス効果を確認した結果，GLYP，GLUF

及び

MPPA

は試料マトリックスによる大きな影響を受けることなく測定可能であった．

4)

本法に従って得られた選択反応検出クロマトグラムでは，

14

種類の飼料原料において定量を 妨げるピークは認められなかった．

5) 大麦，小麦，とうもろこし，稲わら，WCS

及びアルファルファ乾草に

GLYP

としてそれぞれ

異なる

2

種類の濃度を添加した試料を用いて，本法により

3

点併行で定量し，回収率及び繰返し 精度を検討したところ良好な結果が得られた．

6)

大麦，小麦，とうもろこし，稲わら及び

WCS

に

GLUF

，

MPPA

及び

NAG

としてそれぞれ異な る

2

種類の濃度を添加した試料を用いて，本法により

3

点併行で定量し，回収率及び繰返し精度 を検討したところ良好な結果が得られた．

7)

本法による

GLYP

の定量下限は試料中で

0.04 mg/kg

（乾牧草では

20 mg/kg

），検出下限は

0.01

mg/kg

（乾牧草では

6 mg/kg

）であった．本法による

GLUF

，

MPPA

及び

NAG

の定量下限は，い

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